专利名称：一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法水貂病毒性肠炎是由细小病毒科细小病毒属水貂肠炎病毒(Parvoviridae Parvovirus Mink enteritis virus, MEV)引起的一种急性、高度接触性传染病，是世界上 公认的危害水貂饲养业较为严重的病毒性传染病之一。病貂和耐过貂是水貂病毒性肠炎的 主要传染源，本病常呈暴发性地方流行，各种年龄、性别水貂均有感染性，无明显的季节性， 全年均能发生。水貂病毒性肠炎的发病率和死亡率在50% 90%左右，其中幼龄仔貂的病 死率最高。水貂细小病毒病毒对外界环境有较强的抵抗力，病毒在污染的貂笼舍中，自然环 境条件下能保持毒力一年。本病在上世纪40年代末到50年代，严重的威协着国外养貂场(加拿大、丹麦、瑞 典)。我国首次发生在1980年，山东省1984年(荣成)首次发生，1984-1989年该病扩散、 蔓延，对我省造成很大损失。目前，全国毛皮动物的养殖量已超过9000万只，其中水貂的养 殖量约占毛皮动物养殖总量的一半。由于水貂病毒性肠炎无特效的治疗方法，应用疫苗进 行预防显得尤为重要。选育出毒力强、免疫原性好的水貂肠炎病毒国内流行毒株，并研制出 安全、有效的水貂病毒性肠炎灭活疫苗是控制水貂病毒性肠炎的有效方法。本发明的目的是利用本发明人自行分离、鉴定、保存的一株水貂肠炎病毒MEV-RCl 株作为生产疫苗的病毒株，制备出一种安全、有效的水貂病毒性肠炎灭活疫苗。
本发明的目的是利用本发明人自行分离、鉴定、保存的一株水貂肠炎病毒MEV-RCl 株作为生产疫苗的病毒株，通过在F81在进行病毒繁殖，经过收获、灭活、配苗等步骤，制备 出安全、有效的水貂病毒性肠炎灭活疫苗。1.疫苗生产用毒株(1)病毒来源疫苗制造及检验用毒种为水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus)MEV-RCl株细胞 毒，由本发明人分离、鉴定、保管和供应，该株病毒已于2010年11月11日送交北京朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中 心，保臧编号为CGMCC No. 4331。(2)病毒株特性1)病毒含量将毒种用含20Z0在56°C下灭活30min的新生牛血清的细胞营养液(MEM)作10倍 系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10_84个稀释度，各接种长成80%单层的猫肾传代细胞(F81，本 发明人实验室保藏)96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，每孔100 μ 1，同时设不接毒对照孔，置37°C、含5%C02培养箱中培养96 120小时，观察记录细胞病变(CPE)孔 数，按Reed-Muench法计算TCID5tl，每毫升病毒含量≥1O7 0TCID5002)血凝性对猪红细胞的HA效价≥1 128。3)毒力将毒种口服接种2 10月龄健康易感水貂(抗MEV HI抗体≥1 4) 5只，每只 15ml (含15 X IO7.0TCID50)，接种后观察10日，可全部发病。4)免疫原性将毒种接种F81细胞培养，收获细胞培养物，经甲醛溶液灭活后，制成氢氧化铝胶 灭活疫苗，分别皮下接种2 10月龄健康易感水貂(抗MEV HI抗体≥1 4)5只，每只 lml，同时设不接种对照水貂5只。免疫后14日采血，分离血清，分别测定抗MEV HI抗体， 免疫水貂抗MEV HI抗体均彡1 32，对照水貂抗MEV HI抗体均≥1 4;同时所有貂口服 水貂肠炎病毒MEV-RCl株病毒液15ml/只(含15 X 107_ tlTCID5tl)，连续观察10日，对照水貂 全部发病，免疫水貂全部健活。5)纯净按《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.二〇〇五年版三部.中国农 业出版社，2006，本发明简称为《中国兽药典》)规定方法进行检验，无细菌、霉菌、支原体及 外源病毒污染。6)特异性将毒种用用生理盐水作1000倍稀释，与等量10倍稀释(用生理盐水)的水貂肠炎 病毒特异性抗血清(由解放军军需大学提供)混合，在37°C下中和1小时，接种已长成80% 单层的F81细胞24孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.5ml。同时设不中和对照组(将毒 种作1000倍稀释与等量的MEM混合和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔0. 5ml，置37°C、 含5% CO2培养箱培养96 120小时，中和组和正常细胞对照不出现CPE，不中和对照组全 部出现CPE。7)基础种子代次C6 C15 代。8)毒种保存_15°C以下保存，保存期为24个月；-70°C以下保存，保存期为60个月。2.水貂病毒性肠炎灭活疫苗的生产制备(1)将生长良好的F81细胞按常规方法传代，待细胞长成80%单层后，倾去生长 液，换以含1 %毒种的维持液(含2%新生牛血清的MEM)，置37°C继续培养，转瓶转速为8 10r/ho(2)接种后，每日观察细胞病变，当细胞病变(CPE)达80%左右时即可收获，冻融 1次，置_15°C以下冻结保存，待检备用。(3)按病毒液总量的0. 3%加入甲醛溶液，充分混勻，置37°C下灭活，待温度升至 37°C开始计时，灭活48小时，期间每隔4 8小时混勻1次。(4)经过半成品检验合格后，将灭活病毒液和灭菌的氢氧化铝胶按9 1比例进行 配苗，再加入1 %的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01 %，充分混勻。(5)定量分装，分装时，随时搅拌使其混合均勻。3.水貂病毒性肠炎灭活疫苗的检验方法(1)性状本品静置后，上层为粉红色液体，下层为淡粉红色沉淀，振摇后呈均勻 混悬液。(2)无菌检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应无菌生长。(3)安全检验用2 10月龄健康易感水貂5只，各皮下注射疫苗3ml，连续观察 10日，应全部健活。(4)效力检验用2 10月龄健康易感水貂5只，各皮下注射疫苗1ml，同时设不 接种对照水貂5只。免疫后14日采血，分离血清，分别测定抗MEV HI抗体，免疫水貂抗MEV HI抗体均应彡1 32，对照水貂抗MEV HI抗体均应彡1 4。(5)甲醛和汞类防腐剂残留量测定按《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用 生物制品通则的规定。4.水貂病毒性肠炎灭活疫苗安全性试验(1)最小使用日龄水貂一次单剂量接种疫苗的安全性试验取49日龄健康易感 水貂20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别皮下接种本发明人按本发明提供的方法制 备的3个批次的疫苗(第1批、第2批和第3批)，Iml/只；第4组不接种作为对照。相同 条件下饲养，观察10日，每日观察水貂精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不 良反应。经皮下途径一次单剂量接种水貂后，水貂精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位 及全身未见不良反应，所有水貂均健活。具体试验结果如表1 表1疫苗对最小使用日龄水貂一次单剂量接种的安全性试验结果本发明涉及一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法。本发明利用自行分离、鉴定、保存的一株水貂肠炎病毒MEV-RC1株作为生产疫苗的病毒株，通过在F81细胞上进行病毒繁殖，经过收获、灭活、配苗等步骤，制备出安全、有效的水貂病毒性肠炎灭活疫苗。本发明采用的制苗毒株能够针对目前疾病流行情况，有效预防水貂病毒性肠炎的发生，为毛皮动物疾病的控制创造条件。