专利名称：一种猪葡萄球菌灭活疫苗及其制备方法与应用的制作方法猪葡萄球菌可以引起猪群发生大规模的渗出性皮炎病(Exudative Epidermitis, EE)，它是一种急性、高度接触性的猪传染病，患猪以急性全身性渗出性皮炎为主要特征，因 此该病又称溢脂性皮炎或煤烟病。本病主要感染5-6日龄的初生哺乳仔猪、刚断奶的仔猪 以及母猪乳房上。该病原可通过各种途径感染，主要以破裂和损伤的皮肤黏膜引起动物的 感染。据国内外的研究结果表明它的发病率为80% ；死亡率5% 90%不等；少数存活的 病猪常导致生长发育障碍形成“僵猪”。葡萄球菌产生的脱落毒素可以引起人和动物发生严重的皮肤性疾病。例如金黄色 葡萄球菌可引起人的烫伤样皮肤综合症，猪葡萄球菌可引起仔猪发生渗出性皮炎。目前发 现的脱落毒素有8种，包括金黄色葡萄球菌产生的ETA、ETB和ETD，以及猪葡萄球菌产生的 SHETA、SHETB、EXHA、EXHB、EXHC 和 EXHD。猪葡萄球菌的致病性首先由丹麦的研究人员报道，到目前为止欧洲和亚洲的许多 国家均有报道，并且有上升的趋势。据泰国对规模化猪场保育猪的10种主要疾病统计，渗 出性皮炎发生率为25.3%，仅次于链球菌病(31.6%)，名列第2位。在美国最常见的保育 猪疾病是链球菌病、渗出性皮炎。而在丹麦从患病猪和健康猪分离到的菌株产生毒素的几 率分别为87. 5%和76. 1%。Andresen等人对8个国家猪身上的214个样本，以及从四个 国家其它动物身上分离到的44个样本中通过多重PCR检测到编码猪源葡萄球菌脱落毒素 的基因。表达纯化的毒素通过单克隆抗体和多克隆抗体进行了免疫印迹和ELISA鉴定。另 外，他们从1997年至1998年利用建立的间接ELISA对69个猪场的655头猪进行了流行病 学调查。发现每个猪场的发病率为74%，同时实验结果表明从猪群体中分离到的猪葡萄球 菌的菌株99%含有毒素基因。而在含有毒素基因的EXHA、EXHB的培养液中加入二价的锌离 子盐和钴离子盐类能提高对含有这两种毒素的菌株的检出率。单独加入锌离子能提高含有 EXHC毒素基因的菌株的检出率。致病性的猪葡萄球菌不仅在患有EE猪身上存在，健康猪身 上也发现了致病性的S. hyicus株，而且从患有EE的病猪身上分离到S. hyicus的机率远远 大于健康猪和患有其它病的患病猪。从其它动物分离到的44株猪葡萄球菌菌株中仅有2 株含有毒素，一株是从比利时野兔身上分离到的菌株；另一株是从日本患有乳房炎的奶牛 分离到的菌株。TaishiTanabe等人在日本从8个感染了 EE的猪场中分离到了 37株猪葡萄 球菌菌株，从两个正常猪场中分离到了 13株猪葡萄球菌菌株。近年来，在我国猪渗出性皮 炎的报道也越来越多。邓朝阳、甘海霞等于2001年报道了广西某猪场发生的渗出性皮炎的 流行状况及治疗情况；殷凤斌、米瑞娟等在2002年报道了发生在东北的猪渗出性皮炎的病 原鉴定；郑金燥于2005年报道了福建省德化县两例猪渗出性皮炎中西医结合的诊治情况； 睢艳平、徐镔蕊等在2006年报道该病在北京的发病情况；包小华、操传斌等于2008年报道了猪葡萄球菌引起人的多器官功能衰竭的病例；杨先富等于2009年报道了猪葡萄球菌病 的诊断与治疗情况，所有报道均显示该病已成为一种新的影响人类健康和养猪业发展的重 要疫病之一。在我国对该病的研究还不是很多，主要是针对猪源表皮葡萄球菌、猪葡萄球菌的 病原学、诊治方面进行了研究。目前虽然应用分子生物学方法对6种脱落毒素全基因进行 了测序，但对其感染仍缺乏有效的防治方法，主要采用中西药结合以及改善畜舍环境来防 治该病的发生。丹麦在80-90年代尝试制备自家灭活菌苗，有一定的免疫保护效果。国内也有的 养殖场通过制备一些灭活苗来进行免疫接种，以预防该病的发生和蔓延。但是由于该菌的 变异较大，分泌的毒素类型也有较大的差异，导致自家灭活菌苗不能有效控制该病，因而有 必要利用优势菌株研制单价或多价灭活苗。
