一种增强大菱鲆免疫力的中药组合物的制作方法【技术领域】[0001]本发明属于海洋鱼类药物【技术领域】，具体涉及一种增强大菱鲆免疫力的中药组合物及其制备方法。 [0002]大菱鲆隶属于鲽形目，鲆科，菱鲆属，是一种冷水底栖海水鱼类,原产于大西洋东北部、北海、地中海及波罗的海等海域。大菱鲆因具有肉质好，营养价值高，生长快，适合低水温生活，养殖效益高以及深受消费者喜爱等优点而相继成为各国开发的优质海水养殖鱼类之一。虽然我国人工养殖大菱鲆要比欧洲晚4-5年，但近几年我国大菱鲆的年产量已经达到每年2万吨以上，年产值突破20亿，是中国北方地区的主要海水养殖品种之一。然而随着养殖规模的扩大和水体环境的恶化，各种疾病所造成的危害也逐渐为养殖户和水产专家所重视。其中以细菌性疾病危害最为严重。国内外报道的大菱鲆细菌性病原中主要包括鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harvey)、灿烂弧菌(Vibriosplendidus)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)等多种弧菌病。弧菌病中最具有代表性的是鳗弧菌病，其毒力最强，可造成大规模的大菱鲆幼苗和成鱼的死亡。[0003]鳗弧菌是大菱鲆病原菌中危害最大的病原菌，在世界范围内流行。鳗弧菌在自然界中分布十分广泛，是水环境中的正常菌群，当水温较高营养成分很丰富时，其数量会急剧增加，会引起水产动物特别是鱼类的流行性疾病。鳗弧菌可导致大菱鲆成鱼和鱼苗的急性败血症，最后导致病鱼的大规模死亡。其主要是通过皮肤、鳃、侧线以及肠道感染鱼类，感染后的大菱鲆最明显的症状是体表溃烂及鳍部严重出血，病鱼通常在2-3天内死亡。[0004]而目前水产养殖中对鱼类疾病的预防与治疗主要的是使用各种化学药物和抗生素。鱼类养殖过程中长期用药使得病菌耐药性增强，大量抗生素的使用还会使鱼类的免疫能力下降，同时水产品中残留的药物也严重影响食品的安全和人类的健康。Duff (1942)首次应用灭活的杀鲑气单胞菌口服免疫硬头鳟获得成功，从而开创了疫苗在鱼类应用上的新纪元。进入70年代后，各种免疫制剂被相继研制出来，比如鳗弧菌疫苗，草鱼出血病疫苗，甲鱼细菌病疫苗等。目前鱼类疫苗种类较多，但由于某些疫苗因其制备方法或病原菌的特殊性，导致其免疫原性较弱，免疫后保护效果不佳。因此在研制疫苗时是需要配合闻效的佐剂使用。[0005]应用中草药作为免疫增强剂不但可以解决化学药物、抗生素等引发的抗(耐)药性和养殖鱼类药残超标等问题，而且符合发展无公害渔业、生产绿色水产品的需求。国内外很多学者研究证明，中草药免疫增强剂可明显增强水产动物的抗病能力。如有研究黄芪多糖，牛膝、板蓝根等复方，皂角苷等对大菱鲆有增强免疫作用，但没有针对大菱鲆的鳗弧菌疫苗应用来提高免疫力的报道。
[0006]本发明的目的是提供一种增强大菱鲆免疫力的中药组合物，及该组合物的制备方法，本发明制备的中药组合物临床应用效果好、成本低、纯中药制剂、无残留，具有较好的应用前景。[0007]本发明增强大菱鲆免疫力的中药组合物，包括如下重量份的原料药:紫锥菊80~120份、获茶40~60份、白花蛇舌草30~50份、板蓝根30~50份。
