专利名称：Hb-egf组合物和其治疗与增强的尿道上皮渗透性相关的病症的应用的制作方法肝素结合性表皮生长因子样生长因子或HB-EGF是EGF蛋白家族成员，EGF蛋白家族还包括EGF、TGFa、双调蛋白和β细胞素。HB-EGF本身最初是在1990年确定的巨噬细胞分泌的肝素结合性生长因子。象EGF家族的其他成员一样，HB-EGF通过与EGF受体结合 来发挥其生物学作用。不过，与EGF家族的大部分成员不同，HB-EGF以高亲和力与肝素结合，这看起来增强了与EGF受体(her_l、ErbBl)的结合。HB-EGF还结合受体her_4 (ErbB4)和nardilysin,这使其在EGF家族中是独特的。1991 年报道了编码人 HB-EGF 的 cDNA 的克隆(Higashiyama 等，Science, 251 936)。HB-EGF的成熟形式是从被称为pro-HB-EGF的208个氨基酸的跨膜前体加工的分泌型蛋白。成熟HB-EGF包含跨本文中由SEQ ID NO : I表示的前体的残基63-148的86个氨基酸。还已知HB-EGF的许多微不均一(microheterogeneous)形式,这些微不均一形式包括不同的N-末端截短的前体形式，包括残基63-148、残基73-148、残基77-148和残基82-148。人HB-EGF的一种特别有活性的形式包括残基74-148 (SEQ ID NO :2)。这些蛋白质作为重组产物的产生在1998年9月22日授权的US 5，811，393中描述。已提出使用HB-EGF治疗多种医学适应征。在2007年10月2日授权的US7，276，479中，Besner和Pillai描述了在儿童和成人患者中使用HB-EGF治疗与肠缺血如坏死性小肠结肠炎、休克、败血症以及肠绞痛相关的病症。在2001年5月15日授权的US 6，232，289中，Keay等提出了使用HB-EGF抑制在间质性膀胱炎患者中升高的尿液荷载的抗增殖因子(APF)，间质性膀胱炎在一些患者中是以具有炎症性成分和以疼痛为特征的膀胱尿道上皮糜烂以及在该受累个体中尿频和尿急为特征的病症。间质性膀胱炎(IC)的确切原因不清楚，但推断的病因包括感染、过敏或免疫性疾病、内分泌失调、尿中毒性化学品、缺陷的过渡粘膜、精神性疾病、神经性疾病以及淋巴管或血管阻塞。提议的治疗包括戊聚糖多硫酸盐、葡糖氨基葡聚糖如透明质酸(参见US5，880，108)和硫酸软骨素(参见US 6，083，933和US 7，772，210)、抗炎或免疫抑制剂治疗、肌肉松弛剂、抗组胺药和止痛药。在这些中，FDA仅批准经口服递送戊聚糖多硫酸盐以及经膀胱内灌注递送至膀胱的50%二甲亚砜溶液。不管是什么原因，间质性膀胱炎是一种尿道上皮疾病。由于尿道上皮的主要作用是(I)作为防止细菌和结晶粘附的屏障，和(2)防止尿中溶质渗透进入膀胱壁，因此当在IC中该屏障功能丧失发生时当然在该疾病的病理生理中起了重要的作用(参见Hurst等，April 2007, Urology, 69 (supplement 4A) : 17-23)。因此,期望提供一种有效促进尿道上皮生长和屏障性质的治疗，以治疗性用于患有膀胱炎以及其他与尿道上皮损伤相关的病症的个体。