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种猪葡萄球菌灭活疫 苗的制备方法。本发明的另一目的在于提供通过所述制备方法得到的猪葡萄球菌灭活疫苗。本发明的再一目的在于提供所述猪葡萄球菌灭活疫苗的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种猪葡萄球菌灭活疫苗的制备方法，包 含以下步骤(1)将猪葡萄球菌Staphylococcus hyicus)纯培养后，加入甲醛进行灭活，甲醛 的终浓度为体积百分比0. 6% ；得到灭活的猪葡萄球菌；(2)将灭活的猪葡萄球菌和佐剂混合，得到猪葡萄球菌灭活疫苗；所述的猪葡萄球菌为含有脱落毒素的猪葡萄球菌；所述的猪葡萄球菌脱落毒素优选为EXHB ；步骤(1)中所述的猪葡萄球菌优选为猪葡萄球菌S. Hyicus GZl ；步骤(1)中所述的纯培养的通用方法为将猪葡萄球菌在新鲜配制的绵羊鲜血琼 脂培养基上划线，得到形态不一呈灰白色的菌落，挑选单菌落进行培养；步骤⑴中所述的加入甲醛进行灭活的条件优选为18 25°C灭活M 48h ；步骤O)中所述的佐剂优选为油乳佐剂；所述的油乳佐剂优选通过以下方法制备得到在白油中加入硬脂酸铝和司 本-80，经121°C高压灭菌21min后作为油相佐剂；其中硬脂酸铝的终浓度优选为质量体积 比1. 25%，司本-80的终浓度优选为质量体积比6% ；所述步骤( 更优选为在灭活完全的菌液中加入除菌的吐温-80，完全溶解后作 为水相抗原，吐温-80的终浓度为体积百分比2% ；在白油中加入硬脂酸铝和司本-80，经 121°C高压灭菌21min后作为油相佐剂，硬脂酸铝的终浓度为质量体积比1.25%，司本-80 的终浓度为质量体积比6%;按照1 1的体积比例将油相和水相以3000r/min进行勻浆， 期间缓慢加入水相抗原，充分混合乳化，得到猪葡萄球菌灭活疫苗，4°C保存备用。 一种猪葡萄球菌灭活疫苗，通过上述方法制备得到。 所述猪葡萄球菌灭活疫苗用于制备免疫猪的药物。4本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明首次提供了一种免疫效果 较好的猪葡萄球菌灭活疫苗。该猪葡萄球菌灭活疫苗的制备方法简单，成本低。因此，本发 明所述的猪葡萄球菌灭活疫苗的市场前景广阔。
图1是本发明的灭活疫苗免疫小鼠后的血清抗体消长规律的变化图。

疫苗的安全性检验将疫苗进行肌肉注射接种7周龄非免疫昆明小鼠(购白广州市 白云区穗北实验动物养殖场)5只，接种方式为肌肉注射，每只小鼠注射灭活疫苗的用量为 300微升，注射后观察1周，观察其饮食、精神有无异常变化，注射部位有无炎性肿胀，疫苗 吸收情况。⑤抗体效价的测定I、多抗血清的制备取6周龄非免疫昆明小鼠(广州市白云区穗北实验动物养殖 场)20只，随机均分为4组，每组5只，其中第1、2、3组为试验组，免疫方式为肌肉注射免 疫，灭活疫苗的用量分别为0. 1/只、0. 25/只、0. 5ml/只，第4组注射PBS缓冲液(0. Imol/ L，pH7. 2)作为对照组。在免疫前后定期(免疫后第7、14、21天)采血0. :3ml，分离血清。II、抗原的制备基因工程方法制备脱落毒素EXHB，具体步骤如下猪葡萄球菌ExhB基因的构建和转化见参考文献(杨彩娟等.猪葡萄球菌ExhB基 因在E. coli中的表达及生物学活性分析.中国兽医学报，2009, ) :399 402)。融合蛋白的大量诱导表达挑单个E. coliBL21转化体接入3mL含100 μ g/mLAmp 的LB液体培养基中，370C 200rpm培养过夜进行活化，按体积百分比1 %的量接种500mL含 100 μ g/mL Amp的LB液体培养基中进行扩大培养，37°C 200rpm培养至其OD6tltl值为0. 6左 右，加入IPTG使其终浓度为lmmol/L。然后再在37°C恒温振荡器上以200rpm继续诱导培 养4h后，12000rpm离心lOmin，收集菌体，弃上清，尽量去除培养基，再用预冷的PBS缓冲液 (0. 01mol/L)洗涤一次，12000rpm离心lOmin，收集菌体并称量菌体湿重克(g)数。重组蛋白的纯化将收集的湿菌按每IOOmL培养基所得菌体加入40mL平衡缓 冲液(Buffer A :0. IM NaH2PO4、0. OlM Tris-Cl, PH 8.0)比例重悬菌体。细胞悬液中加入 溶菌酶(终浓为100mg/mL)，上下吹打混勻，37°C孵育15min。将重悬菌液至于合适容器 中，超声波破碎。超声过程中保持菌液处于冰浴或者盐冰浴中。超声条件每次超声4s， 间隔10s，共25min(裂解次数根据菌体浓度和体积来确定)，功率300W。裂解后的菌液 于4°C IOOOOrpm离心20min，包涵体和细胞碎片位于沉淀中。移去上清，按每IOOmL培养 基加5mL缓冲液比例，加入Buffer B缓冲液重悬沉淀(Buffer B:8M尿素、0. IM NaH2PO4, 0. OlMTris-Cl,PH 8. 