专利名称：用于抗腹泻和减轻胃肠病症的保济丸活性化合物的制作方法调节氯离子跨越上皮细胞流量是保持机体内电解质和液体动态平衡的关键。异常的氯(Cl-)离子流量导致若干不同的病理生理学症状，包括囊性纤维变性，多囊肾疾病等。最普遍的疾病之一是腹泻，特别是传染性的分泌腹泻，其中，霍乱菌毒素或炎症引起的过度的前列腺素分泌使氯化物和水分泌上调。在所有使人类产生腹泻的肠道病原体当中，霍乱毒素通过永久地活化腺苷酸环化酶和cAMP刺激氯离子和液体分泌，导致最迅速的致命症状。根据世界卫生组织(WHO)的报告，腹泻是世界上导致死亡的主要原因之一，特别是在食物和水普遍受到细菌污染的发展中国家。这个问题在儿童和婴幼儿中尤其严重，每年有超过五百万年龄不足5岁的儿童死于营养不良、腹泻和脱水。大部分现用的止泻药作为逆蠕动药物抑制胃的运动和蠕动，而有些则是吸附剂和抗菌剂。其中没有一种药物可抑制电解质和液体分泌，这在许多严重的情形中是导致腹泻的原因。逆蠕动药物可能引起中枢神经系统副作用，以及不需要的胃肠道影响，包括恶心，呕吐和腹部不适。此外，尽管相当多的传统中药提供了治疗腹泻的选择，但是它们的活性成分通常不确定而且它们的作用机理不清楚。因此，有必要在本领域探寻一种可特异调节氯化物和水分泌的具有已知活性成分的治疗药物。本发明填补了此空白并满足了其它需要。发明概要本发明一方面提供了治疗由异常氯离子流量所引起的医学症状的方法，该方法包括对患者使用治疗有效量的药物组合物以及生理学可接受的载体。所述药物组合物包括选自木兰醇(又称厚朴酚)，和厚朴酚，白茅苷，和异英波拉托林中的任何一种、或任意两种或多种的组合，以及生理学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述患者是人类。在一个实施方案中，医学症状由氯离子和水分泌增加所引起，如某些胃肠道疾病。这些疾病可以是由病毒、细菌(例如，霍乱毒素)，神经内分泌肿瘤，寄生虫，或HIV所引起的腹泻。该方法还可以用来治疗由氯离子和水分泌增加所引起的其它症状，包括但不限于多囊肾疾病和炎症性肠病。在另一实施方案中，病症由氯离子和水分泌降低所引起，如某些胃肠道疾病(例如，便秘)和囊性纤维变性。另一方面，本发明提供治疗由异常的氯离子流量所引起的医学症状的方法，该方法包括对患者使用治疗有效量的由木兰醇，和厚朴酚，白茅苷，和异英波拉托林组成的药物组合物以及生理学上可接受的载体。再一方面，本发明提供了治疗腹泻的方法，该方法包括对患者使用治疗有效量的主要包含选自木兰醇、和厚朴酚、白茅苷和异英波拉托林中的任何一种、或任意两种或多种的组合的药物组合物以及生理学可接受的载体。再一方面，本发明提供了治疗腹泻的方法，该方法包括对患者使用治疗有效量的只包含木兰醇，和厚朴酚，白茅苷，和异英波拉托林的药物组合物，以及生理学可接受的载体。
再一方面，本发明还提供了调节氯离子流量的方法，该方法包括对患者使用治疗有效量的主要包含选自木兰醇，和厚朴酚，白茅苷，和异英波拉托林中的任何一种、或任意两种或多种的组合的药物组合物；以及生理学可接受的载体。
再一方面中，本发明提供了治疗便秘的方法。该方法包括对患者使用治疗有效量的主要包含或包含选自木兰醇，和厚朴酚，白茅苷，和异英波拉托林中的任何一种、或任意两种或多种的组合组成的药物组合物以及生理学可接受的载体。便秘可能起因于但是不局限于如下症状，胃肠癌，Behect氏疾病，初级或次级肠道的神经病，帕金森氏病中的胃肠功能失调，过敏性肠综合征，慢性便秘，赫希施普龙氏病中的肠机能障碍，运输缓慢的便秘，阿尔茨海默氏病中的胃肠功能失调，或慢性鸦片样物质治疗。
附图的简要描述

图1通过和厚朴酚抑制霍乱和毛喉素引起的氯离子分泌。
图2通过白茅苷抑制霍乱和毛喉素引起的氯离子分泌。
图3通过异英波拉托林抑制霍乱和毛喉素引起的氯离子分泌。
图4通过BJW抑制硫酸镁导致的腹泻。
图5通过BJW及厚朴中药物成分刺激氯离子的分泌。
