一种荧光假单胞菌y13及制备方法和应用的制作方法[0002]磷是植物生长不可缺少的元素之一。但是，土壤中大部分的磷与Ca2+、Fe3+、Fe2+、 Al3+等阳离子结合，以难溶性的金属螯合物形式存在，导致绝大多数土壤中有效磷匮乏。我国有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷不能被生物直接吸收利用。即便在施入磷肥的当季，作物的磷利用率也只有大约5%-25%(黄伟，2006)。与此同时，为了提高农业产量，大量磷肥被施入土壤中，其中被作物吸收的仅占很少一部分，大量磷肥被转化为土壤中的金属螯合态；一部分甚至在雨水清洗下流入净水和表层水体，造成水体污染。因此，如何提高土壤中磷的生物利用率，有效促进农作物对土壤中磷的有效利用，降低农业生产中磷肥的使用，降低种植成本，减少由于农用磷肥的过量施用所导致的环境污染，是事关农业生产和农业可持续性发展的重要课题。[0003]植物根际微生物与土壤中磷的存在状态有显著的关联。根际微生物能够分泌一些低分子量的有机酸，将土壤中的难溶金属螯合状态的磷转化为植物可以吸收利用的可溶性磷，供植物吸收利用，这些微生物被称为溶磷菌。目前报道的溶磷菌包括青霉菌、肠杆菌、 枯草芽孢杆菌、沙雷氏菌EB67和假单胞菌CDB35等。溶磷菌的施用能够促进植物生长，部分溶磷菌还具有生防能力，能够抑制部分作物病原菌，增加作物的抗病能力。据不完全统计，目前全世界各地共筛选出30属89种溶磷微生物，其中真菌27个种，细菌58个种，放线菌 4 个种(范丙全,2001 ；Loganathan, 2003 ；Peix, 2004 ；Longanathan2004 ；Rivas, 2006 ； Son,2006)。[0004]利用溶磷微生物可提高土壤中可溶性磷的含量，能够显著促进植物磷元素的吸收利用，使农作物高产丰产。刘荣吕等(1993)把分离到的欧文氏菌(Erwina)解磷细菌制成微生物菌剂接入土壤后，小麦增产10.4%，绿豆增产23.8%。Chabot (1996)等人发现，施加溶磷菌能促进西红柿、洋葱、马铃薯、香蕉、柑橘及咖啡的产量。[0005]溶磷菌菌种资源是解磷微生物肥料的核心和关键。本发明从环境土壤中筛选到一株具有高效溶磷能力的突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Y13,并对其解磷能力进行了测定，以该溶磷菌制备的微生物菌剂具有很好的土壤溶磷效果，是一种潜在的微生物肥料生产菌。
[0006]本发明的目的是在于提供了一种具有溶解有机磷能力的溶磷菌——荧光假单胞菌Y13，它从三峡消落带土壤中分离，能够将植物难以吸收利用的难溶性有机磷转化为植物可以吸收利用的可溶性磷，从而促进植物生长和提高产量。[0007]本发明的另一个目的在于提供了一种荧光假单胞菌Y13的制备方法，该菌株在实验室条件下能够溶解有机磷，释放其中的磷元素；同时，该菌株能够有效释放实际土壤中有机磷的磷元素，显示了本发明所提供的菌株在土壤溶磷解磷、改善农作物磷素营养方面的运用。该菌制备方法简便快捷。[0008]本发明的再一个目的在于提供了一种荧光假单胞菌Y13在溶解土壤难溶磷、提高有效磷含量、改善植物磷素营养中的应用，该菌株能够有效释放土壤有机磷的磷元素，显示了本发明所提供的菌株能有效促进土壤中磷的释放，增强农作物对土壤中磷的有效利用， 提高了土壤中磷的生物利用率，减少了农业生产中磷肥的使用，降低了种植成本，能有效缓解由于农用磷肥的过量施用所导致的环境污染问题。[0009]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施:[0010]一种荧光假单胞菌Y13的制备方法，其步骤是:
[0011]A、称取5g 土样于90mL灭菌生理盐水中，于28°C恒温摇床上150r/min振荡30min, 静置lmin。
[0012]B、取上清液5mL到蒙金娜有机磷液体培养基中(葡萄糖10.00g, (NH4)2SO40.50g， MgSO4 ? 7H20 0.30g, NaCl 0.30g, KCl 0.30g, FeSO4 ? 7H20 0.03g, MnSO4 ? 4H20 0.03g, CaC035.0Og,卵磷脂 2.0Og,蒸馏水 1000ML, PH7.0 -7.2)。
[0013]C、28°C恒温摇床上150r/min，培养3天；然后以1:100体积比接种到新鲜有机磷液体培养基中，继续培养3天，取ImL菌液进行10倍系列稀释；
[0014]D、然后将100 UL不同稀释倍数的稀释液涂布在有机磷固体平板上(即在液体培养基中加入15g/L琼脂),倒置于28°C恒温培养箱中培养5d。
[0015]E、将得到的单菌落在有机磷固体平板上进一步地划线分离纯化。经多次分离筛选后，将分离到的纯培养在LB斜面上保存备用。
