复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物的制作方法[0002]蚂蚁的功效早在《本草纲目》中就有记载，本草纲目中黑蚂蚁称“玄驹”。具有除风、祛湿、平气、养心、调血通经、舒脉之效。科学研究表明:蚂蚁体内含有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等多种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸，蛋白质含量高达40-60%，单不饱和类脂肪酸占脂肪酸(MUFA)的70%以上，多不饱和脂肪酸(PUFA)在蚁后体内达到964mg/100g，含有丰富的维生素B1、B2、B3、C、D、E等，富含的微量元素锌、铁、硒、磷、钙等确保了多种酶的活性。另外，蚂蚁体内含有丰富的醛酸成分，柠檬醛在蚂蚁头部上颚腺中以反式和顺式混合体的形式存在。每一个蚂蚁头部中两种同分异构醛类含量可以达到40mg之多，香茅醛和柠檬醛以大约9: I的比例在蚂蚁头部上颚腺中存在，起到防御保护功能。最近的研究发现，柠檬醛的抗氧化活性比抗坏血酸Vitamin C高，而天然柠檬醛和香茅醛的抗菌、抗炎症、抗肿瘤等药理活性，也使其成为其药品研究的新原料；蚂蚁的众多品种中，拟黑多刺蚁，尤以优质著称。研究表明，其含蛋白56.6± 10.8 %，含维生素E2.6± 1.8mg/kg和77000IU/100g超氧化物歧化酶(SOD)等过氧化物酶(P0D)。超氧化物歧化酶能够催化过氧阴离子发生歧化反应、清除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，如自由基等，因此有不可多得的抗炎、抗癌、抗辐射、抗衰老、抗自由基作用。拟黑多刺蚁含总醛酸1.6%，其中18烯酸、蚁酸、柠檬醛、香茅醛、香茅酸含量丰富，而多刺属蚂蚁酸具有靶向性抗风湿因子，是一种有效的免疫抗衰老剂，使退化的胸腺增生、免疫细胞数增多，其具有调节失调的免疫功能调理平衡作用和抗氧化和抗衰老方面的功效，因此蚂蚁药物在类风湿关节炎、哮喘等方面已经得到应用。[0003]近年来，我国各地制成蚂蚁粉，蚁丸，蚁片，蚁酒，胶囊等食用补品和药品，部分蚂蚁制品己进入国际食品市场。然而，蚂蚁的有效成分，特别是蚂蚁体内中的天然的抗衰老柠檬醛、香茅醛、蚁酸等醛酸类物质结合其体内天然的SOD酶成分进入皮肤用抗衰老护肤品的应用尚未被挖掘。[0004]动物胎盘含有丰富的营养成分，胎盘的羊膜、叶状绒毛膜部分有大量的免疫球蛋白、含量丰富的氨基酸，丰富的卵磷脂，脑磷脂，脂多糖，多种维生素和微量元素，对于皮肤细胞的老化可起到良好的改善作用。[0005]鉴于上，我们从优质蚂蚁中提取了蚂蚁醛酸精华和抗氧化酶，从胎盘中提取出活性低分子细胞生长因子和低分子胶原水解多肽，利用这两类生物活性物质最佳配比制备出了本发明的组合物，这是一种激发皮肤自身干细胞增殖、补充营养、抗氧化、抗衰老的护肤新组合物。
[0006]本发明的目的是制备出一种用于生物技术、美容化妆品和皮肤再生、抗衰老行业的复合抗衰老护肤组合物。[0007]本发明提供了一种含有蚂蚁醛酸和抗氧化酶提取物与胎盘低分子活性多肽组合物。可以起到促进皮肤干细胞增殖的再生作用，对皮肤进行营养补充，增加皮肤弹性，并起到抗皮肤氧化、抗衰老的作用。[0008]一种复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，由以下物质组成:蚂蚁精华提取物0.3-3g/100ml、胎盘活性小分子多肽提取物0.6_6g/100ml，乙醇5-15ml/100ml，其余为水。
[0009]所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的蚂蚁精华提取物，采用黑蚁、红蚁、白蚁、和野生、春秋两季捕捉的黑多刺蚁。拟黑多刺蚁，又称鼎突多刺蚁，分类上属于节肢动物门，昆虫纲，膜翅目，蚁科，蚁亚科，多刺蚁属。
[0010]所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的蚂蚁精华提取物由以下方法制备取得:蚂蚁用蒸馏水洗净、干燥、低温研磨成粉，采用99.5%纯度乙醇加水配制成30-70%乙醇在10-20°C条件下进行浸泡加震荡提取3-5小时后，再在冰浴条件下超声波萃取30-60分钟，收集提取液，加蒸馏水在冰浴中再次对蚂蚁残体超声浸提30-60分钟，将两部分提取液合并，1500-2500rpm离心去不溶沉淀物后，得到蚂蚁精华提取物。
[0011]所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的蚂蚁精华提取物中包括蚂蚁醛酸成分0.3-2g/100ml，超氧化物歧化酶S0D10000-100000IU/ml。
[0012]所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的胎盘活性小分子多肽提取物使用的胎盘为足月哺乳动物健康胎盘，取用部位为胎盘的羊膜、绒毛膜部分，其中样本按照重量比为羊膜:绒毛膜=I: 4-1: 10，最佳1: 4。
