在含油酵母中通过提高yap1转录因子活性提高油含量的制作方法[0001]本专利申请要求2010年12月30日提交的美国临时申请61/428，655的权益，该临时申请全文以引用方式并入本文。【技术领域】。更具体地，本发明涉及包含提高的Yapl转录因子活性而引起提高的油含量的含油酵母菌株。[0003]反应性氧物质[“R0S”]是包含氧并且包含未配对的价电子层电子的化学反应性分子。R0S，例如羟基自由基、超氧阴离子、和过氧化氢[“H202”]，作为有氧代谢的副产物在细胞中持续地产生，例如，通过呼吸作用过程中氧至水的不完全还原。ROS还通过暴露于辐射、光照、金属、和氧化还原活性药物而在脂肪酸的(6-氧化过程中产生。由于ROS可扰乱细胞的氧化还原状态并最终导致对细胞组分(包括脂质、蛋白质、和DNA)的毒性损伤，细胞必须具有多种方法来感测ROS水平和转换该信号，使得细胞防止氧化胁迫的效应和维持细胞的完整性。[0004]通常，ROS的水平通过使用谷胱甘肽还原-氧化(氧还)循环和硫氧还蛋白体系而被控制，使得从NADPH接受电子并用于将H2O2还原为水。更具体地，电子从NADPH至硫氧还蛋白还原酶至硫氧还蛋白至抗氧化蛋白至H2O2地传递，产生水。该途径中的多种基因的调控是复杂的。在酵母啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中对H2O2的适应性响应已被发现涉及至少167种蛋白质的表达的改变(Godon, C.等人，J.Biol.Chem.,.273:22480-22489 (1998))。[0005]酵母啤酒糖酵母中感测H2O2水平的一种方式依赖基于氧化应激反应的主要转录因子(即，转录因子蛋白质Yapl)的信号途径。响应于H2O2胁迫，基于至少一种分子内二硫键的形成(由抗氧化蛋白如Tsal和Gpx3催化并被其它蛋白质如Ybpl促进的反应),在Yapl中发生多步骤的构象变化。以这种活性的氧化形式，Yapl控制至少32种不同蛋白质(包括参与细胞抗氧化防御和谷胱甘肽/NADPH再生的那些)的大的调节子的表达(Lee，J.等人，J.Biol.Chem.，274:16040-16046( 1999))。Yapl的钝化通过用Yapl-控制的硫氧还蛋白的酶还原发生，从而提供了自调控机制。缺少功能性Yapl蛋白质的啤酒糖酵母突变菌株对通过H2O2的杀灭是高度敏感的。[0006]已知具有更多双键的脂肪酸是更易受脂质过氧化作用影响的。因此，多不饱和脂肪酸[“PUFA”]是更易受通过ROS的氧化降解作用影响的，因为它们在其间包含多个位于具有尤其反应性的氢的亚甲基-CH2-基团的双键。Avery，A.M.和S.V.Avery (J.Biol.Chem.，276:33730-33735 (2001))报道了啤酒糖酵母 gpxl A /gpx2 A /gpx3 A 突变体对于在补充了 PUFAa-亚麻酸[“ALA”；18:3]的培养基中生长是缺陷型的，其中ALA能够占总的膜脂肪酸的至多60% ；gpxl A、gpx2 A和gpx3 A突变体还展示了对于18:3的毒性,尽管该效应基于外源18:3向膜脂质内较缓慢的掺入速率而被延迟。[0007]由于ROS在进行有氧代谢的细胞中持续地产生，并且由于ROS能够导致细胞的损伤和死亡，本领域的技术人员将会知道提高重组地工程化的生物防御ROS的能力的方法。在产生微生物油的那些生物中尤其如此，因为在某些微生物菌株中，在产生这些油的过程中，ROS的产生能够导致微生物油生产中的较低的产量和/或降低的效率。[0008]已经发现，工程化改造含油酵母以具有提高的Yapl转录因子活性和产生PUFA，导致了提高的脂质含量[“TFA%DCW”]和提高的平均PUFA滴度[“PUFA%DCW”]。


[0009]在一个实施例中，本发明涉及具有提高的油含量的转基因含油酵母，其包含提高的Yapl转录因子活性，其中所述提高的油含量是与非转基因含油酵母细胞的油含量相比的。
[0010]在第二个实施例中，所述提高的Yapl转录因子活性是由过表达Yapl转录因子、通过提高所述转录因子和能够激活所述转录因子的蛋白质之间的相互作用、或通过它们的组合引起的。
[0011]在第三个实施例中，所述能够激活所述转录因子的蛋白质选自:Gpx3、Ybpl和Tsal ο
[0012]在第四个实施例中，所述Yapl转录因子包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有转录因子活性并且包含:(a)bZIP亮氨酸拉链基序；(b)N_末端富含半胱氨酸的结构域，其包含至少两个由至少6个氨基酸隔开的半胱氨酸残基的序列；和((3) C-末端富含半胱氨酸的结构域，其包含至少两个由至少8个氨基酸隔开的半胱氨酸残基的序列。