本发明详细描述概要本发明提供中药保济丸(BJW)，亦称Po Chai Pill和Bao Ji Pill的活性化合物的使用方法，该中药由十余种药草组成，目前用作广谱止泻药和缓泻药。
现已从保济丸中分离出四种活性化合物，木兰醇，和厚朴酚，白茅苷，和异英波拉托林，它们可以单独抑制过度的cAMP介导的氯离子分泌并且在无分泌过多时刺激分泌。这些化合物的分离以及被分离化合物的功效验证虑及具有不同组合上述活性成分的药学成分的配方，所适合的每个组分使期望效果最优化，副作用降低到最小化。在优选的实施方案中，本发明包含木兰醇，和厚朴酚，白茅苷，或异英波拉托林中的任何一种、或任意两种或多种的组合。在可选的实施方案中，本发明只包含木兰醇，和厚朴酚，白茅苷，异英波拉托林，以及一种生理学上有效的载体。
作为氯离子流量的有效调节剂，这些化合物特别针对起因于异常的氯离子流量，包括由氯离子和水分泌增加和氯离子和水分泌减少所引起的病理学症状的治疗。在某些实施方案中，该方法针对多囊肾疾病、炎症性肠疾病、霍乱和囊肿纤维变性等。最优选地，该方法针对胃肠道疾病，包括腹泻和便秘。腹泻可以由病毒、细菌、神经内分泌肿瘤、寄生虫或HIV所引起。这些化合物对氯化物和水分泌的有效作用对各种因素导致的GI疾病提供治疗，而没有其主要作用方式为抑制蠕动的止泻药所伴随的神经系统副作用。
在其它实施方案中，这些化合物针对其它胃肠道疾病或具有影响胃肠系统的症状的疾病的治疗。在某些例子中，这些疾病/症状起因于氯化物流量的异常，但在其它例子中它们起因于其它因素。例如，本发明化合物抑制水和氯离子流量的性能可用于治疗腹泻，而不论其起因如何。保济丸和含有本发明所述化合物子集(亚单位)的植物提取物都被显示对非感染性腹泻的抑制。另外，本发明化合物刺激水和氯离子流量的性能可用于治疗很多与便秘有关的疾病的症状，如胃肠癌，Behect′s病，初级或次级肠道神经病，帕金森氏病中的胃肠功能失调，过敏性肠综合征，慢性便秘，赫希施普龙氏病中的肠机能障碍，慢运输便秘，阿尔茨海默氏病中的胃肠功能失调，和慢性鸦片样物质治疗的副作用。
在其它方面，本发明包括该活性成分与其它治疗有效药剂的组合。组合治疗的观念在当前的医疗实践中被广泛地利用。采用两种或两种以上针对同一病症或生化路径的药物进行病理学治疗，相对于单独使用相应剂量的单种药物，有时其治疗效果更佳并可减小副作用。优选地，该活性成分与其它调节氯离子分泌或治疗胃肠机能紊乱的药剂结合给药。
定义除非另外具体说明，本申请使用的下列术语具有归于它们的以下含义。
本发明组合物“治疗有效”量的给药定义为在需要的剂量和时间实现需要的结果的有效量。本发明组合物的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态，年龄，性别，以及体重等因素变化。给药方案可以调整以提供最佳的治疗效果。例如，可以每日给药若干次分剂量或者一天或多天内给药一次。
“药学上可接受的盐”为适于对患者，例如，哺乳动物或者人类给药的有机或无机盐。
“生理学可接受的载体或稀释剂”为适于对哺乳动物如人类给药的媒介物。合适的稀释剂或载体包括无菌溶液如盐水，缓冲水溶液，甘油及其同类物。
术语“分离”，“纯化”或“生物学纯”涉及完全或基本上不含通常在其天然状态发现的与其伴随的组分的物质。纯度和均一性典型地使用分析化学技术如聚丙烯酰酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法测定。在制剂中占主要成分的化合物被充分纯化，特别地，该化合物优选至少具有85％的纯度，更优选至少具有95％的纯度，以及最优选至少具有99％的纯度。
“异常氯离子流量”指在某种意义上背离正常健康受试者的氯化物离子跨越细胞膜的运动。氯化物流量可按照本领域技术人员熟知的方法测量。例如，短路电流技术和使用同位素或荧光的通量测量。
“治疗”患者医学症状的方法指降低或抑制症状，或者促进或提供治疗的方法。通过使用本申请公开的方法或者使用本领域技术人员已知的标准方法，减轻的医学疾病症状可通过大量方法测量。为了检查症状减轻的程度，用潜在的调节剂治疗受试者(例如，大鼠)并且与无调节剂的对照样品相比。
