专利名称：高活性复合乳酸菌饮料及其制备方法乳酸菌广泛存在于人体的肠道中，是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，也是最具代表性的肠内益生菌。乳酸菌可以改变肠道内环境，抑制有害菌繁殖，调整胃肠道菌群平衡，改善肠道功能，在很大程度上缓解或治疗肠道疾病，并能提高人体免疫力，还具有抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、降血压的功效，还能有效降低癌症病发率。此外，乳酸菌还能够刺激肠道蠕动，不仅能够促进食物消化、营养物质吸收，还能够促进食物残渣及肠毒素等的排出，起到美容养颜、延年益寿的作用。因此，肠道内乳酸菌数量的多少，直接影响到人的健康与否，并影响到人的寿命长短。大量的临床试验及消费者多年的使用证明，绝大部分乳酸菌安全性高，无毒副作用。目前大部分乳酸菌发酵制品，尤其是酸奶、发酵乳等主要是利用保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌进行发酵，这两种菌在发酵过程中能产生相对较多的风味物质，使产品的气味和滋味较好。但是这两种菌对胃酸及胆汁的耐受カ较差，在通过胃肠道过程中，这两种菌几乎全部被胃酸及胆汁杀死，到达肠道的保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌几乎为零。再者，保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌不能在肠道内定植，进入肠道内能存活下来的极少量保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌很快便被排出体外，起不到真正的益生菌的作用。
本发明为解决现有技术的不足，通过乳酸菌的筛选和搭配，提供了高活性复合乳酸菌饮料及其制备方法。所述乳酸菌饮料活菌量高，耐胃酸、耐胆汁盐能力强，能在肠道内定植，因而能有效调整动物肠道环境，真正发挥益生菌的功能。本发明一方面涉及一种副干酪乳杆菌IMC-4 (Lactobacillus paracaseiIMC-4)，已于2012年5月21日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2012174。该菌株具有很强的耐胃酸、耐胆汁盐性能，且能在肠道内定植。申请人:经过大量的筛选，发现嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CGMCCI. 1854、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC :1. 103 和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CGMCC 1. 2435具有较强的耐胃酸、耐胆汁盐能力，而且这三种乳酸菌与上述副干酪乳杆菌协同作用，调节动物肠道健康的效果更佳，从而促成本发明。本发明另ー个方面涉及ー种高活性复合乳酸菌饮料，是以上述副干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌的混合菌液对原料发酵后加工制备的。上述的混合菌液中副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌的数量比为:1 3 :1 0. 5 I. 5 :0· 5 2，优选为1 1 0. 5 :1。上述的原料为奶粉、白砂糖和葡萄糖的水溶液，其中各原料的质量体积比浓度g/ml分别为奶粉1%_10%、白砂糖O. 5%-10%、葡萄糖O. 5%_5%。上述的高活性复合乳酸菌饮料还添加有水溶性膳食纤维、功能性寡糖、甜味剂和增稠剂等辅料。在乳酸菌饮料中的终浓度质量体积比g/ml分别为O. 5%-10%、0. 1%-2%、O. 01%-0. 5%、0· 05%-0. 5%O本发明还涉及另ー种高活性复合乳酸菌饮料，是用副干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌的混合菌液对乳酸菌饮料的原料和辅料的混合物发酵后加工制备的。 上述的混合菌液中副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌的数量比为:1 3 :1 0. 5 I. 5 :0· 5 2，优选为 3 1 0. 5 :2。上述的原料包括有红糖、糖蜜、白砂糖、葡萄糖和酵母粉，辅料包括有水溶性膳食纤维、功能性低聚寡糖、甜味剂和增稠剂。其中各组分的质量体积比g/ml分别为红糖O. 5% 10%、糖蜜O. 5% 5%、白砂糖O. 5% 10%、葡萄糖O. 5% 5%、酵母粉O. 05% 1%、水溶性膳食纤维O. 5% 10%、功能性寡糖O. 1% 2%、甜味剂O. 01% O. 5%、增稠剂O. 05% O. 5%。本发明通过对乳酸菌种的筛选与合理搭配，采用副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌混合发酵的方法制备得到高活性复合乳酸菌饮料，饮料出厂时活菌量高于5. OX 108CFU/ml。所述四种乳酸菌对胃酸、胆汁盐均具有很强的耐受性，能够在肠道中大量存活，再配以水溶性膳食纤维、低聚寡糖等营养成分，更能有效调节动物肠道健康，提高机体免疫力。(3)向上述收集沉淀的离心管中加入原上清等体积的人工胃液充分悬浮沉淀，37°C 水浴 30min ；(4)将上述悬液5000g离心IOmin收集沉淀，用PBS缓冲液反复洗涤两次收集沉淀；(5)向上述收集沉淀的离心管中加入原上清等体积的人工肠液充分悬浮沉淀，37°C 水浴 30min ；(6)将上述悬液5000g离心IOmin收集沉淀，用PBS缓冲液反复洗涤两次收集沉淀，最后用少量PBS缓冲液充分悬浮沉淀； (7)将上述悬液后涂布于添加碳酸钙的MRS培养基上，37°C培养24 48小时，挑取平板上带有透明圈的菌落分别划线接种到添加碳酸钙的MRS培养基上，37°C培养24 48小吋，重复操作几次得到的纯菌种进行保存。2、鉴定对上述筛选的乳酸菌分别进行耐胃酸、耐胆汁盐能力检测，对胃酸、胆汁盐耐性都相对较强的菌株进行分子生物学方法鉴定，测得其16S rDNA序列。其中耐性最強的菌株IMC-4的16S rDNA序列通过比对确认为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasoi),命名为副干酿乳杆菌 IMC-4 (Lactobacillus paracasei IMC-4)。将本发明的副干酪乳杆菌IMC-4 (Lactobacillus paracasci IMC-4)进行保藏，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日2012年5月21日，保藏号为CCTCC Ν0:Μ2012174。3、耐胃酸、耐胆汁盐性能检测(I)耐胃酸性能检测方法取活化后的菌悬液40ml加入50ml离心管中，离心(5000g、5min)收集菌体，用PBS洗涤两次后向离心管中加入40ml人工胃液，37°C水浴培养2h，每隔30min摇匀一次，于Oh和2h分别取样作活菌计数，以Oh样品为对照，计算2h样品菌体的存活率，存活率=(2h时的活菌数/Oh时的活菌数)X 100%。(2)耐胆汁盐性能检测方法取活化后的菌悬液40ml加入50ml离心管中，离心(5000g、5min)收集菌体，用PBS洗涤两次后向离心管中加入40ml人工肠液，37°C水浴培养2h，每隔30min摇匀一次，于0h、2h分别取样作活菌计数，以Oh样品为对照，计算2h样品菌体的存活率，存活率=(2h时的活菌数/Oh时的活菌数)X 100%。耐胃酸、耐胆汁盐性能检测结果如下表所示本发明提供了一种副干酪乳杆菌(Lactobacills paracasei)，是从健康成年人粪便中筛选分离出来的，保藏号CCTCC NO: M2012174。本发明还提供了利用上述副干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌混合发酵的方法制备得到的高活性复合乳酸菌饮料。该乳酸菌饮料出厂时活菌量可高达5亿/ml以上，可以在肠道中存活并达到较大数量，对于调理肠道健康和提高机体免疫力具有很好的效果。