专利名称：以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗的制作方法慢性乙肝是危害人类健康的全球性问题，对人类健康和世界经济造成极大影响。 乙肝治疗性疫苗已成为本世纪慢性乙肝治疗研究的热点，未来治疗性乙肝疫苗的国内市场有望达到30亿人民币，且以年15%的速度持续增长。因此，发展乙肝治疗性疫苗的基础和应用研究具有重大的科学意义和巨大的社会及经济效益。目前，国际上，正在研制的乙肝治疗性疫苗主要有大剂量基因工程乙肝疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、免疫复合物疫苗、抗体化抗原疫苗等。在国内，熊思东、吴玉章研究小组分别研制的乙肝治疗性疫苗均已完成或正在进行临床试验，并显现出显著治疗效果，但是， 现有乙肝治疗性疫苗大多仍处于研究阶段，仍然面临许多问题(1)现有的治疗性疫苗临床研究多集中于利用前S抗原和S抗原，并通过以免疫原性极强的HBcAg为载体来激活T、B细胞应答，存在一定的局限性，对部分患者的治疗效果并不满意；(2)乙肝患者宿主机体免疫耐受状态使得疫苗设计难度显著增加，现有治疗性疫苗并不能直接实现HBeAg血清转换，取得满意治疗效果；(3)治疗性疫苗的安全性和标准化问题尚待深入研究。因此，未来乙肝治疗性疫苗的研究应综合分析慢性乙肝患者疾病转归规律和免疫耐受机制、筛选新的免疫原提高乙肝治疗性疫苗的免疫原性，优化乙肝治疗性疫苗设计策略及免疫程序、选择适当的佐剂，合理辅助使用细胞因子或抗病毒药，以利于恢复慢性HBV 感染者的免疫系统的反应性、打破机体的免疫耐受状态、实现HBsAg血清转换、获得保护性抗-HBs抗体，成为当前乙肝治疗性疫苗研究的首要问题。完整乙型肝炎病毒即Dane颗粒，由外膜、核衣壳组成。核衣壳内含有一个环状的 DNA分子、DNA多聚酶、具有蛋白激酶活性的DNA结合蛋白。外膜携带乙肝表面抗原(HBsAg)， 核壳携带乙肝核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)。HBV基因组有S、C、X、P、前-前-S和前-X 6个基因。HBeAg和HBcAg均由HBV的0RF-C编码。HBcAg具有极强免疫原性和抗原性(既是B细胞依赖抗原，也是T细胞非依赖抗原)，其抗原性较HBeAg强100倍，是唯一能引发显著免疫反应的HBV抗原，能诱导产生CTL，并辅助保护性抗原(如S、M、L抗原)产生体液免疫和增强细胞免疫应答。因此，几乎所有HBV感染者均会出现抗-HBc抗体。血清HBeAg是分泌性非颗粒状病毒衣壳蛋白，与HBcAg约75 %氨基酸序列相同，较 HBcAg在羧基端少了 34个氨基酸，以Val 149为羧基末端，位于前C区-7位的半胱氨酸与C区中61位的半胱氨酸形成的二硫键是HBeAg区别于HBcAg的独特的二级结构，也是使HBeAg具有与HBcAg完全不同的抗原表位和免疫反应性的原因。HBeAg是乙肝病毒特有的免疫耐受因子，通过下调TLR2表达引起宿主免疫耐受 (Stephen Locarnini)。此外，HBeAg还能能阻断CTL，抑制宿主T细胞的细胞毒活性，将免疫攻击从感染的肝细胞移开，从而形成对HBV感染的免疫耐受。而乙肝患者的免疫耐受被认为是慢性乙肝迁延不愈、并出现不良结局的重要原因之一，也是治疗上最难解决的问题。 以HBeAg阳性、HBVDNA滴度高为特征的围产期野生型C基因型HBV感染患者仍是我国慢性乙肝的主要患者群体。HBV感染后的自然病程和治疗过程中，其病程可分为潜伏期、症状期、清除期、免疫期四个阶段，其转归与病毒的基因型、易突变性、是否整合，宿主性别、营养、免疫力、感染年龄、是否合并其他嗜肝病毒感染或酗酒，是否接受抗病毒治疗、免疫调节治疗等多种因素有关。一旦出现HBeAg血清转换，机体产生抗-HBe抗体，就意味着宿主免疫反应增强，病程进入清除期，病毒复制停止。