一种可用于治疗神经元退行性病变的药物组合物的制作方法 [0001]【技术领域】，具体地涉及一种特异性诱导胶质细胞转化成神经元细胞的方法和组合物。[0003][0004]干细胞在生物医学领域中有着十分广阔的应用前景，胚胎干细胞具有全面分化的潜能，成为研究的热点。1997年英国科学家Wilmut等人将羊体细胞的细胞核转入去核的卵母细胞中并发育成成熟的个体——著名的多利羊，从而在实践中证实了体细胞逆转成为全能干细胞的可能性。2006年，日本科学家Takahashi和Yamanaka发现4个转录因子(0ct_4、Sox-2、Klf4和c-Myc)共同作用小鼠皮肤细胞后，能够成功的将其诱导逆转分化为可以向三个胚层分化的多能干细胞，2007年Takahashi和Yamanaka利用这四个转录因子成功的将人的表皮细胞诱导分化形成多功能干细胞。尽管Takahashi和Yamanaka的研究成为了干细胞研究领域中的一个里程碑，但在实际操作中必须经历从体细胞诱导获得多功能干细胞，再从多功能干细胞基础上定向分化为目的靶细胞，整个过程步骤多、周期长，失败率高，所分化的细胞还具有肿瘤形成的潜在危险，这些问题不利于该技术的推广和应用。[0005]2010年Wernig实验室首次在Nature上报道了通过fcn2、Ascll和Mytll三个因子将小鼠的体细胞直接诱导获得具有功能性的类似神经元细胞，开启了神经科学领域的研究的新篇章。2011年Wernig实验室通过Brn2、Ascll、Mytll和NeuroDl四个转录因子,将人的成纤维细胞诱导形成功能性神经元细胞。这些研究简化了从体细胞诱导到多功能干细胞再定向分化为神经元的繁`琐途径，为神经生物学研究提供了更为有效的工具。[0006]帕金森病主要是因位中脑部位〃黑质〃区中的神经元细胞发生病变，多巴胺的合成减少、抑制乙酰胆碱的功能降低而造成的，病变之后，神经元数量减少、功能下降，该区域将会被胶质细胞所“占领”，如果能够让这些胶质细胞再变回为神经元细胞，那么也许对于帕金森病的治疗有一定的帮助作用。[0007]综上，本领域迫切需要开发简便有效诱导胶质细胞形成神经元的方法和组合物。
[0008]


[0009]本发明目的为提供一种简便有效的诱导形成神经元的方法和组合物。
[0010]
在本发明的第一方面，提供了一种MytlL基因或MytlL蛋白的用途，用于制备诱导胶质细胞形成神经元的组合物；或制备治疗神经退行性疾病的组合物。
[0011 ] 在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。[0012]在本发明的第二方面，提供了一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒具有以下特征:
(a)携带外源的MytlL的编码序列；
(b)可感染胶质细胞，并且在胶质细胞中表达外源的MytlL转录因子。
[0013]在另一优选例中，所述的MytlL来源于人。
[0014]在另一优选例中，所述的假病毒颗粒选自下组慢病毒、腺病毒、疱疹病毒、或痘病毒。
[0015]在另一优选例中，所述的假病毒颗粒是如下制备的:
将携带MytlL的编码序列的载体导入假病毒颗粒的包装细胞中，从而形成假病毒颗粒。
[0016]在本发明的第三方面，提供了一种表达盒，所述表达盒从5’至3’依次包括以下元件:
胶质细胞特异性的启动子、MytlL的编码序列、终止密码子。
[0017]在另一优选例中，所述的胶质细胞特异性的启动子包括:GFAP启动子(GFAP，胶质纤维酸性蛋白)和HRE-GFAP杂合启动子(HRE，低氧反应元件)。
[0018]在另一优选例中，MytlL来源于哺乳动物，优选人。
[0019]在本发明的第四方 面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第三方面中所述的表达盒。
[0020]在另一优选例中，所述的表达载体包括质粒、病毒载体。
[0021]在另一优选例中，所述的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、疱疫病毒载体、痘病毒载体、或腺相关病毒载体。
[0022]在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物包括(i)药学上可接受的载体以及(ii)本发明第四方面所述的表达载体或本发明第二方面所述的假病毒颗粒。
[0023]在本发明的第六方面，提供了一种本发明第四方面所述表达载体或本发明第二方面所述的假病毒颗粒的用途，它们被用于制备诱导胶质细胞形成神经元的组合物；或制备治疗神经退行性疾病的组合物。
[0024]在本发明的第七方面，提供了一种诱导胶质细胞形成神经元细胞的方法，包括步骤:
