猪传染性胃肠炎灭活疫苗的制备方法及产品的制作方法[0002]猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis, TGE)是由冠状病毒科猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的以仔猪呕吐、严重腹泻和高致死率为特征的消化道传染病。该病是中国及世界各养猪国家仔猪早期死亡的重要疫病之一。新生仔猪感染猪传染性胃肠炎病毒后感染20h内患胃肠炎，在I~4d死亡I周龄仔猪感染后死亡率可达100%，TGEV传播可以通过消化道和呼吸道与受感染个体或携带疾病猪粪便、乳汁、呕吐物、呼吸及鼻腔分泌物直接接触发生，虽然猪为主要易感动物，有报道狗自然感染TGEV，也会出现腹泻、呕吐、虚脱和体温异常等临床症状，新生仔猪接触受感染狗粪便则会引发TGE。[0003]近年来，TGE在中国国内流行形势严峻，已成为严重危害养猪业重要疫病之一。疫苗接种是预防此病有效措施。目前在中国广泛应用的疫苗为猪传染性胃肠炎灭活疫苗，疫苗的生产采用的是传统的转瓶工艺，该工艺在疫苗行业已经使用了数十年，其操作技术相对简单和成熟。但是每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶细胞的质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批次间差异大，而且操作劳动强度大，生产效率低，隐性污染引起的高内毒素等缺点，已经越来越不适应当前疫苗大规模生产的要求。[0004]WAVE波浪生物反应器是采用抛弃型生产技术进行细胞培养的一种新型反应器。其工作方式是，细胞接种于可抛弃的细胞培养袋内，接种细胞的培养袋固定在托盘上以一定的方式摇动，精密控制的摇动保证了培养体系的有效混合和传氧效率。采用WAVE波浪生物反应器，主要优点有I)免除生物反应器清洗、消毒及其相关认证。2)封闭培养系统，无需固定的管道，简化细胞培养厂房，缩短反应器安装和生产产品转换时间。3)细胞培养袋Cellbag放在特殊设计的摇动平台上，平台的摇动在培养液中产生波浪提供培养物混合和氧气传递，产生一个适于细胞生长的完美环境。[0005]采用WAVE波浪生物反应器生产猪传染性胃肠炎灭活疫苗时，所加入微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养袋的摇动参数等生产条件对于猪传染性胃肠炎灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力的高低等有非常显著的影响，在生产实践中需要对这些条件进行优化才能有效提高猪传染性胃肠炎灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。
[0006]本发明的目的是提供一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪传染性胃肠炎灭活疫苗的方法，该方法对微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养条件等参数进行了优化，有效提升了猪传染性胃肠炎灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。[0007]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:[0008]一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪传染性胃肠炎灭活疫苗的方法，包括:(1)细胞的培养:将ST细胞接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；(2)病毒液的增殖:沉降微载体，洗涤培养的细胞，接种猪传染性胃肠炎病毒毒种，加入病毒增殖培养基培养细胞，收获病毒液；(3)将病毒液灭活，乳化，得到猪传染性胃肠炎灭活疫苗；其中，所述的摇动条件为摆动角度6°、摆动速度为14rpm。
[0009]采用WAVE波浪生物反应器培养ST细胞时，摇动培养参数对于细胞在微载体上的吸附以及细胞生长有非常显著的影响，为了筛选到最适宜的摇动培养参数以最大限度的促进细胞生长，本发明对摇动培养时的摆动角度以及摆动速度等参数进行了优化考察，观察不同的培养条件对于细胞的生长所带来的影响。通过实验发现，在对于细胞培养袋中的细胞进行摇动培养时，摆动角度以及摆动速度对于细胞的生长有非常显著的影响；本发明最终发现，当摇动培养时的培养条件为摆动角度6°、摆动速度为14rpm能够最为显著的促进细胞的生长，该培养条件下的细胞生长速度显著高于其它的培养条件。
[0010]细胞接种密度与微载体含量对细胞生长的影响密切相关，其中重要的标志是接种时要保证合适的细胞密度与载体的比例关系。在每克微载体接种相同ST细胞数的前提下，本发明考察 Cytodexl 含量为 lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L 时 ST 细胞生长情况，用来确定合适的载体用量。从实验结果可以看出，随着微载体含量的增加，ST细胞密度会有所增加，但ST细胞扩增倍数却有所降低。微载体含量为4g/L时，ST细胞生长较快，培养时间为5天时，ST细胞密度达到了 1.49X 107g/L，非常显著的高于其它的微载体的细胞密度；此外，当微载体含量高于4g/L时，ST细胞生长的增加速度不显著。因此，本发明在细胞培养袋中培养ST细胞时，所加入的微载体的含量优选为4g/L。
[0011]在确定了微载体最适宜用量的基础上，本发明为4g/L的微载体用量，分别以