在此基础上，如果出现HBsAg血清转换(血清HBsAg转阴)，则说明病程进入免疫期，产生保护性抗-HBs抗体，体内病毒被彻底清除。可见，HBeAg血清转换已经成为乙肝患者良好转归的里程碑事件，HBeAg血清转换，并产生抗-HBe抗体是判断病情发展趋势和药物疗效的一个重要指标，是最终彻底清除 HBV、根治乙肝的基础，也是慢性乙肝治疗的中期目标。因此，阻断HBeAg的免疫耐受作用， 打破机体的免疫耐受状态，有可能成为慢性乙肝治疗之关键和新靶点。所以，实现HBeAg血清转换应该作为乙肝治疗性疫苗设计的首要目标，而以HBeAg作为免疫原制备乙肝治疗性疫苗应该是实现上述目标的直接途径。与此同时，伴随抗原组学、抗原表位组学、免疫组学、晶体X线衍射、低温电子显微镜技术的迅猛发展和推广，为深入研究HBeAg空间结构、分析其抗原表位、提供了有力的技术支撑。纳米技术是20世纪80年代末兴起的科学技术。特别是近十多年来，快速发展的纳米技术以其超乎想象的影响力向各个领域渗透，在医药研究领域显示出了出人意料的应用潜力和作用。纳米疫苗已经作为一种新型疫苗制备技术在研发预防和治疗疫苗领域也受到关注，在提升疫苗免疫原性方面显示出巨大的应用前景。近年多种不同形式的纳米疫苗已经出现。例如，口服疫苗采用生物可降解纳米颗粒来靶向特殊树突细胞受体的特定抗原。 Nanomed公司最近采用它的专利纳米模板工程技术开发靶向树突细胞的治疗疫苗，以产生对艾滋病病毒-1 (HIV-I)的免疫应答。初步数据提示，用新纳米颗粒输送蛋白质可以明显增强免疫应答。此外，一些纳米颗粒似乎可起佐剂作用，提高疫苗的疗效。Biosante公司于2007年7月报告，它的磷酸钙(CaP)纳米颗粒基佐剂Biovant有助于开发新的抗H5W 流感株疫苗。啮齿动物模型实验显示，其免疫应答比单独用H5W抗原大4倍。一种新型纳米乙肝疫苗也已经在美国问世。显然，纳米技术的发展也为新型乙肝治疗性疫苗的研究提供新的技术支撑。
本发明解决的问题在于将HBeAg血清转换作为乙肝治疗性疫苗设计的目标，提供以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗，该疫苗能够诱发针对HBeAg 蛋白或其抗原表位的抗体。本发明是通过以下技术方案来实现一种以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗，是由作为免疫原的HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽，与辅料混合而制成；所述的HBeAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；所述的HBeAg抗原表位多肽为SEQ ID NO :2 SEQ ID NO :11所示的一种或几种。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗，是将HBeAg 蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽与其质量0. 1 10倍的AL(OH)3,在pH6. 8的磷酸盐缓冲液中混勻，再加入AL(OH)3质量0. 1 2倍的甘露醇、蔗糖、白蛋白、水解明胶、乳糖或山梨醇混勻。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗，是将HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽通过双乳液体系吸附于聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)， 形成粒径为0. 5 10 μ m的纳米微球，聚乳酸-聚乙二醇共聚物载药量大于15 %、包封率大于 80%。