在外源MytlL蛋白存在下，培养胶质细胞，从而诱导胶质细胞形成神经元细胞。
[0025]在另一优选例中，所述的外源MytlL蛋白包括在培养体系中添加的MytlL蛋白，或在所述胶质细胞内表达外源MytlL编码序列而产生的外源MytlL蛋白。
[0026]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
[0027]



[0028]图1显示了用于构建MytlL慢病毒载体的载体FUGW的结构图。
[0029]图2显示了被MytlL慢病毒感染后的U251细胞的明视野图。[0030]图3显示了被MytIL慢病毒感染后的U251细胞的荧光野图，结果说明被感染的细胞已经表达Tujl蛋白。
[0031]图4显示了被MytlL慢病毒感染后的U251细胞的DAPI染色图，说明细胞核处被染色。
[0032]图2-图4结果显示，被感染的细胞已经表达神经特异性蛋白Tujl。
[0033]

[0034]本发明人经过长期深入的研究，首次意外地发现，MytlL单基因可有效地诱导胶质细胞形成神经元细胞。本发明人将MytlL基因构建在病毒载体上，包装获得带有MytlL的假病毒颗粒，并通过MytlL假病毒颗粒感染胶质细胞后，经过一段时间的培养，即可将胶质细胞诱导分化为神经元细胞。在此基础上，完成了本发明。
[0035]启动子
在本发明中，可用的启动子没有特别限制，为一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，有与MytlL模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。可以选自组成性因子、诱导性因子和组织特异性因子。更佳地为组织特异性启动子，如胶质细胞特异性启动子，可在胶质细胞中特异性启动遗传物质的转录。 MytlL基因和蛋白
MytlL,髓磷脂转录因子样蛋白，作为一个转录因子，参与神经细胞的分化；中央神经系统中在神经元和少突神经胶质细胞的发育过程中起到关键作用。
[0036]基因名称:MYT1L物种:人源；转录本的Genbank编号:NM_015025。
[0037]MYTlL的氨基酸序列的登录号为NP_055840，具体序列如下:
MEVDTEEKRH RTRSKGVRVP VEPAIQELFS CPTPGCDGSG HVSGKYARHR SVYGCPLAKK60
RKTQDKQPQE PAPKRKPFAV KADSSSVDEC DDSDGTEDMD EKEEDEGEEY SEDNDEPGDE120
DEEDEEGDRE EEEEIEEEDE DDDEDGEDVE DEEEEEEEEE EEEEEEENED HQMNCHNTRI180
MQDTEKDDNN NDEYDNYDEL VAKSLLNLGK IAEDMYRAR TESEMNSNTS NSLEDDSDKN240
ENLGRKSELS LDLDSDVVRE TVDSLKLLAQ GHGVVLSENM NDRNYADSMS QQDSRNMNYV300
MLGKPMNNGL MEKMVEESDE EVCLSSLECL RNQCFDLARK LSETNPQERN PQQNMNIRQH360
VRPEEDFPGR TPDRNYSDML NLMRLEEQLS PRSRVFASCA KEDGCHERDD DTTSVNSDRS420
EEVFDMTKGN LTLLEKAIAL ETERAKAMRE KMAMEAGRRD NMRSYEDQSP RQLPGEDRKP480
KSSDSHVKKP YYDPSRTEKK ESKCPTPGCD GTGHVTGLYP HHRSLSGCPH KDRVPPEILA540
MHESVLKCPT PGCTGRGHVN SNRNSHRSLS GCPIAMEKL AKAQEKHQSC DVSKSSQASD600
RVLRPMCFVK QLEIPQYGYR NNVPTTTPRS NLAKELEKYS KTSFEYNSYD NHTYGKRAIA660
PKVQTRDISP KGYDDAKRYC KDPSPSSSST SSYAPSSSSN LSCGGGSSAS STCSKSSFDY720
THDMEMHMA ATAILNLSTR CREMPQNLST KPQDLCATRN PDMEVDENGT LDLSMNKQRP780
RDSCCPILTP LEPMSPQQQA VMNNRCFQLG EGDCWDLPVD YTKMKPRRID EDESKDITPE840
DLDPFQEALE ERRYPGEVTI PSPKPKYPQC KESKKDLITL SGCPLADKSI RSMLATSSQE900