[0008]上述的中药组合物用于制备用于增强大菱鲆免疫力的佐剂；
[0009]所述的佐剂为固体或液体状态，
[0010]固体形态的制备方法，是将紫锥菊、茯苓、白花蛇舌草、板蓝根，粉碎成细粉制得；
[0011]固体形态的佐剂的另一种制备方法，是取紫锥菊、茯苓、白花蛇舌草、板蓝根，加12倍量水，加热沸腾提取2次，每次1.5小时，滤过，滤液减压浓缩至60°C时测定相对密度为1.30~1.35，减压干燥粉碎制得；
[0012]液体形态的制备方法:取紫锥菊、茯苓、白花蛇舌草、板蓝根，加12倍量水，加热沸腾提取2次，每次1.5小时，滤过，滤液减压浓缩至60°C时测定相对密度为1.10~1.15，过滤制得:[0013]实际应用中，可分别根据不同情况选择药材细粉、提取物细粉或提取液来联合鳗弧菌疫苗应用。可采用注射、浸泡、口服等方式给药。
[0014]本发明的中药组合物主要用于联合鳗弧菌疫苗应用，以提高大菱鲆的免疫力
[0015]本发明中药组合物选用了紫锥菊、茯苓、白花蛇舌草、板蓝根四味药材，主要用于联合鳗弧菌疫苗以提高大菱鲆的免疫力。本发明中药组合物和鳗弧菌疫苗联用后，能够增强大菱鲆的免疫力，其免疫效果较单用中药组合物或鳗弧菌疫苗好。

[0016]本发明中药组合物中的紫锥菊药材，含有多糖、黄酮、咖啡酸的衍生物、精油、多炔、烷基胺和生物碱等多种有效成分，具有免疫刺激作用，减少发炎，能对抗细菌和病毒。实验证明紫锥菊刺激免疫系统细胞活动。当这些细胞有活性时，白血球更迅速把引起疾病的侵略者包围，使病毒或细菌死亡，防止他们繁殖，或仅仅停止他们的活动。早在十七世纪，美国土著人就已经使用紫锥菊，他们用这种植物去治疗蛇咬伤、牙龈和口腔的病、感冒、咳嗽、败血症、喉咙痛、胃肠痛等多种疾病。
[0017]茯苓药材，为多孔菌科真菌茯苓的菌核，出自《神农本草经》。古人称茯苓为“四时神药”，因为它的功效非常广泛，不分四季，将它与各种药物配伍，不管寒、温、风、湿诸疾，都能发挥其独特功效。茯苓味甘、淡、性平，入药具有利水渗湿、益脾和胃、宁心安神之功用。现代医学研究表明，茯苓能增强机体免疫功能，茯苓多糖有明显的抗肿瘤及保肝脏作用。最新发现的功效表明，茯苓中的主要成分为茯苓聚糖，含量很高。对多种细菌有抑制作用；能降胃酸，对消化道溃疡有预防效果；对肝损伤有明显的保护作用；有抗肿瘤的作用；能多方面对免疫功能进行调节；能使化疗所致白细胞减少加速回升；并有镇静的作用。
[0018]白花蛇舌草药材，味苦、淡，性寒。主治:肺热喘咳；咽喉肿痛；肠痈；市肿疮疡；毒蛇咬伤；热淋涩痛；水肿；痢疾；肠炎；湿热黄疸；擅长治疗多种癌肿。白花蛇舌草增强免疫功能效果明显，体外试验表明本品内服后抗感染作用明显，系通过刺激网状内皮系统，增加白细胞吞噬功能以提高血清杀菌力，给药组白细胞吞噬刚果红的能力较对照组提高4倍。镜检可见网状内皮系统显著增生，网状细胞增生肥大，胞浆丰富，吞噬活跃，淋巴结、脾、肝等组织中嗜银物质呈致密化改变，显示机体防御功能加强。能增强体液免疫功能，使小鼠脾脏中溶血空斑数显著增加。
[0019]板蓝根药材，味苦性寒，归心、胃、肝、胆经。功能清热解毒，凉血利咽。主治温毒所致的疾病，如流感、上呼吸道炎症、流脑、腮腺炎、急性肠炎、菌痢、肝炎、颜面丹毒、热病发斑等。药理研究表明，板蓝根对多种病毒与病菌有明显的抑制作用，板蓝根具有体外广谱抗菌作用(包括痢疾细菌、沙门氏细菌、溶血性链形菌)，是抗菌消炎、止痛、退热的传统中草药。其抗病毒、抗菌消炎后，同时增强了机体的免疫力。