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗，是HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽吸附于粒径为50 IOOnm的纳米Al (OH)3溶胶当中，HBeAg 蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽纳米Al (OH)3溶胶的质量比=10 20 μ g Img,纳米 Al (OH) 3溶胶的吸附率大于10 μ g/lmg。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗，是HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽分散于油相中，然后制成粒径为10 30nm的油包水型纳米颗粒，油相与水相的体积比为1 3 5 ；油相为Span-20 poloxamer 188 大豆油= 80 180 100的质量比混合，水相为双蒸水；HBeAg蛋白与油相的质量比为1 200 300。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗，是HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)按照1 20 50的质量比在有机溶剂中搅拌乳化，形成水包油包水型复乳，然后室温下去除有机溶剂，再用水洗涤之后冷冻干燥所得到的粒径为100 400nm的微球，包封率大于40. 0%。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗，是HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽吸附于壳聚糖颗粒中，形成粒径为100 200nm的纳米颗粒， HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽壳聚糖的质量比1 3 5。所述的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗，是HBeAg抗原表位多肽偶联于钥孔帽贝血蓝蛋白，HBeAg抗原表位多肽钥孔帽贝血蓝蛋白的质量比 1 3000 2 30 ；HBeAg抗原表位多肽为SEQ ID NO 2 11中的一种或几种。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果通过系统分析慢性肝炎患者机体免疫耐受机制和治疗现状，本发明提出直接以 HBeAg为免疫原，应用纳米技术制备乙肝治疗性HBeAg纳米疫苗的制备，以提高HBeAg的免疫原性和免疫效果，这是实现HBeAg血清转换的最佳策略和直接途径。本发明采用真核表达系统或非真核表达系统制备HBeAg蛋白、采用人工合成法， 优选Fmoc固相合成法人工合成HBeAg抗原表位多肽，直接将HBeAg蛋白和(或)HBeAg抗原表位多肽单独和(或)混合作为主要免疫原用于乙肝治疗性疫苗的制备。该乙肝治疗性疫苗既可是蛋白疫苗、多肽疫苗，也可是新型纳米疫苗。本发明提供的以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗能够诱发BALB/c小鼠产生高效价抗-HBe抗体。抗体效价从免疫后3周即开始升高，此后所免疫次数增加而继续升高。在进行4次免疫之后，小鼠已经可以产生效价较高的抗体，这样就有利于实现HBeAg血清转换。Dffestern blot检测培养上清中HBeAg蛋白的表达分别收集培养上清热变性后，取10 μ 1上清行SDS-PAGE电泳，利用Bio-Rad蛋白转印系统转膜。5%脱脂奶室温封闭，1 200稀释的抗-HBeAg单克隆抗体孵育，1 1000 稀释的HRP-IgG孵育，TBST洗膜，DAB显色。2) Western blot检测CHO细胞中HBeAg蛋白的表达选择筛选获得的阳性细胞株进行扩大培养，收集细胞(密度为IO6个/ml)和24h 表达上清各25 μ 1，加入等量2 X SDS凝胶加样缓冲液，行SDS-PAGE电泳，利用Bio-Rad蛋白转印系统转膜。