LKCPTPGCDG SGHITGNYAS HRSLSGCPRA KKSGIRIAQS KEDKEDQEPI RCPVPGCDGQ960
GHITGKYASH RSASGCPLM KRQKDGYLNG SQFSWKSVKT EGMSCPTPGC DGSGHVSGSF 1020LTHRSLSGCP RATSAMKKAK LSGEQMLTIK QRASNGIEND EEIKQLDEEI KELNESNSQM 1080
EADMIKLRTQ ITTMESNLKT IEEENKVIEQ QNESLLHELA NLSQSLIHSL ANIQLPHMDP 1140
INEQNFDAYV TTLTEMYTNQ DRYQSPENKA LLENIKQAVR GIQV1184
(SEQ ID N0.:1)
应理解，在本发明中，术语“MytlL基因和蛋白”不仅包括野生型和突变型的MytlL基因和蛋白，还包括MytlL蛋白的活性片段或活性衍生蛋白(以及相应的编码序列)，只要所述活性片段或活性衍生蛋白仍具有野生型MytlL蛋白的基本功能(例如保留> 50%, ^ 70%以上野生型MytlL蛋白活性)。
[0038]MytlL基因可用常规方法(如PCR或全合成)获得，然后导入载体，转入宿主细胞，从而表达获得MytlL蛋白。此外，MytlL基因或克隆还可购买获得，例如可购自OriGene公司(货号SC304207)购得。
[0039]病毒载体
在本发明中，一种优选的载体是病毒载体。本发明的病毒载体可以将胶质细胞直接诱导形成神经元。
[0040]用于本发明的病毒载体没有特别限制，可以是任何能够利用病毒具有传送其基因组的特点，将遗传物质带入其他细胞，进行感染的病毒载体。可发生于完整活体或是细胞培养中。包括慢病毒载体、腺病毒载体、疱疫病毒载体、痘病毒载体、腺相关载体。
[0041]—种优选的病毒载体是慢病毒载体。在本发明的一个实例中，通过PCR技术将MytlL基因构建到FUGW慢病毒载体上，从而形成FUGW-MYT1L慢病毒载体。
[0042]一种特别优选的病毒载体是假病毒颗粒。在本领域中，制备假病毒颗粒的方法是本领域技术人员熟知的，例如采用包装细胞来生产假病毒颗粒。
[0043]在本发明的一个实例中，一种MytlL慢病毒载体的包装方法包括:将载体系统中的FUGW-MYT1L慢病毒载体、pCMV_dR8.2 dvpr载体和pCMV_VSV_G载体共同转染宿主细胞后，即可在宿主细胞中包装获得MYTlL慢病毒颗粒。宿主细胞为293T细胞。
[0044]体外诱导方法
本发明还提供了一种体外的、非治疗性的将胶质细胞直接诱导成神经元的方法。一种通过MytlL慢病毒颗粒诱导胶质细胞的方法包括步骤:通过MytlL慢病毒感染胶质细胞,感染后的细胞维持培养20天以上，从而形成神经元。
[0045]经诱导所形成的神经元细胞，可通过免疫荧光进行检测，例如，用神经元特异性蛋白Tujl的抗体来检测，从而鉴别出神经元细胞。
[0046]药物组合物以及给药方式
本发明还提供一种可用于将非神经元细胞(如胶质细胞)诱导形成神经元的组合物。本发明的药物组合物还可治疗或预防神经退行性疾病。
[0047]本发明药物组合物包括本发明上述的表达载体或假病毒颗粒和药学上可接受的载体。
[0048]在本发明的药物组合物，通常含有106_1012PFU/ml的假病毒颗粒，较佳地107-1012PFU/ml的假病毒颗粒，更佳地IO9-1O11 PFU/ml的假病毒颗粒。
[0049]“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0050]术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
[0051]通常，将所述表达载体或假病毒颗粒和药学上可接受的载体混合后，即可获得的本发明的药物组合物。
[0052]本发明所述的组合物的给药方式没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于):静脉注射、皮下注射、脑部注射等。
[0053]本发明的有益效果包括:
1.本发明仅需包装MytlL —个转录因子至病毒载体，即可将胶质细胞诱导分化成神经元细胞，解决了只有将多个转录因子导入载体才能获得功能性神经元的步骤。
[0054]2.本发明简化了将体细胞诱导为多功能干细胞，再定向分化为神经元的繁琐途径。
[0055]3.启动子为胶质细胞识别特异性启动子，遗传物质的转录仅在胶质细胞中进行，避免了感染其他细胞的可能。
[0056]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0057]实验材料 1.载体:
载体名称:FUGW(购自Addgene公司，货号14883)
