专利名称：一种大菱鲆致病菌株及腹水病灭活疫苗的制作方法大菱鲆(Scophthalmas maximus)是欧洲名贵海水鱼种，原产于英国，隶属于鲆科， 为底栖鱼类，具有适应低水温生活，生长速度快，肉质好等优点，相继成为欧洲各国开发的优良海水养殖鱼类之一。我国自1992年由黄海水产研究所引进进行人工繁殖，现已达到一定的规模，逐渐成为我国北方优秀的水产养殖品种和工厂化养殖的主要对象，产生了很好的经济和社会效益。然而伴随着养殖范围的扩大和养殖密度的增加，以及品种的退化，大菱鲆的病害问题也日渐突出。腹水病为大菱鲆养殖过程中流行范围广、危害严重、被不同病原感染流行于不同地区的一种综合性疾病。各地爆发的养殖鲆鱼腹水病调查和病原学研究结果表明，多种病菌均能导致腹水病的发生和流行，不同地区养殖鲆鱼腹水病的致病病原不完全一致，主要有河豚毒素假交替单胞菌、鳗弧菌等。大菱鲆腹水病的主要病症为，患病鱼体肝脏、肾脏肿大，腹部膨胀，解剖后见微黄泛红粘稠的液体，伴随有不同程度的肠积液，体色变黑；大菱鲆摄食不良，游动不稳。2008年，山东大菱鲆养殖区出现新的腹水病症状，该病不同于以往的腹水病，主要表现在发病鱼眼睛发红、肠道充血，沿腹脊充血严重，肛门处充血最为严重，腹部膨大，内有微黄泛红粘稠的液体，该病主要发生于大菱鲆苗期，一旦发病，完全治愈非常困难，传染性极强，死亡率极高，造成养殖大菱鲆的大量死亡。对于大菱鲆腹水病的治疗目前主要依赖于抗生素，虽然有一定效果，但是并不能从根本上控制该病，而且鱼体极易产生耐药性，造成体内、河水环境的药物残留，破坏生态平衡，威胁人体的健康和安全。此外鱼群在患病期间容易产生厌食的症状，所以投喂药饵的方法也不甚理想。因此寻找治疗该病的安全有效的途径是目前亟待解决的问题。
本发明的目的是提供一种大菱鲆致病菌株及腹水病灭活疫苗，即提供一种对于大菱鲆腹水病，以及2008年以来各大菱鲆养殖场所发现的新型腹水病具有突出治疗效果的三联灭活疫苗及其制备方法，用以解决以往使用抗生素治疗大菱鲆腹水病时所产生的药物残留和耐药性问题，以弥补现有技术的不足。本发明利用从患有新型大菱鲆腹水病的组织中分离得到致病菌鲁氏不动杆菌 (Acinetobacterlwoffii)，并于2010年12月30日保藏在武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010372。本发明筛选到的鲁氏不动杆菌CCTCC M 2010372用于制备灭活疫苗。上述的灭活疫苗还可以包括河豚毒素假交替单胞菌或假单胞菌的灭活菌株中的任一种或两种。为了获得最好的防治效果，上述的灭活疫苗中包括有鲁氏不动杆菌CCTCCM2010372、河豚毒素假交替单胞菌和假单胞菌的灭活菌体；其中灭活菌体的浓度分别为 107-10lclCFU/ml。其中河豚毒素假交替单胞菌来自中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)菌株保藏编号1B00001，假单胞菌中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，菌株保藏编号 1G00144。中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)位于厦门市大学路178号的国家海洋局第三海洋研究所内。上述灭活疫苗的制备方法如下首先，将鲁氏不动杆菌接种于含有3% NaCl的LB液体培养基中，再将河豚毒素假交替单胞菌或假单胞菌中的一种或两种分别接种于含有3 % NaCl的LB液体培养基中，28°C 震荡培养12-16小时，待菌液浓度达109CFU/ml或分光光度计检测0D600达到0. 6以上时终止培养，获得菌株的扩大培养液；然后按体积比0. 5%加入甲醛溶液，对菌株的扩大培养液，河豚毒素假交替单胞菌和/或假单胞菌的扩大培养液于室温灭活12-16小时，期间震荡3-5次；得到菌株的灭活菌液；最后，将菌株的灭活菌液于8000g、4°C离心15分钟，弃上清液，将沉淀用无菌生理盐水洗涤2次，收集菌体，用无菌生理盐水重悬菌液，再将菌液混合即制得灭活疫苗。