分离或者合成化合物的方法本发明化合物的化学式和结构公开于JP4368324(木兰醇和和厚朴酚)，JP5025008(白茅苷和异英波拉托林)，以及JP9157166(白茅苷和异英波拉托林)。
由木兰醇，和厚朴酚，白茅苷，和异英波拉托林组成的本发明的组合物可以是植物提取物，从植物提取物纯化的化合物或化合物的混合物，或者与植物提取物中发现的化合物具有相同或相似化学结构的重新合成的化合物。制备提取物的方法在本申请和本领域均有描述，例如JP 426403(“从含木兰醇植物中提取木兰醇”)，对于白茅苷的提取在Garcia-Argaez等，Planta Med 66(3)279-81(2000)中有描述，对于异英波拉托林的提取，在Yang等，J Chromatogr 883(12)67-73(2000)中有描述。上述提取物和化合物也可从市场上获得。
试验化合物改变氯离子和水流通量的能力的测定上述化合物的活性可按照本申请所述的测定方法试验。化合物调节液体分泌的能力可通过本领域技术人员已知的各种体外和体内测定法进行测定。优选地，在本发明化合物给药之前或之后通过炎症刺激(例如，使用前列腺素)诱导液体积聚。液体积聚可以在有或没有化合物(例如克液体/克肠)存在的情况下测量以确定抑制程度。对于方法的更详细说明，参见Robert等，Prostaglandins 11(5)809-28(1976)；Rani等，JEthnopharmacology 68(1-3)315-9(1999)；Kislofier等，Gastroenterology72(3)462-8(1977)；Cunha Ferreira等，Acta Paediatr 81(1)46-50(1992)。
化合物调节氯离子分泌的能力可通过本领域技术人员已知的各种体外和体内测定法测定。优选地，在有或没有试验化合物的存在下，采用可增加cAMP水平的任何药剂(例如，毛喉素或霍乱毒素)刺激分泌氯离子的哺乳动物细胞系(例如，T84，人类结肠细胞系)诱导氯离子分泌。氯化物分泌水平可以通过本领域技术人员已知的任何方法测量，但是优选短路电流技术或使用同位素或荧光的通量测量(Donowitz M等，Annu.Rev.Physiol 48135-150(1986)；McCabe RD等，Am J Physiol 247(4 Pt1)G411-8(1984)；Foster ES等，J.Clin Invest 77228-235(1986)；Chao等，J Membr Biol 113(3)193-202(1990)；Fondacaro等，J Pharmacol ExpTher 247(2)481-6(1988))。
这些化合物的体内作用可以使用本领域技术人员已知的腹泻或便秘动物模型测定。优选地，哺乳动物(例如，大鼠)腹泻通过硫酸镁或大黄引发，使用该化合物对其治疗，其效果通过比较肠运输和腹泻来确定，并采用本领域技术人员已知的方法进行测定。例如，Fiocchi等，Life Sci312221-3(1982)；Ozaki等，Jpn J Pharmacol 8093-96(1999)。哺乳动物的便秘可以通过吗啡，异搏定，阿托品，或阿米替林引发(Tsusumi等，Biol Pharm Bul123(5)65 7-9(2000)；Bianchi等，Gastroenterology 85(4)852-8(1983)；Calignano等，Gen Pharmacol 23(4)753-6(1992))。药物组合物以及给药在某些实施方案中，本发明药物组合物包含下列化合物木兰醇，和厚朴酚，白茅苷，以及异英波拉托林中的任何一种，两种，三种或四种。在特别优选的方案中，本发明药物组合物包含单独的木兰醇，或木兰醇与其它化合物(和厚朴酚，白茅苷，和异英波拉托林)中的任何一种组合，或所有四种化合物(木兰醇，和厚朴酚，白茅苷，以及异英波拉托林)在一起。
