专利名称：奶牛乳房炎三联灭活疫苗及其制备方法奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是危害畜牧业发展、食品安全、人类健康的重大传 染病，特别是近年气候环境改变、抗生素滥用耐药，超级细菌出现，细菌感染奶牛乳房炎发 病率和死亡率逐年攀升，严重危害畜牧业发展、食品安全和人类健康，由此再次给人们敲响 警钟，奶牛乳房炎已成为国计民生的头等大事，采用免疫疫苗防控势在必行。据国际奶牛联合会报告，全球有2. 2亿头奶牛，因理化所致奶牛乳房炎发病率明 显下降，而微生物感染奶牛乳房炎呈显著上升，其发病率高达60%以上。引发奶牛乳房炎 的病原达140余种，主要是细菌类占主流，其中金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)、链球菌和 大肠杆菌感染占90%以上，且可多种病原菌共同或单独感染引起。据临床流行病学资料显 示，我国奶牛乳房炎以金葡菌、链球菌和大肠杆菌病原菌为主，占91. 4%，其中金葡菌以5、 8和336型、链球菌以无乳、停乳和乳房型、大肠杆菌0型为主，与当前国际报道感染菌种、血 清型及流行趋势相一致。奶牛乳房炎不但影响奶牛生活质量和产量，而且经济损失也明显 突出，如发达美国每年达30亿美元、英国4亿美元，我国35亿元以上，特别是我国奶制品及 肉食品抗菌素及细菌产物严重超标，已成为国计民生的社会重大问题。目前奶牛乳房炎治疗是以抗生素为首选，但大量抗生素使用造成耐药，而得不到 有效控制，已严重影响畜牧业健康发展。人们最大愿望就是通过接种疫苗有效控制奶牛乳 房炎，其目的就是增强机体免疫应答反应，特别是乳腺组织的免疫应答反应来阻止、中和、 杀灭外界进入的病原微生物，但由于乳房本身的生理特点给有效免疫力的产生带来了了一 系列特殊的挑战。第一，乳房炎是乳腺组织的炎症，然而免疫应答增强在奶牛患乳房炎的情 况下并不总是有益的。免疫反应的一个重要组成部分是大量的嗜中性粒白细胞从血液迁移 到感染的乳腺来发挥作用。在实际生产中，牛奶中出现大量体细胞并不认为是好事，因为体 细胞数量增加说明奶牛已患乳房炎，并且此时牛奶品质、产量会明显下降。第二，乳腺中的 牛奶会稀释抗感染的嗜中性粒细胞的浓度，而且牛奶中的一些成分，像脂肪和酪蛋白能降 低抗感染嗜中性粒细胞的杀菌能力。第三，奶牛饲养有大量可引起乳房炎的微生物的环境 中，而且奶汁本身给病原菌生长提供了温床。因此，使奶牛乳腺产生有效的免疫力，降低乳 房炎的发生率，需要攻克的难题较多，给奶牛乳房炎疫苗研发提出比其它传染病疫苗更高 的要求。细菌感染奶牛乳房炎菌多而复杂，主要是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、链球菌(Streptococcus)禾口大肠杆菌(Escherichia coli),与宿主交互作用免疫应答及免疫保护复杂性，疫苗佐剂在疫苗中发挥的重要作用更佳凸现，它决定免疫抗原 走向及免疫应答特征，已成为奶牛乳房炎疫苗研发的重要内容。目前动物疫苗使用的多 为白花油佐剂，能产生高滴度血清抗体，但没有黏膜和细胞免疫应答，尤其是副作用大，而 影响奶牛质量和奶产量及生活质量。近些年，以色列Gabriel Leitner等研制的奶牛乳 房炎金黄色葡萄球菌苗“MASTIVACS I”，曾与 FIA(freund，s incomplete adjuvant)和 ISA206 (vaccine adjuvantfor w/o/w emu si on based onmineral oil)佐齐 Ll 效果比较，发 现FIA对小鼠的刺激性较大，认为ISA206佐剂比较适合。我国罗金印等曾研制的氢氧化铝 佐剂灭活苗、靳亚平等研制的葡聚糖、油佐剂和弗氏不完全佐剂奶牛乳房炎疫苗结果表明， 3种以FIA佐剂效果最好，但存在副作用大。本发明者采用SPOl佐剂(角鲨烯、聚氧乙烯蓖 麻油和聚醚水包油佐剂)、SP02佐剂(角鲨烯、聚氧乙烯蓖麻油和聚醚水包油佐剂并加入重 组细菌鞭毛)作为奶牛乳房炎灭活疫苗佐剂。结果显示SP01、SP02佐剂具有全面免疫应答 效果，且副作用显著低于白花油和FIA佐剂，成为新一代有发展前途的疫苗新佐剂。金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌是最常见奶牛乳房炎的病原菌之一，其致病 复杂与其荚膜多糖(Capsular polysaccharides, CPs)和外毒素、黏附素等紧密相关，对奶 牛危害最大，是最顽固的一种乳腺炎病原菌。大部分金葡菌、链球菌和大肠杆菌感染会造成 隐性乳腺炎，持续时间长，继而转变成慢性感染，主要的经济损失来自牛奶产量下降及牛奶 品质降低。疫苗是通过增强机体免疫系统的功能从而使机体获得抗病能力，因此研制安全、 全面有效的奶牛乳腺炎疫苗成为防控乳腺炎的必由选择。奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的主 要有5、8、336、化脓、肺炎等血清型金葡菌，其中5、8和336型占金葡菌感染的93%以上； 链球菌乳房炎的主要有无乳、停乳、乳房、化脓、肺炎等血清型链球菌，其中最为重要的是停 乳、无乳和乳房链球菌三个血清型，占链球菌感染的92%以上；大肠杆菌按0抗原分有130 多个型。疫苗是预防传染病最有效的手段，针对奶牛5、8和336型金葡菌乳房炎三价灭活 全菌疫苗已在美国及欧洲一些国家使用，从已使用结果看免疫保护效果不全面，国内至今 没有批准奶牛金葡菌乳房炎疫苗上市或成功的报道；针对奶牛无乳、停乳和乳房链球菌性 乳房炎三价灭活疫苗至今国内外还没有商品化疫苗面市和成功的研究报道；针对奶牛大肠 杆菌乳房炎灭活疫苗，美国研发的J-5大肠杆菌灭活疫苗已在本国和欧洲等地得到了广泛 应用，随后美国加州大学进入中国推广没有得到认可，国内处于实验室研究阶段。