[0013]在第五个实施例中，所述Gpx3蛋白质包含:(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yapl转录因子相互作用以提高Yapl转录因子活性，其中基于BLASTP比对方法，所述多肽在与选自SEQ ID N0:26[ScGpx3]或SEQ ID N0:28[YlGpx3]的序列进行比较时具有至少70%的氨基酸同一性；(b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yapl转录因子相互作用以提高Yapl转录因子活性，其中基于BLASTN比对方法，所述核苷酸序列在与选自SEQ ID N0:25[ScGpx3]或SEQ ID NO:27[YlGpx3]的序列进行比较时具有至少70%的序列同一性JP(C) (a)或(b)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。
[0014]在第六个实施例中，所述Tsal蛋白质包含:(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yapl转录因子相互作用以提高Yapl转录因子活性，其中基于BLASTP比对方法，所述多肽在与选自SEQ ID N0:34[ScTsal]或SEQ ID NO:36[YlTsal]的序列进行比较时具有至少70%的氨基酸同一性；(b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yapl转录因子相互作用以提高Yapl转录因子活性，其中基于BLASTN比对方法，
[0015]所述核苷酸序列在与选自SEQ ID N0:33[ScTsal]或SEQ ID NO: 35 [YlTsal]的序列进行比较时具有至少70%的序列同一性；和((3) (a)或(b)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。
[0016]在第七个实施例中，所述Ybpl蛋白质包含:(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yapl转录因子相互作用以提高Yapl转录因子活性，其中所述多肽选自SEQ IDNO: 38 [ScYbpI]或SEQ ID NO:40 [YlYbpI] ; (b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yapl转录因子相互作用以提高Yapl转录因子活性，其中基于保守结构域分析方法，将所述多肽序列分类在kinetOChor_Ybp2超家族内；或(0) (a)或(b)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。
[0017]在第八个实施例中，所述转基因含油酵母细胞来自选自下列的属:耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝抱酵母属(Trichosporon)和油月旨酵母属(Lipomyces)。优选地，所述转基因含油酵母细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
[0018]在第九个实施例中，所述转基因含油酵母细胞产生至少一种多不饱和脂肪酸。
[0019]在第十个实施例中，本发明涉及提高含油酵母中油含量的方法，其包括:
[0020]a)工程化所述含油酵母以过表达选自下列的蛋白质:
[0021](i) Yapl 转录因子；
[0022](ii)能够激活所述转录因子的蛋白质；
[0023](iii) (a)和(b)的组合；以及
[0024]b)使所述含油酵母在适宜的条件下生长以产生与非转基因含油酵母的油含量相比提高的油含量。
[0025]


[0026]图1是啤酒糖酵母GPX3[ “ScGPX3”]通过其激活啤酒糖酵母YAPl [ “ScYapl”]的机制的图。ScGPX3包含Cys36和Cys82，它们形成分子间二硫键(_S_S_)或被还原为包含硫醇基(-SH)。ScYapl包含N-末端和C-末端富含半胱氨酸的结构域(各自以黑色显示)；这些富含半胱氨酸的结构域中的Cys303、Cys310和Cys315和Cys598、Cys620和Cys629被显示为6条垂直的黑色线。Cys36ScGpx3的硫醇基(_SH)与H2O2反应，导致水的释放和磺酸(-S0H)的形成。然后-SOH与ScYapl (还原形式)的Cys598的-SH缩合，形成分子间二硫键(-S-S-)，然后其被转换为ScYapl的Cys303和Cys598之间的分子内二硫键，从而产生氧化的ScYapl蛋白质中的构象变化。