0)，然后用0. 45 μ M滤膜过滤上清，得到细菌粗提物。将细菌粗提物和 树脂(Ni-NTAAgarose,506428A, invitrogen)按1 1的体积比混合，孵育10分钟。分别 用 Buffer C(Buffer C :8M尿素、0. IM NaH2PO4^O. OlM Tris-Cl ρΗ6· 3)、Bufer D (Buffer D 8M 尿素、0. IM NaH2PO4、0. OlM Tris-Cl pH 5.9)洗脱杂蛋白，改用 Buffer E (Buffer E :8M 尿素、0. IM NaH2PO4、0. OlM Tris-Cl, pH 4.5)洗脱目的蛋白。取少量的洗涤上清和重悬的 沉淀，加入等量的2X SDS电泳上样缓冲液进行SDS-PAGE分析检查包涵体的洗涤情况。包涵体的复性纯化后的蛋白用PBS缓冲液(0. 01mol/L)透析去除尿素，蛋白质重 新形成包涵体，离心，去上清，收集沉淀。用适量的Buffer E重新溶解蛋白，以浓缩蛋白。A、将浓缩蛋白溶于包涵体复性缓冲液(0. 01mol/L PBSUmmol/L EDTA，pH 8.0) 中，加入3-环己胺-1-丙磺酸(CAPS Merker protein Refolding kit)，使其质量体积比为 1%，加二硫苏糖醇(DTT)至终浓度lmmol/L ；B、将蛋白转移到透析袋中，加入IX透析液(1M Tris-Cl, pH 8. 0)和 DTT (0. lmmol/L) 4°C透析，透析 6h 以上；C、倒掉透析液，重新加入1 X透析液进行透析；
D、按照步骤C重复一次E、12000rpm离心5min，去沉淀，测定上清中的蛋白浓度。分别取少量的上清和重悬的沉淀，加入等量的2XSDS电泳上样缓冲液进行 SDS-PAGE电泳检查包涵体的复性，经Western blot检测表明，复性后的重组蛋白能被猪葡 萄球菌多克隆阳性血清所识别具有良好的反应原性。蛋白质浓度、纯度的测定及保存蛋白质浓度的测定用紫外分光光度计测定样品在^Onm和280nm波长 的光吸收值，按下式计算样品中的蛋白质含量蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/mL)= (1. 45XA280-O. 74XA260) X稀释倍数。蛋白质纯度的测定SDS_PAGE电泳检查纯化的蛋白。 复性后蛋白的保存将复性后的脱落毒素EXHB蛋白溶液过滤除菌，小量分装冻存于-70°C 冰箱。以重组EXHB脱落毒素为抗原包板，按常规ELISA方法测定其抗体效价(姚火 春.兽医微生物学实验指导.北京中国农业大学出版社(第二版)，2002. 55 56.丛丽 媛，蒋智勇等.猪圆环病毒2型抗体检测间接ELISA方法的建立[J].2008，28(8) :892-896. Andresen L. 0. Development and evaluation of an indirect ELISA for detection of exfoliative toxin ExhA, ExhB or ExhC produced by Staphylococcus hyicus[J]. Vet Micorbiol，1999,68(3-4) :285-292.)。同时对1 3已进行免疫的实验组按终浓度为 1 X 109CFU/ml的菌液进行攻毒试验，第4组设为对照组，观察其免疫效果。⑥抗体水平消长规律测定将6周龄非免疫昆明小鼠(广州市白云区穗北实验动物养殖场)进行猪葡萄球菌 灭活苗免疫接种，免疫方式为肌肉注射，灭活疫苗的总用量0. 5mL/只，共免疫6只。免疫后 每隔1周采血分离血清检测抗体。同时设5只作为空白对照，隔离饲养，不接疫苗。(3)结果①灭活疫苗的安全性检验在实验观察的1周内，接种的5只昆明小鼠精神状况均良好，未发现体温升高、饮 水及采食异常等现象，注射局部无炎性肿胀现象发生。②抗体效力的测定表1免疫接种后小鼠的ELISA检测结果


本发明公开了一种猪葡萄球菌灭活疫苗及其制备方法与应用。本发明所述的制备方法为将表达脱落毒素的猪葡萄球菌进行纯培养，然后加入甲醛进行灭活，甲醛的终浓度为体积百分比0.6％；得到灭活的猪葡萄球菌；再将灭活的猪葡萄球菌和佐剂混合，得到猪葡萄球菌灭活疫苗。本发明首次提供了一种免疫效果较好的猪葡萄球菌灭活疫苗。该猪葡萄球菌灭活疫苗的制备方法简单，成本低。从而本发明所述的猪葡萄球菌灭活疫苗的市场前景广阔。