5X 1O4UX 1O5,2 X 1O5,3 X 1O5,4X 1O5,5 X 1O5,6 X 1O5 个 /mL 的接种密度接种 ST 细胞，每天取样分析细胞生长情况。根据实验结果可见，当微载体含量相等，不同的接种密度对ST细胞生长影响较大。以5 X 104、I X 105、2 X 105、3 X 1O5个/mL接种时，接种密度低，接种后5天仍在缓慢生长，没有进入稳定生长期的明显标志；以4X 105、5X 105、6X 1O5个/mL接种时接种密度高，ST细胞在接种后第2天进入稳定生长期；，随着细胞接种密度的增高，ST细胞生长速度的增加并不与细胞接种密度增加保持同步；当ST细胞接种密度为4X1IO5个/mL时，ST细胞在第4天和第5天后的生长速度要明显高于其它接种密度的生长速度，因此，本发明优选采用4 X O5个/mL的接种量接种ST细胞。
[0012]本发明通过实验发现，培养温度对于病毒的含量也有一定的影响；本发明在摇摆角度为6?，摇摆速度为14rpm条件下，分别以35°C、36°C、37°C培养病毒，分别取样，测定病毒的病毒含量，探索温度对病毒培养的影响。通过实验结果可见，在35°C下培养病毒的病毒含量仅稍高于其他两个温度，因此步骤(2)中所述的培养温度优选为35°C。
[0013]步骤(3)中所述的灭活是将病毒液用二乙烯亚胺(BEI)灭活，优选的，30°C灭活72h ;其中，BEI终浓度优选为0.04%。灭活后的猪传染性胃肠炎病毒原液加入常规油性佐剂，搅拌混匀，制得油乳剂疫苗。
[0014]本发明方法优化了波浪生物反应器培养ST细胞的各工艺参数，有效提升了 ST细胞的培养效率，最终显著提高了猪传染性胃肠炎灭活疫苗的生产效能以及免疫保护效力；免疫保护效力实验证实，本发明方法所制备的灭活疫苗对于动物有确切的免疫保护效力；本发明方法可用于大规模工业化生产猪传染性胃肠炎灭活疫苗。

[0015]下面结合具体实施方案来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0016]生物材料及仪器
[0017]1.1、生物反应器:美国Wave Biotech公司WAVE波浪生物反应器。
[0018]1.2、微载体=Cytodex-1 (购自美国通用电气医疗集团生命科学部)。
[0019]1.3、猪传染性胃肠炎病毒株:微生物保藏编号为CCTCC-V201216的毒株(中国典型培养物保藏中心))；此外，通过任何一种商业途径购买得到的猪传染性胃肠炎病毒株均能适用于本发明。
[0020]实施例1利用WAVE波浪生物反应器生产猪传染性胃肠炎灭活疫苗
[0021]1.细胞的培养
[0022]1.1微载体处理:按培养的终体积称取微载体适量，用无Ca2+、Mg2+-PBS室温浸泡过夜，弃去PBS，再用无Ca2+、Mg2+-PBS洗一次，弃去，最后加入无Ca2+、Mg2+-PBS高压灭菌。115°C、10ps1、15min。
[0023]1.2细胞复苏培养:用方瓶培养从液氮罐中复苏的ST细胞，培养条件包括:pH值
7.2、温度37°C;培养48-72h，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；该过程中使用的培养基为MEM，血清为胎牛血清，使用量为8%。。
[0024]1.3微载体培养:用EDTA-胰酶细胞消化液制备细胞悬液，细胞计数后按4 X IO5个/mL的密度接种到细胞培养袋中进行培养。培养的方法参数为:微载体浓度为4g/L、DO值50%、温度37°C、摆动角度6°、摆动速度14次/min。在培养过程中监控细胞培养袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的产生，同时在不同的节点上细胞计数(Cytodexl上的细胞计数先用PBS漂洗2次，经0.1%结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血球计数板计数细胞核)，当细胞的密度达到I X 106-2X IO6个/mL时开始灌注，依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注
0.7-2个工作体积的速度，以维持细胞的生成。
[0025]2.病毒液的增殖
[0026]当细胞培养到达第四天时沉降微载体，排出细胞培养袋中液体，加入PBS洗涤细胞，重复洗涤3次，加入病毒维持液并接种猪传染性胃肠炎病毒，其中病毒接种剂量为3%、病毒增殖的培养基为含1%血清的MEM，pH值7.4，温度35°C，摆动角度7°、摆动速度12rpm。接毒后每隔一定时间取生物反应器中的微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品TCID50，当微载体上的细胞大部分脱落，停止培养，收获病毒液，于_20°C冻融三次，得到猪传染性胃肠炎病毒原液。
[0027]2.1病毒含量的测定
[0028]利用TCID50方法进行病毒含量的测定。病毒TCID50测定时，以MEM培养液将培养得到的猪传染性胃肠炎病毒液作连续10倍稀释，即10_10_2……10_8，每个稀释度取100 μ L加入96孔细胞培养板的孔中，随后加入经胰蛋白酶-EDTA消化分散的ST细胞悬液，每孔100 μ L(细胞含量以3Χ 105/mL左右为宜)，每个稀释度作8个重复，并设正常细胞培养对照，置5%C02培养箱中，37°C培养，逐日观察细胞病变和对照，共观察2~4日，并记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。
[0029]2.2病毒培养温度的确定
[0030]接种病毒后，在摇摆角度为6°，摇摆速度为14rpm条件下，分别以35°C、36°C、37°C培养病毒,分别取样,测定病毒的病毒含量,探索温度对病毒培养的影响。由表1可以看出，在35°C下培养病毒的病毒含量仅稍高于其他两个温度，因此选择35°C为病毒培养的最佳温度。
[0031]表1不同温度对病毒培养的影响