本发明制备的大菱鲆腹水病灭活疫苗的制备工艺简单、产量稳定，成本低，可大量获得具有较高免疫效果的灭活疫苗。使用该方法制备的灭活疫苗的免疫保护率达70%，该疫苗为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并且该方法可从根本上遏制大菱鲆腹水病的发生和流行，为大规模制备大菱鲆新型腹水病灭活疫苗提供了技术支持。4菌株的生理生化特性如下果糖阴性、的葡萄糖阴性、淀粉阴性、蔗糖阴性、麦芽糖阴性、β -半乳糖苷酶阴性、氧化酶阴性、接触酶阳性。5、筛选的菌株的致病性检测从养殖场挑取日龄30-60、平均体长(2. 0士 1. 1) cm的健康大菱鲆，饲养于IOL海水的整理箱中，每组20尾，实验期间连续充气，水温14°C，每天换水，不投饵。将分离纯化的鲁氏不动杆菌于3% NaCLLB培养基，28°C培养后，离心，用无菌海水重悬得菌悬液，设定细菌浓度梯度，进行浸浴感染，水体中菌液终浓度分别为3. 5 X 108CFU/ml、3. 5 X IO7CFU/ ml，每天换水补充菌液。对照组不做处理，定时观察记录各组发病和死亡情况，并取发病大菱鲆腹水及肠道组织进行细菌再分离。结果表明，菌株浓度为3. 5X108CFU/ml浸浴感染大菱鲆后第4天实验组大菱鲆开始出现死亡，第9天是死亡率为100%，菌株浓度为 3. 5X107CFU/ml浸浴感染大菱鲆后第6天实验组大菱鲆开始出现死亡，第9天时得死亡率为85%。而对照组大菱鲆无一例死亡。人工感染后发病的大菱鲆主要表现为腹部膨胀，充血，活力大大减弱，与自然发病症状相同。取人工感染后发病濒死大菱鲆腹水及肠道组织涂布于高盐营养琼脂培养基平板上，均可分别分离到大量菌落形态高度一致的细菌，其菌落形态、大小以及生理生化特征均分别鲁氏不动杆菌相同。考虑到鲁氏不动杆菌的致病性，发明人将筛选到的菌株制备灭活疫苗。二、制备灭活疫苗实施例1 鲁氏不动杆菌CCTCC M 2010372的灭活疫苗1、鲁氏不动杆菌CCTCC M 2010372的灭活疫苗的制备首先将本发明筛选到的鲁氏不动杆菌接种于500ml高盐普通LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母浸出汁5g/L，氯化钠30g/L)中，在震荡培养12小时，血球计数板检测菌液浓度达109CFU/ml，或0D600值达到0. 6以上时终止培养，获得鲁氏不动杆菌的扩大培养液；后按体积比0. 5%加入25ml甲醛溶液，对菌株的扩大培养液于室温灭活12小时， 期间震荡3次；得到菌株鲁氏不动杆菌的灭活菌液；最后，将菌株的灭活菌液于8000g、4°C离心15分钟，弃上清液，将沉淀用无菌生理盐水洗涤2次，收集菌体，用无菌生理盐水重悬菌液，使菌液中的灭活菌体的浓度为 107-1010CFU/ml,即制得灭活疫苗。2、鲁氏不动杆菌CCTCC M 2010372的灭活疫苗的效果检测随机选取30-50日龄的健康大菱鲆，于8%的NaCl溶液中浸泡2分钟，然后立即转移到实施例1中制备的灭活疫苗中，3分钟后，取出大菱鲆，正常饲喂饵料，并以未经疫苗浸泡处理的健康大菱鲆为对照。28天后将灭活疫苗浸泡及未经过浸泡处理的大菱鲆，以 3. 5X 107CFU/ml浓度的鲁氏不动杆菌活菌进行攻毒试验，每天换水补充菌液，定时观察记录各组大菱鲆发病和死亡情况，结果表明对照组大菱鲆在感染后第4天出现死亡，第10天时全部死亡，免疫保护率为0 %，而灭活疫苗浸泡组在感染后第8天才开始出现死亡，免疫保护力为50. 5%。结果表明本发明制备的灭活疫苗能有效的对大菱鲆进行抗菌性免疫。实施例2 鲁氏不动杆菌与河豚毒素假交替单胞菌和/或假单胞菌制成混合菌株的灭活疫苗1、灭活疫苗的制备首先将本发明筛选到的鲁氏不动杆菌接种于500ml高盐普通LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母浸出汁5g/L，氯化钠30g/L)中，在震荡培养12小时，血球计数板检测菌液浓度达109CFU/ml，或0D600值达到0. 6以上时终止培养，获得鲁氏不动杆菌的扩大