[0027]图2 是 ScYAPl (SEQ ID N0:2)和 YlYAPl (SEQ ID NO:4)之间的序列比较。在ScYAPl的位点69-115(对应于YlYAPl的位点115-166)的带下划线的、粗体的碱性氨基酸，表示用于DNA结合的bZIP结构域的碱性区域。在ScYAPl的位点87、94、108、和115 (对应于YlYAPl的位点138、145、159、和166)，在比对中以星号显示的粗体的亮氨酸残基，是bZIP结构域的亮氨酸拉链基序。在ScYAPl的位点303、310、315、598、620和629(对应于YlYAPl的位点309、316、483、505和514)的带框线的半胱氨酸残基，对于分子间和分子内相互作用是重要的(或很可能重要的)。
[0028]图3提供了下列质粒的质粒图谱:(A) pYRH60 ;和(B) pYRH61。
[0029]图4显示了在提高的H2O2浓度(即，从OmM至50mM H2O2)下，在YPD平板上的H2O2敏感度检测结果。(A)比较了解脂耶氏酵母菌株Y4184 (对照)和Y4184U (yaplA)细胞的生长。(B)比较了用pRS316 (对照)或PYRH61转化的啤酒糖酵母菌株BY4743 (对照)和BY4743 (yaplA )细胞的生长。
[0030]图5提供了下列质粒的质粒图谱:(A) pYRH43 ;和(B) pYRH65。
[0031]图6 是 ScGPX3 (SEQ ID NO:26)和 Y1GPX3 (SEQ ID NO:28)之间的序列比较。在ScGpx3的位点36、64和82(对应于YlGpx3的位点42、70和88)的带框线的半胱氨酸残基，对于分子间和分子内相互作用是重要的(或很可能重要的)。[0032]图7 是 ScTsal (SEQ ID NO:34)和 YlTsal (SEQ ID N0:36)之间的序列比较。在ScTsal的位点48和171 (对应于YlTsal的位点48和169)的带框线的半胱氨酸残基，对于分子间和分子内相互作用是重要的(或很可能重要的)。
[0033]图8 是 ScYbpl (SEQ ID NO:38)和 YlYbpl (SEQ ID NO:40)之间的序列比较。
[0034]图9 是 ScYbpl (SEQ ID N0:38)、YlYbpl (SEQ ID N0:40)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)Ybpl [ “CgYbpl，，] (SEQ ID NO:43)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)NRRL Y-1140 Ybp I [ “KlYbpl”] (SEQ ID N0:44)、木糖发酵酵母(Scheffersomycesstipitis) CBS6054Ybpl [ “SsYbpl”] (SEQ ID NO:45)> 鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii) CBS732Ybpl[ “ZrYbpl”] (SEQ ID N0:46)、和白假丝酵母(Candida albicans)SC5314Ybpl[ “CaYbpl”] (SEQ ID NO:47)之间的序列比较。
[0035]下面的序列遵循37C.F.R.§ § 1.821-1.825 (“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则” (“Requirements for Patent ApplicationsContaining Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-theSequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual PropertyOrganization) (WIPO)ST.25 标准(1998)以及 EPO 和 PCT 的序列表要求(规则 5.2 和 49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§ 1.822所示的规定。
[0036]SEQ ID NO:1至47是表1中鉴定的ORF编码基因、蛋白质(或它们的部分)、引物或质粒。
`[0037]表1:核酸和蛋白质序列号简述
[0038]