5%脱脂奶室温封闭，1 200稀释的抗-HBeAg单克隆抗体孵育，1 1000 稀释的HRP-IgG孵育，TBST洗膜，DAB显色。1. 3稳定表达HBeAg的CHO细胞的筛选确认转染成功后，根据G418最小致死浓度试验，用含800mg/mL G418的完全培养基培养，3-4d后当对照组细胞大部分死亡时，改用含600mg/mLG418的选择培养基筛选，每 2-3d换液传代，经过14d培养后，采用有限稀释法，将CHO细胞移入培养板内，用G418持续筛选，适时更换培养液并传代。直至检测出稳定表达HBeAg的CHO细胞克隆，扩大培养并传代培养。1. 4重组HBeAg蛋白的纯化采用纯化的天然抗-HBe抗体，利用SPA标记的磁珠免疫共沉淀法分离，收集重组 CHO细胞表达的HBeAg蛋白；并用SDS-PAGE验证蛋白纯度，BCA法测定蛋白浓度，分装冻存 (_80°C冰箱)。实施例2. HBeAg蛋白抗原表位肽的体外合成和纯化SEQ ID NO :2 11所示的HBeAg抗原表位多肽为长度为8 32个氨基酸残基的多肽，采用Fmoc固相多肽技术来完成其制备(也可委托专门的合成公司来完成)采用Fmoc固相多肽合成技术，在PS3全自动固相多肽合成仪上，以Ν_ α -Fmoc保护的氨基酸为原料，Rink氨基树脂为载体，20 %哌啶DMF溶液为脱保护剂，HBTU为肽键缩合剂，按已知序列从C端到N端的顺序依次偶联合成。合成结束后从多肽合成仪PS3上取下反应瓶，放到通风橱中。用DMF将反应瓶中的肽-树脂全部冲到Poly-Pr印层析柱中。用甲醇冲洗树脂8次，除去DMF。氮气吹干后用裂解液(TFA 苯甲硫醚苯甲醚二巯基乙烷的体积比为90 5 2 3)将合成多肽从树脂上裂解下来，同时脱去所有保护基团。收集溶有合成肽的裂解液，用氮气小心吹去裂解液中的TFA直至残余裂解液体积到2mL左右，然后用-20°C的无水乙醚使抗原肽沉淀，离心收集沉淀，用氮气吹去乙醚，即得合成肽粗品。合成肽粗品经高压液相反相层析柱C18分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后，得到纯化的合成肽。对合成的蛋白多肽进行质谱鉴定，然后将质谱分析的荷质比与预测的理论分子量进行比较。合成肽再经反相高效液相色谱分析其纯度，色谱条件如下色谱柱Jupiter Proteo (250mmX 4. 6mm，4IU)，流动相 A :0. 1% TFA/水流动相 B :0. 1% TFA/ 乙腈；线性梯度15% B — 40% B，25min ；柱温:35°C ；流速1. Omol/min ；检测波长:220nm。实施例3铝佐剂-HBeAg蛋白疫苗的制备取质量浓度为5%的硫酸铝溶液250ml，在强烈搅拌下加入5%氢氧化钠溶液100ml，用生理盐水离心洗涤沉淀2次，再将沉淀悬入生理盐水中使总体积达250ml。(也可直接采用市售铝佐剂(AL(OH)3)。取HBeAg蛋白(20 μ g/mL) 5 100 μ g作为免疫原，加入等体积含铝佐剂 AL(0H)3(2mg/ml)的磷酸盐缓冲液中(pH6. 8)，4°C搅拌混勻2 3h，再加入AL(OH)3质量 0. 1 2倍的甘露醇、蔗糖、白蛋白、水解明胶、乳糖或山梨醇中的至少一种而制备成乙肝治疗性蛋白疫苗。实施例4. PLEG-HBeAg疫苗的制备采用双乳液(W1/0/W2)体系溶剂抽提法在无菌条件下，将聚乳酸一聚乙二醇共聚物(PLA-PEG copolymers, PLEG)共聚物溶于二氯甲烷，然后加入HBeAgOffieAg与PLEG的质量比为1 1.5 3 4. 5)并用超声波乳化成乳液，得到初乳(W1/0)；再将初乳加入0.3%聚乙烯醇水性溶液中，机械快速搅拌12h得到稳定乳液(W1/0/W2)。在室温下高速搅拌直至二氯甲烷完全挥发，然后用微孔滤膜抽滤，分离离心，用蒸馏水洗涤3次，冷冻干燥。