专利名称：猪传染性胃肠炎病毒抗原融合基因及重组巨大芽孢杆菌菌株和应用的制作方法猪传染性胃肠炎是由传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)所引起的以严重腹泻、呕吐、脱水和高死亡率为主要特征的高度接触性传染病。TGEV主要存在于空肠和十二指肠，各种日龄的猪均易感。由于仔猪自身抵抗力比较差，易受外界各种刺激因素的影响和病原微生物的侵袭，常会因严重脱水而发生死亡，并以2周龄以内的仔猪死亡率最高，可达100 %。随日龄的增大，虽然其死亡率逐渐下降，但感染该病的猪生产性能下降，饲料报酬率低，给世界范围内的养猪业都带来严重的经济损失。传染性胃肠炎病毒主要通过肠道感染猪，具有明显的肠道组织嗜性的特点，在抗 TGEV感染免疫过程中除体液免疫和细胞免疫外，局部肠粘膜免疫系统发挥着不可替代的作用。常规的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治该疾病中起到了积极作用，取得良好的效果， 但是仍然存在一些问题，譬如灭活疫苗免疫原性差，不能有效诱导si gA，抵抗感染；弱毒疫苗接种后的动物机体排散病毒、病毒毒力可能返强等，另外还必须通过注射途径免疫。TGEV有三种主要结构蛋白，分别为磷酸化的核衣壳蛋白N、膜蛋白M和糖基化的纤突蛋白S，其中S糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定族，并且可以介导细胞的吸附、中和抗体的产生等过程，可以提供有效的免疫保护作用。S蛋白含有A、B、C、D四个主要抗原位点，其中A、D位点能产生中和性抗体。TGEV感染具有明显的嗜肠性，病毒粒子表面的纤突蛋白(S蛋白)与存在于肠上皮细胞顶膜的氨基肽酶(APN)的结合是感染发生的首要条件，粘膜免疫是本病特异性免疫应答的主要特征，肠道粘膜表面SIgA含量的高低直接决定临床疾病的发生和疾病严重程度。针对猪传染性胃肠炎发病的几个特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径。口服免疫突出的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，但口服免疫需要克服免疫原在到达小肠粘膜之前被降解或灭活的可能。使用细菌病毒等活载体来传递完整无损的抗原成分解决了这个问题，目前有使用减毒细菌作为疫苗抗原的载体的报道，如沙门氏菌、弱毒李斯特菌等，但沙门氏菌作为载体传递DNA疫苗可能存在毒力返强的危险，质粒DNA也可能会整合到宿主细胞基因组，引起调控细胞生长的基因紊乱、原癌基因和抑癌基因的表达失控、体细胞癌变、细胞转型等一系列问题
本发明的目的之一是提供一种猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的融合基因及其编码的蛋白；本发明的目的之二是提供含有上述猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的融合基因的重组表达载体；本发明的目的之三提供含有上述重组表达载体的重组宿主菌株。为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种由猪传染性胃肠炎病毒Sad序列与化脓链球菌细胞壁锚定序列(CWAm6)连接在一起后得到的抗原融合基因，其多核苷酸序列为 SEQ ID No. 1 所示。本发明将TGEV S蛋白中A、D抗原位点(Md)和化脓链球菌细胞壁锚定序列(CWAm6)(以化脓链球菌M6蛋白的最后140个氨基酸为细胞壁锚定序列)连接起来， 考虑到巨大芽孢杆菌使用密码子的偏嗜情况，为了提高异源基因在宿主菌中的表达，并保证翻译后的氨基酸不变的情况下，对稀有密码子苏氨酸(ACC)和异亮氨酸(ΑΤΑ)、精氨酸(AGG、CGA)等进行改变，但不改变其所编码的氨基酸。对TGEV S蛋白A抗原位点上的3个甲基化位点(AAC-AAT，ATC-ATT，ACA-ACT)进行点突变。通过两个柔性的 Linker ((GGGGS) 3)将TGEV的A、D抗原位点基因和细胞壁锚定序列(CWAm6)连接起来(顺序为D-Linker-A-Linker-CWAM6)，本发明把该序列命名为MLS(SEQ ID No. 1)。其中，在MLS 的上游和下游分别引入BglII酶切位点和SphI酶切位点。本发明的另一方面是提供由SEQ ID No. 1所示融合基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示。本发明的又一方面是提供含有所述抗原融合基因的重组表达载体，譬如，将本发明的SEQ ID No. 1所示的抗原融合基因与表达载体pHIS1525进行连接，得到可以在巨大芽孢杆菌细菌的外表面表达抗原融合基因的分泌表达载体。由此，本发明的再一方面是提供一株表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组巨大芽孢杆菌，能够用其制备成防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本发明将SEQ ID No. 1所示融合基因与分泌表达载体pHIS1525进行双酶切、连接并经原生质体转化转入巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)WH320细胞，获得含有重组质粒的巨大芽孢杆菌命名为WH320-pHIS1525-MLS，其微生物保藏号是CCTCC No :M2011429 ； 分类命名是Bacillus megaterium WH320-pHIS1525_MLS ；保藏时间是2011 年 11 月 27 日；保藏单位是中国典型培养物保藏中心；保藏地址是中国武汉武汉大学。进一步的，本发明将重组巨大芽孢杆菌WH320-pHIS1525-MLS用木糖进行诱导，使重组蛋白在巨大芽孢杆菌细胞壁表面进行表达(表达约26KDa的重组蛋白)；免疫印迹实验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性，能够用于制备成防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本发明构建了 WH320-pHIS1525-MLS表达载体系统，表达了含有TGEV蛋白A/D位点和化脓链球菌细胞壁锚定序列CWAM6连接序列MLS，目的蛋白约^kDa ；免疫印迹试验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性。