兀件顺序:Ubiquitin promoter-MCS-GFP-ffRE 克隆位点:BamHI / AgeI 载体图谱:如图1所示。
[0058]2.扩增引物:
正向:
aggtcgactc tagaggatcc cgccaccatg gaggtggaca ccgaggagaa gcggcat (SEQ ID N0.: 2)
反向:
agtccatggt ggcgaccggg acctgaattc ctctcacagc ctgcttta (SEQ ID N0.: 3)
3.细胞
3.1.293T 细胞:
购自美国ATCC。细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，细胞密度为
1.2 X IO7细胞/20ml (0.6 X IO9 /L)时，重新接种于15cm的细胞培养皿，37°C、5%C02培养箱内培养，细胞密度达70%~80%时转染。转染24h前将细胞培养基更换为无血清培养基。
[0059]胶质细胞U251: 购自美国ATCC。用胰蛋白酶消化对数生长期的U251细胞，细胞密度为1.2X IO7细胞/20ml (0.6 X IO9 /L)时，重新接种于24孔的细胞培养皿，37°C、5% CO2培养箱内培养。[0060] 实施例1
MytlL慢病毒载体的构建:
(I)以通过MYTlL cDNA克隆为模板，通过扩增引物进行PCR反应，扩增获得大小3.5 Kb左右的PCR产物。
[0061 ] (2)对PCR产物和病毒载体进行BamHI和AgeI的双酶切。
[0062](3)过T4 DNA连接酶(购自Takara公司)连接后进行转化反应。
[0063](4)通过对转化子的鉴定，挑选阳性克隆送测，以测序序列和预期序列一致的作为正确克隆，命名为FUGW-MYT1L慢病毒载体。
[0064]实施例2
MytlL慢病毒载体的包装:
(I)制备慢病毒包装系统中3种质粒的DNA溶液(FUGW-MYT1L慢病毒载体20iig，pCMV-dR8.2 dvpr 载体(购自 Addgene) 15 u g, pCMV-VSV-G 载体(购自 Addgene) 10 u g,与相应体积的Opt1-MEM混合均匀稀释，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟。
[0065](2)取 100 u lLipofectamine2000 (购自 invitrogen)试剂在另一管中与 2.4mlOpt1-MEM(购自Invitrogen)混合稀释,在室温下温育5分钟。
[0066](3)把(I)中所述稀释后的DNA与(2)中所述稀释后的Lipofectamine2000进行混合，5分钟内轻轻地颠倒混匀。室温下温育20min。
[0067](4)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37°C、5%C02细胞培养箱中培养。培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
[0068](5)每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25ml，于37°C、5%C02培养箱内继续培养48小时。
[0069](6)收集转染48小时后的293T细胞上清液。于4°C，4000g离心lOmin，除去细胞碎片。以0.45 m滤器过滤上清液于40ml超滤离心管(购自Millipore)中。把病毒粗提液样品加入到过滤杯中并盖上盖子，将过滤杯插到滤过液收集管中。组合好后，做好平衡，放在转头上。在4000g离心约10-15分钟。离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。
[0070](7)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80度长期保存。所获得的病毒命名为MYTlL慢病毒颗粒。
[0071]实施例3
MytlL慢病毒诱导胶质细胞；
(I)当胶质细胞U251密度达50%~60%时进行病毒感染，感染前将细胞培养基更换为
无血清培养基。
[0072](2)根据U251细胞的MOI值(M0I=5)，加入适宜量的MYTlL慢病毒(加入病毒数=细胞数X MOI值)。12h后观察细胞状态:如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基。