现在已确定当通过灌注将HB-EGF给药于膀胱时发生广泛的增生性改变，导致尿道上皮和下面的膀胱组织层都增厚。而且，给药HB-EGF具有双重的作用，以及另外的降低尿道上皮细胞和组织渗透性的医学益处，从而提高具有损伤的尿道上皮的个体如具有膀胱炎的患者所需的降低溶质敏感性的屏障功能。该HB-EGF作用是特别令人惊奇的，因为HB-EGF的受体EGFR在正常膀胱的伞状细胞层中是不存在的。因此，本发明涉及使用有效减少尿道上皮渗透性的量的HB-EGF，特别是治疗具有尿道上皮损伤的个体，包括具有膀胱炎以及尤其是具有间质性膀胱炎的个体。因此，根据本发明的一个方面，提供用于治疗个体以减少受损尿道上皮渗透性的方法，所述方法包括递送至所述个体的尿道上皮有效量的HB-EGF。在相关方面，实施该方 法以治疗具有膀胱炎包括间质性膀胱炎和与受损的尿道上皮相关的相关病症的个体。同样地，本发明提供HB-EGF在制备减少需要其的个体中尿道上皮渗透性的药物中的应用，所述个体包括具有间质性膀胱炎的个体。本发明还提供HB-EGF减少需要其的个体中尿道上皮渗透性的应用，所述个体包括具有间质性膀胱炎的个体。在本发明的相关方面，提供一种组合物，该组合物包含在需要其的个体中有效减少尿道上皮渗透性的单位剂量的HB-EGF。在实施方案中，该组合物包含单位剂量在IOmg至IOOOmg 范围内，例如 50-200mg 的 HB-EGF。在进一步的相关方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包括当通过灌注递送至需要其的个体的膀胱时有效减少尿道上皮的渗透性的单位剂量的HB-EGF和使用其实现该治疗的说明书。在实施方案中，所述试剂盒还包括适合将HB-EGF重构成适合于膀胱内递送的剂型的含水载体以及任选的用于灌注该组合物的导管。本发明的其它特征和优点从下面的将变得清楚。然而，应理解，该和特定实施例尽管指出了本发明的优选实施方案，但是仅以例示的方式给出，因为从该在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对本领域技术人员而言将变得清楚。

本发明的这些和其它方面现在参考附图更详细地描述图I显示HB-EGF体内对正常小鼠中膀胱细胞增殖的作用；图2显示HB-EGF体内对酸损伤小鼠膀胱的渗透性的作用。

合适地，且在优选的实施方案中，通过膀胱内灌注给药，即使用导管直接将药物递送入膀胱来治疗个体。对于递送入膀胱，期望HB-EGF在含水溶液中提供。应当理解，膀胱可以容纳的体积是有限制的，因此可灌注给药至给定个体的药物溶液的体积是有限制的。对于人膀胱，所述体积通常在IOmL至约IOOmL的范围内，更期望地在20mL至约75mL的范围内，适当地在40mL-60mL的范围内。在该范围的上限(IOOmL)，所述个体在所需治疗期间对保留该溶液将有困难。在该范围的下限(IOmL)，对于将足够的药物推过导管所需的体积可能不能达到。最期望地，药物溶液的体积至少足以使整个膀胱衬壁沐浴/接触药物。使用中，灌注药物溶液并由患者在排尿之前保持至少约30分钟的时间，期望更长的时间。可以进行重复治疗，例如2-6周每周两次，随后另外的 4-8周每周一次的减少维持方案。治疗应重复进行直到症状中的至少一个例如尿痛、尿急或频率减轻或消除。这些症状的减少通常经验性测量，使用Oleary SantIndex建立基线和治疗期间的得分，以使得可以衡量进展情况。对于使用，因此期望将HB-EGF配制为含水溶液，例如使用盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)为载体。HB-EGF期望以每次灌注单位剂量提供，其在至少约5mg至所选载体中HB-EGF溶解度所限制的最大量的范围。合适地，HB-EGF以每次灌注IOmg至IOOOmg范围的单位剂量给药。在实施方案中，每次灌注HB-EGF的单位剂量为20mg至800mg,30mg至600mg,40mg至 400mg, 50mg 至 200mg, 75mg 至 125mg,90mg 至 IlOmg,包括 lOOmg。