间接免疫荧光检测也证实表达蛋白存在于菌体上，诱导表达后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达的蛋白初步定位于菌体的表面，存在菌体表面的目的蛋白，为抗原物质有效刺激免疫系统，提高抗体水平奠定了重要的物质基础。本发明针对TGEV发生和免疫的几个特点，在实验设计上以阻断肠道传染病疾病病原感染的第一道防线为目的，使用安全无毒的巨大芽孢杆菌表达系统，巨大芽孢杆菌不产细胞内毒素，不产胞外碱性蛋白酶，有利于所表达蛋白的稳定积累，质粒稳定，可以稳定高效地表达蛋白，比较适合工业化发酵生产。同时芽孢杆菌在肠道定植后，能消耗大量的游离氧，造成厌氧环境，可减少需氧菌对肠道的定植。也有利于乳酸杆菌和双歧杆菌等厌氧菌的生长，致使体内的有益菌增加而致病菌减少，保持肠道微生态系统平衡。本发明所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。术语“重组宿主菌株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA (肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081 (1991) ；Ohtsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985)；和 Cassol 等人，(1992) ；Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8 :91-98(1994))。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。艮口， 针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。图IPCR产物电泳结果。图2表达质粒pHIS1525的酶切鉴定结果。图3重组质粒pHIS1525-MLS的酶切和PCR鉴定结果。图4表达产物的SDS-PAGE分析；M 蛋白质分子量标准；1_3、重组巨大芽孢杆菌 WH320-pHIS1525-MLS诱导后的蛋白质；4、重组巨大芽孢杆菌WH320_pHIS1525诱导后的蛋白质。图5表达产物的间接免疫荧光检测(X40) ；A :WH320-pHIS1525-MLS重组菌的IFA试验结果，菌体细胞散发了强烈的黄绿色荧光；B :WH320-pHIS1525重组菌的IFA试验结果， 没有荧光，菌体呈红色。用量(yL) 合成基因模板ΓοdNTPs (2. 5mmol/L)2.0
引物Pl1.0引物 P21.0
IOXExTaq buffer5. 0
ExTaq DNA聚合酶1. 0
二馏水38. 0
总体积50.0Pl :5，-GA AGA TCT ATGTCTGTAAGTGATTCAAGCT 3，；P2 :5， -ACAT GCA TGC GTTTTCTTCTTTGCGTTTTAC 3，
混勻并离心后放置于PCR仪中，94°C预变性5min后，进行如下循环94°C，30s ； M°C，30s ;72°C，30s。30个循环后72°C延伸lOmin。PCR扩增完成后，取5 μ L产物用1 % 琼脂糖凝胶电泳观察。并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收酶切产物，参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收PCR反应产物，操作步骤如下将IOOyL PCR产物于1 %的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外线灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，加入3个凝胶体积的DE-A溶液(为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂)，混合均勻后于75°C加热融化。加0.5个DE-A体积的DE-B溶液(为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂)，混合均勻。取以上混合液，转移至DNA制备管中离心弃滤液。将制备管置回离心管，加
0.5mlWl溶液(为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂)，12000rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，加0. 7ml W2溶液(为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂)，12000rpm离心30s，弃滤液，重复此步骤一次。将制备管置回离心管中，12000rpm离心lmin。将制备管置于洁净的
1.5ml离心管中，在制备膜正中央加适量(20 μ L)水或洗脱液室温静置lmin，12000rpm离心 lmin洗脱DNA。取回收产物IyL 1 %琼脂糖凝胶中进行电泳，检测回收结果。并于_20°C 保存备用。PCR产物与克隆载体的连接及转化按pMD18-T Simple Vector说明书将回收的PCR产物与pMD18_T Vector连接。连接体系见表2 表2连接反应体系


本发明公开了猪传染性胃肠炎病毒抗原融合基因及重组巨大芽孢杆菌菌株和应用。本发明提供了一种由猪传染性胃肠炎病毒Sad序列与化脓链球菌细胞壁锚定序列连接在一起后得到的抗原融合基因，其核苷酸序列为SEQIDNo.1所示。本发明进一步提供了含有该抗原融合基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组巨大芽孢杆菌菌株。将本发明的重组巨大芽孢杆菌菌株用木糖进行诱导，抗原融合基因可以在该细菌细胞壁的表面进行表达。免疫印迹实验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明本发明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性，可将其制备成防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。