也可用异丙醇水溶液溶解有机溶剂(二氯甲烷)，分层之后离心分离除去，冷冻干燥得到微球(即聚乳酸一聚乙二醇共聚物包裹的HBeAg蛋白)。应用扫描电子显微镜观察微球表面形态，并通过检测蛋白含量推算封包率，聚乳酸-聚乙二醇共聚物载药量应大于15%、包封率大于80%。实施例5 纳米铝佐剂-HBeAg疫苗的制备1)纳米铝佐剂的化学制备取质量比为1 1 1 4的苯扎溴铵、正辛醇、环己烷于烧杯中，在25°C、磁力搅拌下，再加入等体积的lmol/L A1C13溶液搅拌lOmin，形成苯扎溴铵-正辛醇-环己烷-A1C13溶液体系，然后用高速分散均质机搅拌，使其乳化成为微乳液。然后将微乳液倒入有盖的反应瓶加热搅拌，缓慢逐滴加入过量氨水保持体系的PH 值在8 10，盖上盖子，反应2 3h后，加入丙酮破乳，离心弃上清液，用950g/kg的无水乙醇和去离子水共洗涤沉淀3次，最后采用冷冻干燥法(-70°C )或真空干燥法(4°C )，将沉淀干燥后得到膨松的纳米Al (OH) 3干凝胶。然后将纳米Al (OH) 3干凝胶溶解在水中，并用超声波分散，在水溶液中呈分散状态；电子显微镜观察测量的方法测定纳米粒经，获得粒径为50 IOOnm纳米的铝佐剂。2)纳米铝佐剂疫苗的制备以水为溶剂，配成浓度为1 5mg/ml的纳米铝佐剂溶剂，超声波分散纳米铝佐剂溶液20min之后，再与等体积的浓度为20yg/mL的HBeAg蛋白溶液(用蒸馏水稀释)混合， 4°C条件下吸附一周，再以15000r/min离心30min，所得到的沉淀即为纳米铝佐剂-HBeAg 疫苗；采用蛋白定量法检测上清中蛋白浓度，封包率大于90%，纳米Al (0H)3溶胶的吸附率大于 10 μ g/lmg。实施例6 油包水型HBeAg纳米疫苗的制备1)采用磁力超声法制备油包水型HBeAg纳米疫苗将HBeAg蛋白1.0mg、80g/L Span-20 (司盘-20，山梨醇酐单月桂酸酯)、180g/L poloxamer 188 (泊洛沙姆188)和0. 6mL大豆油，双蒸水调整体积为2. 5mL,混合均勻得到油相；在3000r/min磁力搅拌下，将油相逐滴加入7. 5mL双蒸水水相中混合；再将混合物移至真空高速剪切乳化机上，在0. 7kpa真空下，23，OOOr/min，高速剪切40min，温度控制在80°C 以下；冰浴下40kHz超声5min，反复3次使混合物完全乳化，即得到油包水型HBeAg纳米疫苗(0. lg/L)。0. 22 μ m滤膜过滤除菌后，于4°C保存。2) HBeAg纳乳滴的性质鉴定将制成的纳米乳滴稀释于生理盐水中，取100 μ L滴于400目铜网上，磷钨酸染色， 透射电子显微镜下观察其形态，将采集的图象经计算机图象分析求得纳米乳滴的平均粒径为 10 30nm。3)包裹率、载药量及稳定性测定采用S印hedex-GlOO凝胶层析法，收集游离的HBeAg用分光光度计测定A280值。 同时制备不同浓度的HBeAg标准蛋白样品，用分光光度计测定其光度值，并绘制浓度与光度值的标准曲线。以标准曲线为依据，计算出纳米颗粒中游离HBeAg的含量。包裹率按公式计算包裹率=(W总-W游)/W总X 100 %。其中W总为制备时所用HBeAg的总量，W游为游离的复合抗原的量。结果显示包裹率大于80%，于4°C放置6个月或3000r/min IOmin离心，无分层和沉淀现象。4)油包水型HBeAg纳米疫苗生物安全性检测将所制备的疫苗肌肉注射免疫小鼠后，在自然状态下，观察免疫小鼠疫苗吸收时间，有无局部反应或全身不良反应，注射部位肌肉损伤情况。要求无肌肉坏死、肉芽肿、溃烂等损伤性反应。实施例7 =PLGA-HBeAg纳米疫苗的制备具体采用物理方法制备，其具体步骤为取50mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球(LA GA = 50 50，相对分子质量 15000)溶于ImL 二氯甲烷(DCM)中，然后加入ImL HBeAg蛋白溶液(lmg/mL)，超声Imin (功率为100W)，可见乳白色油包水(W1/0)型初乳形成；再加入2g/L聚乙烯醇(PVA)溶液2mL， 在冰浴条件下再次超声5 20min(功率为55W)，形成水包油包水(W1/0/W2)型复乳，然后将此复乳转移至50mL去离子水(pH4.6)中，室温下搅拌4h使有机溶剂完全挥发，10000 X g 离心20min，并收集沉淀。