[0016]通过上述步骤获得了荧光假单胞菌Y13， 申请人:于2012年4月20日将该菌株送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，地址:中国武汉武汉大学保藏编号=CCTCC NO: M2012121,分类命名:突光假单胞菌 Y13Pseudomonas f lorescens Y13。
[0017]溶磷菌Y13的特性:
[0018]①生物学特性:菌株呈短杆状，革兰氏阴性菌(图1)，无芽孢，专性需氧，最适生长温度20°C-28°C。
[0019]②遗传学特性:结合形态学观察和分子生物学鉴定确认该菌为荧光假单胞菌。
[0020]③培养条件:荧光假单胞菌Y13菌株保存采用LB培养基；测试其对有机磷的溶磷效果采用有机磷液体培养基:葡萄糖10.00g, (NH4)2SO40.50g, MgSO4 ? IW2Q 0.30g, NaCl 0.30g, KC10.30g, FeSO4 ? 7H20 0.03g, MnSO4 ? 4H20 0.03g, CaC035.0Og,卵磷脂 2.0Og,蒸馏水 IOOOmL,琼脂 15-18g/L, PH7.0-7.2。121 °C高压蒸汽灭菌 30min。并进行 28°C，180r/min 摇瓶培养。制备固体培养基以鸡蛋黄稀释液代替。鸡蛋黄稀释液制备方法:用酒精擦净新鲜鸡蛋外壳，取蛋黄，约加5mL等量的无菌生理菌水，混匀。将蒙金娜基础培养基融化冷却至50°C后，立即加入卵黄液。每IOOmL的基础培养基加5mL卵黄稀释液作为有机磷源，混匀后分装于培养皿内凝成平板(李繁，2006)。图2为Y13在LB培养基中的生长曲线，菌株培养3h后进入对数生长期，28h后进入稳定期。
[0021]④功能特性:将Y13菌株点种到有机磷固体培养基上，28°C培养，测定溶磷菌Y13溶解有机磷的能力。荧光假单胞菌Y13能将固体平板中的卵磷脂大分子分解为脂肪和磷酸，形成清晰的水解圈。溶磷菌的溶磷能力用菌落(d)和溶磷圈(D)的直径的比值，即D/d 值评价。随着培养时间的增加，D/d增加，6天后其值为4.03。将Y13菌株接种到装有IOOmL 有机磷液体培养基的三角瓶中，其中卵磷脂的浓度为2.0g/L，对照处理接入等量的无菌水。 震荡培养5天后，将培养物转移至无菌的50mL的离心管中，进行超声波破碎(200w，20min), 4000r/min离心20min,取上清5mL,用钥铺抗比法测可溶性磷的含量(张祥胜,2008),结果表明添加溶磷菌的测试体系中可溶性磷的含量为135.4mgL。
[0022]一种荧光假单胞菌Y13在溶解土壤难溶磷、提高有效磷含量、改善植物磷素营养中的应用，其应用过程如下:
[0023]①微生物菌剂的制备:
[0024]1)将保存在LB斜面上的一种荧光假单胞菌Y13菌株接种新鲜LB斜面，28°C活化过夜；
[0025]2)接种到LB液体培养基中，28°C，180r/min过夜培养。
[0026]3)然后以1:100的比例接种到新鲜培养基中，继续培养到菌体浓度达到IO7— 108cfu/mL 为止。
[0027]4)取IOOg草炭到三角瓶中，120°C, 30min,高温灭菌。
[0028]5)加入IOmL菌液到IOOg灭菌草炭中，均匀混合。菌剂的含水量达到手攥成团，一碰即散的程度。
[0029]6)将混合好的菌剂放置28°C培养箱培养到草炭中的菌量达到Kf-KTcfu/g。即为微生物菌剂。
[0030]②微生物菌剂对土壤有机磷的溶磷效果:
[0031]采用基于一种荧光假单胞菌Y13菌株的微生物菌剂，测试其对添加卵磷脂后的实际土壤的溶磷效果。土壤取自华中农业大学狮子山(其它地方也可以)。
[0032]1)按5.0g:1OOOg (卵磷脂:土)的比例，在土壤样品中加入卵磷脂，混匀。
[0033]2) 一共分为四个处理方式:1)灭菌土(对照组I) ；2)非灭菌土(对照组2) ；3)非灭菌土 +微生物菌剂；4)灭菌土 +微生物菌剂。每个处理设有3个重复。
[0034]3)每500克含卵磷脂的土样中加入10克微生物菌剂，混匀后置于盆中，室温放置。 对照组加入10克灭菌草炭。
[0035]4)分别于处理7天、14天、21天定时取样分析该菌株的溶磷效果。
[0036]5)如图3所示，施加微生物菌剂七天后，土壤中可溶性磷的含量增加到380g/kg。
[0037]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0038](1)微生物制剂易获取，成本低廉。
[0039](2)利用Y13微生物菌剂可提高土壤中可溶性磷的含量，能够显著促进植物磷元素的吸收利用，使农作物高产丰产，是一种很有市场前景的微生物肥料生产菌，具备商业化应用的潜力。
