一株产漆酶具有电化学活性的耐高温枯草芽孢杆菌的制作方法[0002]生物燃料电池是一种利用微生物产生电能的装置，即通过微生物或生物大分子(如酶)的催化作用，将生物质中的化学能转化为电能，在这个能量转化的过程中，微生物或生物大分子是产电的关键的因素也是限制因素。现在的产电菌主要是属于希瓦氏菌及铁杆菌属，产电菌的产电主要与蛋白或者酶或者其代谢中产生的具有电化学活性的物质有关系，因此利用现有的菌属，诱导其产生具有电化学活性的酶是一条比较有效的途径，此过程较从自然界中筛选菌可以大大缩短时间，且无需进行菌种鉴定等过程，可以大大减小成本。[0003]漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，它可以利用活性中心的铜离子催化氧化多种结构的芳香族化合物，同时将分子氧还原成水，在此过程中伴随着电子的传递。[0004]在自然界中，漆酶广泛存在于植物，动物，真菌和细菌中，目前主要是采用真菌来生产漆酶。但是由于细菌易培养，繁殖速度快且细菌漆酶较真菌漆酶有以下优点:耐酸碱，耐高温且稳定性好，引起了人们越来越多的关注。细菌漆酶主要有三种形式:胞内，胞外及细胞组成型漆酶。其中稳定性最好的为细胞组成型漆酶，细胞组成型漆酶通常是指芽孢菌属的漆酶，此类漆酶主要位于芽孢外膜上，由于芽孢对高温，高压及极端PH等逆性环境具有抗逆性，此类漆酶因此具有良好的温度计PH稳定性。因此细菌漆酶在工业上具有更好的应用前景。枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，在其生长过程中可以产生种类繁多的维生素，有机酸，氨基酸及蛋白酶，糖化酶，脂肪酶，漆酶等，有着广泛的用途。`
[0005]本发明的目的是提供一种株枯草芽孢杆菌经诱导后可以产生漆酶且具有电化学活性，该菌在高温下依然具有电化学活性且该菌可以将纤维素降解为糖类。[0006]本发明中诱导枯草芽孢杆菌产生漆酶的培养基为:蛋白胨10g/L，NaCl: 10g/L,酵母提取物:5g/L, CuS04.5H20: 1.6g/L,愈创木酚:1.6g/L。[0007]本发明中电化学活性的测定是采用循环伏安法。具体操作步骤为:1:取用诱导培养基培养20天的菌,3000r/min, IOmin,去上清,用灭菌的去离子水清洗沉淀,至少3次,直至上清颜色为无色。用去离子水按照0.lg/ml将所得的菌体沉淀悬浮。[0008]2:将I制备菌体悬浮液取5ul滴加到玻碳电极上，然后加IOul nafion溶液固定，置于65°C烘箱中30-60S使得菌体固定在玻碳电极上。
[0009]3:采用三电极体系进行电化学实验，2制备好的电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，碳棒为对电极。[0010]4:采用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液为反应体系，pH为4.68，扫描范围为-0.3—
0.8V，扫描速率为30mV/s。
[0011]本发明所提供的经诱导后可产生漆酶且具有电化学活性的枯草芽孢杆菌，操作方法简单，成本低。所制备的菌体悬浮液在高温下仍保持很好的电化学活性且可以有效的降解纤维素成为糖类。



[0012]图1是枯草芽孢杆菌诱导前后的循环伏安图。其中，a表示:诱导前的枯草芽孢杆菌，b表不:诱导后的枯草芽孢杆菌。
[0013]图2是诱导后的枯草芽孢杆菌在添加丁香醛联氮的缓冲液中的循环伏安图。其中a是诱导后的枯草芽孢杆菌在缓冲液中的循环伏安图，b是诱导后的枯草芽孢杆菌在添加有丁香醛联氮的缓冲液中的循环伏安图。
[0014]图3是经不同温度60°C，80°C，IOO0C，120°C处理3h后诱导的枯草芽孢杆菌的峰电
流曲线图。其中，a表示:氧化电流，b表示:还原电流。
具体实施方案
[0015]实施例1:未经诱导的枯草芽孢杆菌无电化学活性，图1枯草芽孢杆菌诱导前后的循环伏安图:a:诱导前的枯草芽孢杆菌，b:诱导后的枯草芽孢杆菌，说明经诱导后枯草芽孢杆菌具有电化学活性。
[0016]实施例2:丁香醛联氮可以作为电子中介体，以便实现漆酶和电极间的高效的电子传递。图2:诱导后的枯草芽孢杆菌在添加丁香醛联氮的缓冲液中的循环伏安图，a:诱导后的枯草芽孢杆菌在缓冲液中的循环伏安图，b:诱导后的枯草芽孢杆菌在添加有丁香醛联氮的缓冲液中的循环伏安图。从图中可以看出当添加有丁香醛联氮的时候，枯草芽孢杆菌的峰电流增加了 35 %。
[0017]实施例3:枯草芽孢杆菌可以耐高温，分别用60°C，80°C，IOO0C，120°C处理菌3h后测其电化学性能，图3经不同温度60°C，80°C，100°C，120°C处理后3h后诱导的枯草芽孢杆菌的峰电流曲线，a:氧化电流，b:还原电流。在经过高温处理后仍具有极好的电化学活性，经120°C处理后，其电化学性能仍有峰电流为室温下的25 %，但在60°C，80°C，100°C时其电化学活性几乎与室温时相同，说明该菌具有极好的热稳定性。
[0018]实施例4:纤维素是自然界中最丰富的可再生资源，但是由于纤维素特殊的晶体结构妨碍了纤维素的开发利用。将诱导后的枯草芽孢杆菌接种到含有以纤维素为唯一碳源的培养基中，培养10天后测培养基中还原糖的浓度可达到0.5g/L。