将所得到沉淀用双蒸水重新洗涤、分散，置于低温冷冻干燥机中 (-800C )干燥40h，收集干燥的粉末(大小为100 400nm的微球，包封率大于40. 0% )，得到PLGA-HBeAg纳米疫苗，4°C保存。参照实施例6进行纳米粒子形态、大小、载药量，生物安全性的检测。实施例8 壳聚糖-HBeAg纳米疫苗的制备88. 5%脱乙酰度壳聚糖与生理盐水配成10g/L的溶液，再经超声(输出功率80Hz) 处理2次，每次5min，间隔lmin，以50 X g离心IOmin后取其上清，并以400目网筛过滤，再以1400Xg离心IOmin后收集其沉淀物，即为壳聚糖小颗粒。取质量浓度为的壳聚糖的生理盐水溶液(β - (1-4)2-氨基2-脱氧-D-葡聚糖，CTS)，用0. lmol/L的NaAC-HAC缓冲液稀释至0. 2 %待用，再将壳聚糖溶液经0. 22 μ m滤膜过滤，取IOmL于干燥试管中待用。取3mL HBeAg蛋白原液(浓度为20μ g/mL)与3mL Na2S04溶液(浓度为50mmol/ L)混勻；在混悬振动器震动下，向装有IOmL 0. 2%的壳聚糖溶液中加入3mLNa2S04混合后的疫苗稀释液，再逐滴加入三聚磷酸钠550 μ L，此时溶液呈现悬浊状；室温搅拌IOmin后，进行超声(输出频率80Hz)处理2次，每次5min，间隔lmin，)处理后，以10000r/min的速度高速离心20min，所得沉淀为壳聚糖-HBeAg纳米疫苗(粒径为100 200nm)。将其用 0.9% NaCl溶液重悬备用，参照实施例6进行纳米粒子形态、大小，载药量，生物安全性检测。在上述实施例3 8当中，本领域技术人员也能够将其中的HBeAg蛋白替换为 HBeAg抗原表位多肽，以制备各种相应的HBeAg抗原表位多肽疫苗。实施例9 =KLH-HBeAg抗原表位多肽疫苗的制备HBeAg抗原表位多肽与载体蛋白的偶联A液15mg钥孔帽贝血蓝蛋白(KLH)溶于2ml甘油；B液5 100 μ g HBeAg抗原表位多肽(SEQ ID NO :2 11的一种，或者几种的任意比例混合)溶于Iml 二甲基亚砜；将A液和B液混合后加入偶联剂碳二亚胺(EDS)5mg振荡Ih后，置于磁力搅拌器上搅拌过夜，次日层析分离纯化KLH偶联的HBeAg抗原表位多肽，收集合并含蛋白的洗脱液， 测定蛋白浓度，按照5 100μ g/ml的抗原浓度，Iml剂量分装，置_20°C保存。疫苗的免疫效果本发明获得的HBeAg蛋白(SEQ ID NO 1)和HBeAg抗原表位多肽(SEQ ID N0: 2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、 SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11)作为免疫原并采用上述实施方案中适宜的疫苗制备方法或其他方法制备乙肝治疗性疫苗，该疫苗用于HBeAg阳性乙肝患者的生物免疫治疗，能够诱发患者产生抗-HBe抗体，现实乙肝患者HBeAg血清转换，达到最终治愈乙肝的目的。上述实施例描述的方法制备的乙肝治疗性HBeAg蛋白/多肽疫苗的免疫效果，其中以CHO细胞表达并纯化的HBeAg蛋白(SEQ ID NO 1)为抗原检测实施例3_9描述的方法制备的乙肝治疗性HBeAg蛋白(多肽)疫苗的免疫效果，具体方法如下1)动物免疫BALB/c小鼠随机分成实验组(每个疫苗可分为1组)和对照组，每组4只，采用背部皮下多点注射方式免疫动物，每次注射100 μ L，疫苗当中所包含的免疫原总量为5 μ g， 对照组接种含相应佐剂的PBS溶液。