[0073](3)培养基更换:当U251细胞被MYTlL慢病毒感染后三天时，使用带有N27因子(Invitrogen, 17504-044,)的 Neurobasal 培养基(Invitrogen, 12348-017)逐步替换原有的培养基。替换方法，每次保留1/2的原有培养基，加入1/2的新鲜的带有N27因子的Neurobasal培养基，每三天更换一次培养基，确保细胞生长状态良好。
[0074](4)细胞维持:病毒感染后的U251细胞需要持续培养20天以上，在此期间需要对细胞进行定期换液。
[0075]实施例4
对所诱导的神经元细胞的免疫荧光检测；
将持续培养20天以上的感染后U251细胞进行免疫荧光实验，实验步骤如下:
(1)洗涤:用TBS轻轻清洗细胞，洗三次，以去除细胞中的杂质； (2)固定步骤:新鲜配好的4%多聚甲醛固定常温20分钟；
(3)洗涤:预冷的TBS洗三遍，每遍5分钟；
(4)透膜:吸干液体，用0.2% Triton-X室温10分钟。
[0076](5)洗涤:TBS洗三遍，每遍5分钟；
(6)封闭:加200 μ? 2% BSA，室温I小时。
[0077](7) 一抗孵育:β 3-Tubulin (TU-20) Mouse mAb (Cell SignalingTechnology, #4466)，加 ΙΟΟμΙ—抗(1:200),用 1%BSA 配抗体，4 度过夜，或者 37 度 2 小时。
[0078](8)洗涤:洗一抗，TBS每次10分钟，洗三次，注意:一定要覆盖玻片表面，尽量洗干净。
[0079]以下步骤均在暗室操作
(9)二抗孵育:(暗室操作)Alexa Fluor 546 Donkey Ant1-Mouse IgG (Invitrogen,A10036)，加ΙΟΟμΙ 二抗(1: 500)，闭光，室温孵育I小时。
[0080](10)洗涤:(暗室操作)洗二抗，TBS每次10分钟，洗三次，注意:一定要覆盖玻片表面，尽量洗干净，避光。
[0081](11)封片:(暗室操作)用VECTASHIELD?的DAPI染色剂(4’，6- 二脒基-2-苯基口引哚4’，6-diamidino-2-phenyI indole,是一种能够与DNA强力结合的突光染料)(H-1200)(3 ng/mL)，室温10分钟；注意:尽量不要有气泡；玻片放上后就不能再移动。
[0082](12)拍照:使用荧光显微镜拍照:
MYTlL慢病毒感染后的U251细胞，再维持20天左右时，通过神经元特异性蛋白Tujl的免疫荧光实验，结果表明U251细胞已经表达TujI蛋白，并且Tujl阳性细胞具有80%以上，说明此时的U251细胞已经具备了神经元的特性，如图2-4。而未感染MYTlL慢病毒的U251细胞则无法检测到Tujl的表达。
[0083]这表明，MYTlL慢病毒感染胶质细胞后，可以诱导胶质细胞表达神经元特异性蛋白，使得所诱导的胶质细胞具备了神经元特性。
[0084]实施例5
构建胶质细胞中特异性表达的表达盒和载体
GFAP启动子和HRE-GFAP杂合启动子是已知的可在胶质细胞中特异性表达的启动子。在本实施例中，以构建好的FUGW-MYT1L慢病毒载体为基础，构建胶质细胞特异表达的慢病毒载体。具体的方法如下:
FUGff-MYTlL载体中用于启动MYTlL的ubiquitin启动子从载体中通过酶切的方法切除，插入PCR扩增获得的胶质特异性启动子-GFAP启动子或HRE-GFAP启动子，从而获得含有以下表达盒的MYTlL慢病毒载体:(a)GFAP启动子-MytlL的编码序列-终止密码子；
(b)HRE-GFAP杂合启动子-MytlL的编码序列-终止密码子。
[0085]所述的表达盒可在胶质细胞中特异性表达MytlL蛋白。
[0086]测试结果表明，含该组织特异性表达盒的慢病毒载体感染胶质细胞后，同样可诱导胶质细胞表达神经元特异性蛋白(Tujl蛋白)，使得所诱导的胶质细胞具备了神经元特性。此外，该含该组织特异性表达盒的慢病毒载体感染表皮细胞后，不表达外源的MytlL蛋白。
[0087]讨论:
本发明提供了一种特异性诱导胶质细胞分化形成神经元的方法，具体地，首先将MytlL基因构建在病毒载体上，包装获得带有MytlL的假病毒颗粒，并通过MytlL假病毒颗粒感染胶质细胞后，经过一段时间的培养，即可将胶质细胞分化为神经元细胞。神经退行性疾病是由于神经元衰老和死亡后胶质细胞占据了主导地位，从而阻断了神经元之间的电生理反应。MYTlL慢病毒可以将胶质细胞诱导形成神经元细胞，MYTlL病毒载体在神经退行性疾病(例如帕金森病等)的治疗中具有潜在价值，通过将胶质细胞诱导为神经元后将中断的神经网络进行修复，从而减轻病人的痛苦。
[0088]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范
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