培养液；再将河豚毒素假交替单胞菌或假单胞菌中的一种或两种分别接种于含有500ml 高盐普通LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母浸出汁5g/L，氯化钠30g/L)中，在震荡培养16小时，血球计数板检测菌液浓度达109CFU/ml，或0D600值达到0. 6以上时终止培养，然后按体积比0. 5%加入25ml甲醛溶液，对河豚毒素假交替单胞菌和/或假单胞菌的扩大培养液于室温灭活16小时，期间震荡5次；得到菌株的灭活菌液；最后，将菌株的灭活菌液于8000g、4°C离心15分钟，弃上清液，将沉淀用无菌生理盐水洗涤2次，收集菌体，用无菌生理盐水重悬菌液，得到菌株不同的灭活菌液；再将灭活的菌液按等比例混合即制得灭活疫苗。如制成氏不动杆菌和河豚毒素假交替单胞菌的二联疫苗，就是将两种菌的灭活菌液按约1 1的比例混合制成，其中灭活菌体的浓度分别为为 107-10lclCFU/ml。本发明将鲁氏不动杆菌、河豚毒素假交替单胞菌和假单胞菌的灭活菌液混合，制成三联灭活疫苗，其中菌体浓度约为109cfu/mL。对该灭活疫苗进行无菌检测取上述三联灭活疫苗50 μ 1涂布于含有30%的NaCl 的高盐度的普通LB固体培养基，涂布均勻后培养48小时后未见菌落长出，合格者即为鲁氏不动杆菌、河豚毒素假交替单胞菌和假单胞菌三联灭活疫苗；对该灭活疫苗的安全性进行检测取灭活疫苗以0. 2ml/尾腹腔注射大菱鲆，对照组注射同等剂量的无菌生理盐水。然后正常饲养观察14天，观察注射疫苗的大菱鲆全部存活，且进食及活动正常，内脏剖检未见任何异常，可认为制备的灭活疫苗安全可靠。对灭活疫苗进行无菌检测后，合格者即为鲁氏不动杆菌、河豚毒素假交替单胞菌和假单胞菌的三联灭活疫苗，放置在4°C条件下保存备用。三、灭活疫苗的效果检测实施例1 三联灭活疫苗的免疫保护试验1采用浸泡免疫的方法对制备的灭活疫苗的免疫效果进行检测选取30-60日龄的健康大菱鲆，置于8%的NaCl溶液中浸泡2分钟，然后立即转移到经过10倍稀释的灭活菌液QX108CFU/ml)中浸泡;3min。7天后用同等方法加强免疫一次，其他饲养条件均与未免疫大菱鲆一致。在免疫后第30天，进行攻毒。2008年1月，在山东省龙口市某养殖场进行浸泡免疫效果试验。随机抽取30-60 日龄的大菱鲆1000尾，随机分为3组，使用具体实施例1中制备的灭活疫苗进行浸泡免疫试验，方法如下试验分为3组，第1组为对照组，第2组为加强免疫组，第3组为不加强免疫组，将第2组和第3组大菱鲆置于8%的NaCl溶液中浸泡2分钟，然后立即转移到经过 10倍稀释的灭活菌液QX108CFU/ml)中浸泡:3min，第2组大菱鲆1周再按同样的方法加强免疫一次。35天后对3组大菱鲆进行攻毒试验，第1组大菱鲆全部死亡，第2组的免疫保护率达76%，第3组的免疫保护率为65%。实施例2疫苗的免疫保护试验22009年3月，在山东威海市昌源水产有限公司进行投饵免疫效果实验。随机抽取30-60日龄的大菱鲆2000尾，随机分2个养殖池，养殖池1使用具体实施例1中制备的灭活疫苗添加到饵料中进行投饵免疫试验，每天的灭活疫苗饲喂量为2 X IO9CFU,连续饲喂15 天后，饲喂正常饵料40天后进行攻毒试验，养殖池2大菱鲆死亡率达85 %，而养殖池1大菱鲆死亡率仅为50%。 上述的实验结果表明，本发明制备的三联灭活疫苗具有高效的免疫效果，能够有效的提高大菱鲆的抗病力，具有良好的市场推广前景。


本发明筛选出了一种大菱鲆的致病菌株，为鲁氏不动杆菌，保藏编号为CCTCC NO:M2010372。将筛选出的鲁氏不动杆菌去制备灭活疫苗。另外，鲁氏不动杆菌和河豚毒素假交替单胞菌、假单胞菌来制备二联或三联灭活疫苗，用来对大菱鲆腹水病进行免疫。本发明制备的大菱鲆腹水病灭活疫苗的制备工艺简单、产量稳定，成本低，可大量获得具有较高免疫效果的灭活疫苗。使用该方法制备的灭活疫苗的免疫保护率达70％，该疫苗为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并且该方法可从根本上遏制大菱鲆腹水病的发生和流行，为大规模制备大菱鲆新型腹水病灭活疫苗提供了技术支持。