第1次接种后，2周后加强1次；以后每4周接种1次，共接种4次。从第2次接种开始，每次接种后1周尾静脉取血，第4次免疫接种后1周眼球后静脉采血，观察抗体含量的变化。2) ELISA法检测抗体效价常规方法分离血清，倍比稀释后加入已包被HBeAg蛋白的96孔ELISA板(采用常规方法以实施例1所述的方法制备纯化的HBeAg蛋白为抗原，包被ELISA板)。37°C孵育 2h后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG(l 2000)，37°C孵育lh，充分洗涤后加入TMB液反应5min，2mol/LH2S04终止反应，于波长490nm下测定每孔A值。通过与对照组比较，计算抗体效价，结果如表1所示。结果显示采用上述实施例所提供的方法制备的以HeAg蛋白或HBeAg抗原表位肽为免疫原的乙肝治疗性疫苗能够诱发 BALB/c小鼠产生高效价抗-HBe抗体。抗体效价从免疫后3周即开始升高，此后所免疫次数增加而继续升高，第4次免疫后一周，血清抗-HBe抗体效价ELISA检测结果如表1所示。可以看出在进行4次免疫之后，小鼠已经可以产生效价较高的抗体，这样就有利于实现HBeAg 血清转换，产生保护性抗-HBs抗体。表1 HBeAg蛋白/多肽疫苗免疫之后的血清抗体效价HBeAg蛋白/多肽疫苗类型抗原
剂量 (昭/只/次)
第4次免疫后血清抗-HBe抗体效价最低效价最高效价
铝佐剂-HBeAg蛋白疫苗 PLEG-HBeAg 疫苗纳米铝佐剂-HBeAg疫苗油包水型HBeAg纳米疫苗 PLGA-HBeAg纳米疫苗壳聚糖-HBeAg纳米疫苗
KLH-HBeAg多肽疫苗
HBeAg蛋白 HBeAg蛋白 HBeAg蛋白 HBeAg蛋白 HBeAg蛋白 HBeAg蛋白 HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN02) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN03) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN04) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN05) HBeAg抗原表位多肽
(SEQTDN06) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN07) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN08) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDN09) HBeAg抗原表位多肽
(SEQIDNOilO) HBeAg抗原表位多肽 (SEQIDNO:ll)
4000 8000 8000 8000 8000 8000
16000 32000 32000 32000 32000 32000
1:8000 >1:16000
1:8000 >1:16000
1:8000 >1:16000
1:8000 >1:16000
1:8000 >1:16000
1:8000 >1:16000
1:8000 >1:16000
1:8000 >1:16000
1:8000 >1:16000
1:8000 >1:16000


本发明公开了以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗，是由作为免疫原的HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽，与辅料混合而制成。本发明提出直接以HBeAg为免疫原，应用纳米技术制备乙肝治疗性HBeAg纳米疫苗的制备，以提高HBeAg的免疫原性和免疫效果，是实现HBeAg血清转换的最佳策略和直接途径。