[0020]本发明通过长期的研究，通过对大菱鲆免疫效果的检测筛选出上述的四种组分及配比，从而促成了本发明。
[0021]下面再以具体的实施例来说明本发明制备的中药组合物，以下实施例仅用于说明本发明，本发明并不限于此。
[0022]实施例1
[0023]处方:紫锥菊80g、茯苓40g、白花蛇舌草30g、板蓝根30g [0024]制法:取上述各药材，粉碎成细粉，过筛，分装每袋500g，即得。
[0025]实施例2:
[0026]处方:紫锥菊500g、获茶250g、白花蛇舌草200g、板蓝根200g
[0027]制法:取上述各药材，加13.8L水，加热沸腾提取2次，每次1.5小时，滤过，滤液减压浓缩至60°C时测定相对密度为1.30~1.35，减压干燥，粉碎，分装每袋500g，即得。
[0028]实施例3:
[0029]处方:紫锥菊12kg、茯苓6kg、白花蛇舌草5kg、板蓝根5kg
[0030]制法:取上述各药材，加336L水，加热沸腾提取2次，每次1.5小时，滤过，滤液减压浓缩至60°C时测定相对密度为1.10~1.15，过滤，灌装，每瓶500ml，即得。
[0031 ] 本发明中药组合物对基础免疫鳗弧菌疫苗后的大菱鲆的免疫效果比较
[0032](I)实验动物
[0033]选取大菱鲆300尾，平均分成5组。大菱鲆体长为7.5-9.5cm,体重8.0±1.5g。实验前在水泥池中暂养2周后置于定制的直径1.0m的圆形玻璃钢桶中,流水养殖。养殖用水为淡水与地下海水勾兑，恒温18土 1°C，盐度32，pH8.0。每日清污2次，投喂3次，日投饵量占体质量的1.5%。
[0034](2)实验药物
[0035]本发明中药:取实施例2中的药粉，取Ig加水150ml溶解；
[0036]鳗弧菌疫苗:采用市售的鳗弧菌疫苗(经过无菌检验和安全性检验为合格疫苗)。
[0037](3)实验内容
[0038]免疫试验:实验中对大菱鲆随机分成5组，每组60尾鱼，采用浸泡法进行免疫，分别为本发明药物组、鳗弧菌疫苗组、本发明药物+鳗弧菌疫苗组、黄芪多糖+鳗弧菌疫苗组和海水组。先将各组以对应药物浸泡lOmin，然后排掉，加入疫苗进行浸泡30min(疫苗浓度IX 108CFU/ml，无疫苗组第二次以海水浸泡，以海水组为对照)。
[0039]攻毒感染与免疫相对保护率试验:将每组受免鱼随机分成3小组，每组20尾，分别于免疫的第7、15、30d后，用鳗弧菌MN进行浸泡攻毒，攻毒用菌浓度根据LD50的结果。解剖死亡的大菱鲆并进行病原菌分离和鉴定，以确认死亡是否由于感染病原菌所引起。攻毒后14天逐日记录死亡情况，计算免疫相对保护率(RPS)。
[0040]实验组数据采用SPSS 12.0软件进行统计分析。
[0041](3)实验结果
[0042]①免疫7天攻毒后各组的累积死亡率及RPS
[0043]于免疫第7天进行第一次攻毒，采用浸泡攻毒的方式。攻毒所用鳗弧菌的浓度为15倍LD5tl剂量，感染12天，记录各组每天累积死亡率,并计算RPS。结果见表1。
[0044]表1大菱鲆免疫7天后各组死亡率和RPS
[0045]