因此，可以将 HB-EGF配制为溶液，所述溶液包含在体积为约IOmL至IOOmL范围，20mL至50mL范围，例如15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL或50mL的含水载体如盐水或PBS中的这些单位剂量的HB-EGF。在特定的实施方案中，HB-EGF制剂包含在20mL PBS中的单位剂量为IOOmg的HB-EGF。因此，本发明提供了一种组合物，其包含通过膀胱内灌注有效治疗膀胱炎及相关病症的单位剂量的HB-EGF。应理解，所述组合物还可以作为多剂量制剂提供，所述多剂量制剂包含2个或更多个单位剂量的HB-EGF，用于在给药前随后的稀释或分级。此外，本发明还提供一种试剂盒，其用于治疗患有与尿道上皮损伤相关的病症的个体，所述试剂盒包括(I)对该治疗有效的单位剂量的HB-EGF，(2)任选的用于重构HB-EGF的含水载体,和(3)使用其治疗所述病症的说明书。在该试剂盒中，HB-EGF可在任何合适的无菌的容器例如小瓶、安瓿等中提供。应理解，用HB-EGF组合物治疗的个体还可以用可用于控制目标疾病及其症状的其他药物组合治疗。其他有用的药物包括· BCG(卡介苗)，最初是用于提供预防结核病的疫苗，现已用于治疗不同类型的膀胱癌一些时间；·硫酸软骨素，其可以不同的规格以商品名称Uracyst (2. 0% )和Gepan Instill (O. 2% )获得； 糖皮质激素也可膀胱内使用，单独或以混合形式。色甘酸二钠是抑制肥大细胞的物质；· DMSO ( 二甲基亚砜) 利多卡因(局部麻醉药)，任选仅与碳酸氢钠一起(碱化利多卡因)或与其它药物一起组合使用；·戊聚糖多硫酸钠；·氯化奥昔布宁；·奥昔氯生钠(Chlorpactin )， 例如O. 2%浓度；·透明质酸钠或玻尿酸(也称为透明质酸)。下面非限制性实施例例示本发明实施例在以下的实施例中，所述HB-EGF是人HB-EGF (74-148)，其是在酵母宿主巴斯德毕 赤酵母(Pichia pastoris)中作为分泌性重组蛋白产生的HB-EGF的75个残基的可溶形式。通过离心收集培养物上清液，过滤，并通过阳离子交换色谱之后用疏水性相互作用色谱来纯化。将所得的蛋白质进行超滤/渗滤，然后进行离子交换色谱。将最终产物配制在150mM氯化钠、20mM磷酸钠缓冲液，pH6. O中，并储存在4°C下。实施例I-HB-EGF促讲尿道h.皮细朐体内增葙检测HB-EGF体内对尿道上皮细胞增殖的作用。结果显示在图I中。雌性5_8周龄CBA/J小鼠通过雾化器递送2-3%异氟烷麻醉，并用连接有30GX1/2”针头的聚乙烯导管(I. D. O. 28mm, O. D. O. 61mm)插管。HB-EGF(74-148) (10mg/kg)或 PBS 通过输液泵灌注(每个膀胱30秒内50ul)。通过用胶棉封闭尿道将药物保留在膀胱中。2小时后，除去胶棉并停止麻醉。7天后收获膀胱，将6mm切片(每个膀胱4个象限)用H&E染色并以双盲方式评价。(图1，上图)使用以下的评分系统评价尿道上皮增殖(最大16) :1=正常-完整的多层尿道上皮，2-3个细胞层厚，位于亚细胞基质上；2 =边缘改变-最小尿道上皮细胞层增厚；3 =轻度至中度变化-轻度但清楚的高度上皮化(hyperepithelialization) ；4 =严重至非常严重变化-总体高度上皮化尿道上皮层。(图1，下图)使用镜台测微计测量尿道上皮厚度(每个膀胱12次测量)。提供的数据是来自3个独立研究的汇集。