[0040](3)利用Y13微生物菌剂，能降低农业生产中磷肥的使用，减少种植成本和农业投入，缓解由于农用磷肥的过量施用所导致的环境污染。



[0042]图2为一种荧光假单胞菌Y13菌株革兰氏染色结果示意图。
[0043]图3为一种荧光假单胞菌Y13菌剂对土壤中卵磷脂的溶磷能力测试示意图。
[0044]横坐标表示培养时间(d)，纵坐标表示可溶性磷的含量(单位:mg/l)。

[0045]以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
[0046]实施例1: 一种荧光假单胞菌Y13的制备方法及溶磷能力的检测
[0047]1、菌株分离:
[0048]A、称取5g土样于90mL无菌生理盐水中，于28°C恒温摇床上180r/min振荡30min, 静置lmin。
[0049]B、取上清液5mL到蒙金娜有机磷液体培养基中(葡萄糖10.00g, (NH4) 2S040.50g， MgSO4 ? 7H20 0.30g, NaCl 0.30g, KCl 0.30g, FeSO4 ? 7H20 0.03g, MnSO4 ? 4H20 0.03g, CaC035.0Og,卵磷脂 2.0Og,蒸馏水 1000ML，PH7.0-7.2)。
[0050]C、28°C恒温摇床上180r/min，培养3天。
[0051 ] D、以1:100比例接种到新鲜有机磷液体培养基中，继续培养3天，取ImL菌液进行 10倍系列梯度稀释。
[0052]Ejf 100 U L不同稀释倍数的稀释液(10—1，10_2，10_3，10_4，10_5)分别涂布在有机磷固体平板上，制备固体培养基以鸡蛋黄稀释液代替卵磷脂。
[0053]F、鸡蛋黄稀释液制备:用酒精擦净新鲜鸡蛋外壳，取蛋黄，约加5mL等量的无菌生理菌水，混匀。将蒙金娜基础培养基融化冷却至50°C后，立即加入卵黄液。每IOOmL的基础培养基加5mL卵黄稀释液作为有机磷源，混匀后分装于培养皿内凝成平板(李繁，2006)。 液体培养基中加入15g/L琼脂,倒置于28°C恒温培养箱中培养5d。
[0054]F、将平板上长出的单菌落在上述有机磷平板上进一步地划线分离纯化。经多次分离筛选后，将分离到的纯培养在LB斜面上保存备用。
[0055] 申请人:将上述分离得到的菌株命名为Y13，经鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。 申请人:于2012年4月20日将该菌株送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC) 保藏，其保藏编号为:CCTCC NO:M2012121。
[0056]2、菌株的生物学特性:
[0057]①生物学特性:荧光假单胞菌Y13为杆状的革兰氏阴性细菌(图1);最适生长温度 28。。。
[0058]②遗传学特性:荧光假单胞菌Y13菌株的16S rDNA序列见SEQ ID NOl，序列分析结果表明:Y13与突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的16S rDNA序列相似性达 100% ;结合形态学观察，确认该菌株为荧光假单胞菌。
[0059]③培养条件:荧光假单胞菌Y13菌株保存采用LB培养基；测试其对有机磷的溶磷效果采用有机磷液体培养基:葡萄糖10.00g, (NH4)2SO40.50g, MgSO4 ? IW2Q 0.30g, NaCl0.30g, KC10.30g, FeSO4 ? 7H20 0.03g, MnSO4 ? 4H20 0.03g, CaC035.0Og,卵磷脂 2.0Og,蒸馏水lOOOmL，琼脂15-18gL，PH7.0-7.2。121°C高压蒸汽灭菌30min。制备固体培养基以鸡蛋黄稀释液代替。鸡蛋黄稀释液制备方法:用酒精擦净新鲜鸡蛋外壳，取蛋黄，约加5mL等量的无菌生理菌水，混匀。将蒙金娜基础培养基融化后冷却至50°C后，立即加入卵黄液。每 IOOmL的基础培养基加5mL卵黄稀释液作为有机磷源，混匀后分装于培养皿内凝成平板(李繁，2006)。图2为Yl3在LB培养基中的生长曲线，菌株培养3h后进入对数生长期，28h后进入稳定期。
[0060]3、一种荧光假单胞菌Y13的溶磷能力测试:
[0061]I)溶磷圈的测定:
[0062]将一种荧光假单胞菌Y13点种到有机磷固体培养基上，28°C培养，测定溶磷菌Y13 溶解有机磷的能力。溶磷菌的溶磷能力用菌落(d)和溶磷圈(D)的直径的比值，即D/d值评价。随着培养时间的增加，Y13将固体平板中的卵磷脂大分子分解为脂肪和磷酸，形成清晰的水解圈。
[0063]表I为点种溶磷菌Y13后2、4、6天的D/d值。