生理学上可接受的载体一方面由所给药物的组分决定(例如，保济丸活性成分的组合物)，另一方面也取决于药物制剂的方式。因此，本发明药物组合物有各式各样的合适的制剂(参见，例如Remington′sPharmaceutical Sciences，17thed.，1989)。给药可以采用任何便利的方式进行，例如，通过注射，口服，吸入，透皮作用，或直肠给药。剂量和用法可以使用本申请提供的体内和体外模型确定。
适于口服的制剂可以包括(a)液体溶液，如有效量保济丸活性成分悬浮在稀释剂中，该稀释剂如水，盐水或PEG 400；(b)胶囊，香袋或片剂，各含作为液体，固体，颗粒或凝胶的活性成分的预定量；(c)在合适液体中的悬浮液；以及(d)合适的乳剂。片剂形式可以包含一种或一种以上乳糖，蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇，磷酸钙，玉米淀粉，马铃薯淀粉，微晶纤维素，凝胶，胶体二氧化硅，滑石，硬脂酸镁，硬脂酸，及其它赋形剂，着色剂，填料，粘结剂，稀释剂，缓冲剂，润湿剂，防腐剂，增香剂，染料，崩解剂，以及药学上兼容的载体。糖锭剂形式可以在调味剂中含活性成分，例如，蔗糖，也可以是在惰性基质中包含活性成分的软锭剂，如凝胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳剂和凝胶剂以及除活性成分之外含有本领域已知的载体的类似物。
选择的、单独的或与其它合适的组分结合的化合物可被制造成为气雾剂(即，它们可以被“喷雾”)经吸入给药。气雾剂可以被放入可接受的压缩气体中，如二氯二氟甲烷，丙烷，氮气及其类似物。
适于肠胃外给药，如通过静脉，肌肉，皮内，腹膜内的和皮下给药的制剂包含其中可以包含含水和无水的等渗无菌注射溶液，该溶液可以包括抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，配制与预定接受者血液等渗的制剂的溶质，以及可以包含悬浮剂，增溶剂，增稠剂，稳定剂和防腐剂的含水和无水的无菌悬浮液。
该配制可以以单剂量或多剂量封装提供，如安瓿和管形瓶。根据本发明，对患者的给药剂量应该随着时间的过去在患者体内足以产生有益治疗反应的作用。该剂量由所用特殊成分的效果、需要治疗的患者的状况以及患者的体重或表面积来确定。剂量的大小也根据伴随特殊组分的给药在特殊的患者体内产生的任何不良副作用的存在，性质和程度来确定。
在确定治疗或预防症状时需要给药的组分的有效量时，医师评价该组分的循环血浆水平，组分毒性，疾病的进展和抗组分抗体的产生。一般说来，剂量当量大约1毫克/千克体重，其中化合物的混合物可以为任何比例。
对于给药，本发明的组合物可以按照组分的LD 50，和各种浓度下组分的副作用以及用药患者的体重和总的健康状态来确定。给药可以通过单剂量或分剂量进行。
如每个特定引用的出版物或专利申请被作为参考编入本申请一样，本说明书中引用的所有出版物和专利申请均作为参考编入本申请。
尽管上述发明为了便于清楚理解已经通过说明和举例进行了较为详细的描述，但是，根据本发明的说明，对于本领域普通技术人员显然很容易明白，在没有脱离所附的权利要求的构思路或范围的前提下可以进行某些变化和修改。
实施例下列实施例提供说明，但不限制所要求保护的发明。
实施例1本实施例说明保济丸及其活性组分，木兰醇，和厚朴酚和白茅苷在大鼠中抑制PGE2诱导的液体积聚的能力。使用体重在220和250克之间的任何性别的Sprague-Dawley大鼠，8只一组。使用修改过的PGE2诱导的肠郁积enteropooling)测定(Robert等，Prostaglandins 11(5)809-28(1976))。在PGE2给药(100μg/千克，i.g.)之前60分钟，将试验药物或媒介物对大鼠胃肠道给药。用PGE2治疗之前，用保济丸给药(i.g.1.6克/千克，2x推荐的人类剂量)每日一次，共两天。测得肠液体积聚/克体重并且计算得到％抑制率，如表1所示。该试验表明保济丸及其活性组分对PGE2诱导的液体积聚具有抑制作用。在2x推荐的人类剂量的剂量下，保济丸和木兰醇的作用明显比市场上获得的普通止泻药loperamide更加有效。