因此，如图I中所示，向正常小鼠膀胱内给药10mg/kg HB-EGF(74-148)导致可检测的膀胱尿道上皮增殖，如盲法组织得分和测微计测量所评价。在正常小鼠中小于或等于lmg/kg的剂量没观察到作用。实施例2-HB-EGF体内减少受损膀胱尿道上皮渗诱件五周龄雌性CBA/J小鼠通过雾化器递送2-3%异氟烷麻醉，并用连接有30Gxl/2"针头的聚乙烯导管(I.D. 0. 28mm, 0. D. 0. 61mm)插管。通过接触2%乙酸(HAc) I小时来引起膀胱损伤。用PBS冲洗膀胱，让小鼠休息0. 5-1小时。然后让小鼠每天接受HB-EGF (17. 5mg/kg)或PBS (2小时保留)治疗。将HB-EGF配制在150mM氯化钠、20mM磷酸钠缓冲液，pH 6. O中。通过导管将其递送至膀胱(参见上文)。通过用胶棉封闭尿道将药物保留膀胱中，2小时后去除药物。酸处理后48小时收获膀胱，将6mm切片(每个膀胱4个象限)用H&E染色并以盲法评价。使用以下的评分系统评价尿道上皮增殖(最大16) :0=高度再上皮化的尿道上皮；I =正常-完整的多层尿道上皮，2-3个细胞层厚，位于亚细胞基质上；2 =轻度损害-尿道上皮细胞的表层的轻度脱落；3 =中度损害-尿道上皮上层的丢失；4 =严重损害-尿道上皮的完全剥脱或上皮层的严重变形部分。在收获前30分钟，用50ul荧光素钠(NAF，50mg/ml)灌注膀胱。通过心脏穿刺收集血液，并用d-葡萄糖醛酸酶测定检测血浆荧光素。
图2总结了来自4个动物组的数据，如下所示I)仅用PBS治疗的对照动物(无酸损伤)；2)酸损伤I小时后处死的动物；3)暴露酸损伤并用HB-EGF的两种剂量治疗并在48小时处死的动物；4)暴露酸损伤并用PBS的两个剂量治疗并在48小时处死的动物。在图2中，上面的图表显示组织学损伤评分。其揭示酸处理在I小时诱导高程度的损伤，在对照(PBS)治疗的动物中48小时减轻。这代表膀胱的自发再上皮化(愈合)。用HB-EGF治疗对促进恢复具有另外的统计学上的显著效果。图2的下图揭示体内渗透性的测定。动物接受膀胱内灌注荧光素钠，如果膀胱渗漏则在血浆中产生可检测到的荧光。该数据显示在酸处理后I小时渗透性有非常大的增 力口，在用PBS治疗的动物中48小时降低。用HB-EGF治疗对降低渗透性具有另外的统计学上的显著效果。SEQ ID NO : I (人 HB-EGF 前体)I mkllpsvvlk lflaavlsal vtgeslerlr rglaagtsnp dpptvstdql lplgggrdrk61 vrdlqeadld llrvtlsskp qalatpnkee hgkrkkkgkg lgkkrdpclr kykdfcihge121 ckyvkelrap scichpgyhg erchglslpv enrlytydht tilavvavvl ssvcllvivg181 llmfryhrrg gydveneekv klgmtnshSEQ ID NO 2( A HB-EGF 种)vtlsskpqal atpnkeehgk rkkkgkglgk kfdpclrkyk dfcihgecky vkelrapscichpgyhgerchglsl虽然参考现认为是优选的实施例描述了本发明，但是应理解，本发明不限于所公开的实施例。相反，本发明意欲涵盖在所附的权利要求的精神和范围内的各种修改和等价安排。所有出版物、专利和专利申请在此以它们的全部内容引入本文作为参考，引入程度如同每个单个的出版物、专利或专利申请被特别和单个地指出以其全部内容引入作为参
考一样。


本发明涉及利用HB-EGF治疗与增强的尿道上皮渗透性相关的病症，所述病症包括间质性膀胱炎。