[0013]所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，所述的胎盘活性小分子多肽提取方法为:将动物胎盘组织在无菌情况下，用组织剪机械剪碎成< 0.5mm3组织块，组织块采用胰蛋白酶胶原酶10.01-0.1 %和胶原酶110.01-0.1%在37°C下持续震荡水解2-8小时，4°C 5000-14000rpm离心15min，去沉淀后获得胎盘粗提取物，粗提物经Sephadex G-100 凝胶色谱柱层析柱分离，BSA (66kDa), > carbonic anhydrase (29kDa)和aprotinin(6.5kDa)作为分子量标志，右旋糖酐蓝(200kDa)为色谱柱孔体积标志，洗脱液为pH7.6、0.2M的NaH2PO4-NaHPO4缓冲液，洗脱速度控制在0.2—0.5ml/min,利用分光光度计监测蛋白流出情况，分段收集在10-66Kda的流出组分，蒸馏水透析去盐分，获得胎盘活性小分子多肽提取物。在最终组合物中，哺乳动物胎盘多肽提取物0.6-6g/100ml，其中有10-35KDa活性生长因子0.01-0.2g/100ml，和l_20KDa低分子水解胶原多肽0.l_5g/100ml。
[0014]所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，蚂蚁提取物与胎盘低分子活性多肽提取物比例为1: 2-1: 3;其中，蚂蚁提取物0.3-3g/100ml，包括通过低温提取获得的蚂蚁醛酸0.l_2g/100ml，超氧化物歧化酶S0D10000-100000IU/ml ;哺乳动物胎盘多肽提取物0.6-6g/100ml，其中有10_35KDa活性生长因子0.01-0.2g/100ml,
l-20KDa低分子水解胶原多肽0.l-5g/100ml。
[0015] 上述技术方案之一所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，在制作抗衰老水剂、乳剂、霜剂，化妆水、日霜、晚霜、眼霜、面膜、洗面奶、防晒霜、手霜、精华素、隔离霜方面的应用。
[0016]上述技术方案之一所述的复合蚂蚁精华和胎盘低分子活性多肽的抗衰老护肤组合物，在制作具有刺激皮肤细胞生长、加速新陈代谢、刺激自身干细胞再生、补充流失的胶原等蛋白成分，在抗衰老作用的护肤品方面的应用，对刚开始形成的细微皱纹起到淡化、补充营养、消除岁月痕迹作用。
[0017]有益效果:
[0018]本发明的复合抗衰老护肤组合物用于减少表皮角质细胞程序化死亡:
[0019]将本发明组合物以1%的最终重量比添加到Gibco K-SFM无血清培养基培养中培养人角质细胞keratinocytes，培养体系中不含本组合物培养组作为对照，培养到80%铺满培养瓶底部后，分别以无钙镁的PBS将培养基洗净，采用0.05% -0.02%的胰酶-EDTA37°C消化5分钟后，吹打、分散后形成单细胞液,并离心获得角质细胞样本，配成I X 106/ml细胞浓度。两组样本各有6个平行样本，细胞样本用Tris-HCl Triton裂解液4°C裂解过夜后，13000rpm离心获取上清液，以lmg/ml蛋白浓度进行SDS-Page并鼠抗人caspase3进行蛋白印记标记试验，转膜、抗体标记、曝光后，将膜上的抗体剥除后，再进行actin标记试验,actin作为内参,绘制caspase3在两组细胞中的表达如图1所示，在接种量相同的情况下，添加本组合物的实验组中细胞分泌的caSpaSe3含量比对照组明显降低，因此组合物有保护表皮细胞、减少其变少、凋亡的作用。 [0020]本发明的复合抗衰老护肤组合物用于影响人真皮成纤维细胞生长速度:
[0021]正常成人成纤维细胞ATCC? PCS-201-012以IX IO4细胞接种密度在24孔板内培养，以GIBICO公司DMEM加10%小牛血清为基础培养基，并添加新鲜的L-Glutamine，实验组添加3%本组合物，每组接种24个孔进行平行试验，每3天换液一次。培养过程中可选择加入100U/ml青霉素和100U/ml链霉素控制微生物的污染，培养条件在37°C 5% CO2培养箱中恒温进行，每天对每组6个孔进行胰酶-EDTA消化，记录生长的细胞数目，绘制生长曲线，见图2。从结果看出(Prism5统计分析，t-test),组合物可以刺激成纤维细胞的增殖，加组合物的试验组中成纤维细胞对数期生长速度快，最终获得的细胞数量比未加组合物的对照组有明显的增长(P < 0.05)，因此本组合物化妆品具有明显促进细胞新陈代谢作用。
[0022]本发明的复合抗衰老护肤组合物用于降低人真皮成纤维细胞倍增时间:
[0023]正常成人成纤维细胞ATCC? PCS-201-012以0.8 X IO4细胞接种密度在24孔板内培养，以GIBICO公司DMEM加12%小牛血清为基础培养基，并添加新鲜的L-Glutamine，实验组添加2.5%本组合物，每组接种24个孔进行平行试验，每3天换液一次。培养过程中可选择加入100U/ml青霉素和100U/ml链霉素控制微生物的污染，培养条件在37°C 5% CO2培养箱中恒温进行，一共培养6-8天，每天对每组6个孔进行胰酶-EDTA消化，记录生长的细胞数目，根据公式DT = t ~k Ig2/(IgNt-1gNo)计算倍增时间(其中DT是倍增时间，t是培养小时，Nt为t时间的细胞总数，No为接种时的细胞总数。
[0024]统计分析表
[0025]