表1.保济丸和所述组分对PGE2诱导的液体积聚的作用类型剂量流体集聚率(FA) 分泌抑制(流体g/g肠) (％)常规载体 2.47±0.13PGE2模型100μg/kg 12.87±2.03###BJW 1.6g/kg 3.10±0.35***94木兰醇 2mg/kg7.06±1.18*56白茅苷 2mg/kg8.87±1.93 39Loperamide 2mg/kg5.09±1.40*75###P＜0.01和正常组相比P＜0.05，***P＜0.01和模型组相比分泌％抑制率＝(FAmodel-FAtest)/(FAmodel-FAnormal)×100％实施例2本实施例说明保济丸活性组分在分泌Cl-的人类结肠细胞系T84中对cAMP活化的Cl-分泌的抑制作用。由于导致cAMP上升的腺苷酸环化酶的活化是包括PGE2诱导的和霍乱毒素诱导的腹泻在内的许多分泌器官腹泻的隐性机制，因此腺苷酸环化酶活化剂，毛喉素(10μM)，以及霍乱毒素诱导的跨越T84细胞单层的Cl-分泌都被检查。和厚朴酚，白茅苷和异英波拉托林对毛喉素诱导和霍乱毒素诱导的分泌的抑制作用的浓度响应曲线如图1，2，和3所示，具有相近的IC50s(4-7μg/毫升)。这些结果证明所述的活性化合物与抑制cAMP活化的Cl-分泌具有相似的作用。
下列实施例说明保济丸对其它用实验方法诱导的腹泻模型的作用。
实施例3本实施例说明保济丸对硫酸镁-诱导的大鼠腹泻的作用。试验不同剂量的保济丸，结果如图4所示。剂量为1.6克/千克(2x推荐的人类剂量)时对硫酸镁诱导的腹泻获得有效抑制效果。这比另一种中药基的止泻药穿心莲更有效，给药剂量为0.25克/千克(10x推荐的人类剂量)。因为硫酸镁诱导的腹泻的隐性机制有多种，包括由于增加渗透压力引起增加流体体积，运动性刺激以及分泌，由保济丸对该腹泻模型的完全抑制表明保济丸及其组分还可以作用于除分泌以外的机制。
实施例4本实施例说明保济丸对大黄诱导的大鼠腹泻的作用。大黄为众所周知的通过刺激肠运动性和抑制Na+和液体吸收慢性诱导腹泻的中药。随着动物体重减轻及体温降低，该模型看起来像是模仿慢性腹泻。大黄溶液(8毫升/千克)对10只一组的大鼠给药，每天一次给10天。试验药物或媒介物(6毫升/千克，i.g.)在第8天给药并且在第11天进行检测。结果如表2所示。保济丸以剂量依赖的方式产生抑制作用。尽管保济丸对该腹泻模型的作用比对其它腹泻模型更低，但是比另一种中药基止泻药穿心莲更有效。
表2保济丸对大黄诱发的腹泻的作用类型 剂量肠 腹泻抑制(g/kg) (g) (％)常规 载体 9.1±1.0模型 载体 17.7±1.9###BJW 0.414.5±1.3 37BJW 0.812.1±1.3*58BJW 1.611.7±1.3*70CXLP 0.25 15.2+1.5 29###P＜0.01和正常组相比*＜0.05，和模型组相比腹泻％抑制率＝(ID模型-ID试验)/(ID模型-ID常规)×100％
实施例5本实施例说明保济丸及其活性成分对人类结肠细胞中的Cl-和液体分泌的刺激作用。在无其它刺激时，保济丸以及厚朴刺激Cl-分泌(图5)，木兰醇和和厚朴酚从厚朴中衍生得到，因此，说明保济丸及其活性成分具有作为轻泻剂的潜在活性。
本申请公开的实施例和实施方案只是为了用于说明，对本领域的技术人员可由此提出各种修改或变化，这些均包括在本申请的构思和范围以及所附的权利要求的范围内。本申请所引用的所有出版物、专利和专利申请全部编入参考文献。


本发明提供治疗由异常氯离子流量所引起的医学症状的方法，该方法使用包含从中药保济丸(BJW)分离的活性成分的药物组合物。该药物组合物包含下列化合物中的任何一种或任意两种或多种的组合木兰醇，和厚朴酚，白茅苷，异英波拉托林，以及生理学可接受的载体。在优选方案中，医学症状包括胃肠道疾病，如腹泻和便秘。