由此从已 有的奶牛金葡菌乳房炎疫苗结果看，灭活全菌疫苗保护效果不全面，与没有足够荚膜多糖 保护性抗原有关，且使用白花油佐剂副作用大而影响疫苗效果，因此迫切需要改变思路发 展优势流行菌株和适应环境的疫苗迫在眉睫。发明创造内容本发明目的在于公开一种奶牛金黄色葡萄球5、8、336血清型、链球菌无乳、停乳 和乳房血清型、基因定点缺失大肠杆菌重组工程菌乳房炎三联灭活(全菌、全菌+荚膜多 糖、荚膜多糖结合蛋白)疫苗；本发明目的还在于公开该疫苗的制备方法；本发明的目的还 在于公开该疫苗可安全、稳定、全面有效预防金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌感染性奶 牛乳房炎的发生。本发明目的是通过如下方案及制备方法和应用实现的1、通过对我国内蒙古、重庆、广州、黑龙江、兰州、河北、山东等东西南北中30个省市90个大中型奶牛场、近3万头奶牛乳腺炎奶样金葡菌、链球菌、大肠杆菌分离、鉴定，筛选 并确定金葡菌流行优势株是5、8和336血清型、链球菌流行优势株是无乳、停乳和乳房血清 型、大肠杆菌0008、01216、02138、02555等为我国奶牛乳腺炎感染流行优势菌株，三种细菌 占感染菌的92%以上。在本发明的方法中，包括但不限于5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球 菌、0008、01216、02138和02555型大肠杆菌作为奶牛乳腺炎优势流行菌株；包括任何适宜 于当前和今后广泛流行金葡菌、链球菌、大肠杆菌野生株、突变株。2、通过构建自杀性致死质粒pCVD442_galE系统，运用同源重组常规方法敲除 0008、01216、02138和02555大肠杆菌候选优势菌株的LPS编码基因galE以暴露其核心 抗原，而不影响除0抗原之外的其它抗原的免疫原性，筛选并命名为X-10、X-89、X-326、 X-2138和X-2555大肠杆菌重组工程菌(简称X-大肠杆菌)株，在体外普通培养基中生长 良好，传代稳定、免疫原性良好的奶牛大肠杆菌乳房炎疫苗优势候选菌株。在本发明的方法中，包括但不局限X-10、X-89、x-326、X_2138和X-2555大肠杆菌 重组工程菌株作为奶牛乳腺炎疫苗候选优势菌株；包括通过该方法制备的奶牛大肠杆菌基 因工程菌(称奶牛大肠杆菌，又称X-大肠杆菌)株均可用作为候选疫苗株。3、制备了奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房链球菌、X_10、X-89、 X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌优势流行菌株兔抗血清，分别与已有国内外临床分离奶 牛乳房炎金葡菌、链球菌和大肠杆菌菌代表株进行中和试验，其免疫交叉保护达96%以上， 由此选用的5、8、336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X-10、X-89、X-326、Χ-2138和 Χ-2555等大肠杆菌感染奶牛乳房炎优势疫苗菌株具有代表国内外流行株。4、选用5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、Χ_10、Χ-89、Χ-326、 Χ-2138和Χ-2555大肠杆菌感染奶牛乳房炎优势疫苗株，通过培养传代、建立了 5、8和336 型金葡菌、无乳、停乳和乳房链球菌、X-10、X-89、X-326、Χ-2138和Χ-2555等大肠杆菌奶牛 乳房炎灭活疫苗原始种子批、主种子批和工作种子批库，进一步通过理化性质、基因特征、 毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的奶牛乳房炎三联灭活疫苗菌株三级种子批库符合 疫苗生产用要求。在本发明专利中，包括但不限于5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、 Χ-10、Χ-89、Χ-326、Χ-2138和Χ-2555大肠杆菌重组工程菌株作为奶牛乳腺炎疫苗候选优势 菌株建立种子批库；包括适用于当前和今后广泛流行的金葡菌、链球菌、大肠杆菌野生株、 突变株建立疫苗株种子批库。5、通过奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房链球菌、Χ_10、Χ_89、 X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌三联灭活菌苗工作种子批株，从IOL到1000L发酵放大 培养，制备了奶牛乳房炎三联灭活菌苗原液，经甲醛灭活、离心分离、生化提取制备纯化5、8 和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房链球菌、X-10、X-89、X-326、Χ-2138和Χ-2555大肠杆菌 血清型灭活全菌、荚膜多糖抗原，抗原纯度达95% ；通过对温度、时间、接种量等培养条件的 优化，获得了规模化生产灭活全菌、荚膜多糖疫苗抗原原液；进一步进行血清型别、理化性 质、基因特征、外源因子、免疫原性等全面鉴定。在本发明专利中，包括不限于5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、 X-10、x-89、x-326、Χ-2138和Χ-2555大肠杆菌菌苗工作种子批株、BHI、TSB培养基用于疫苗原液规模化生产；包括适用于当前和今后广泛流行的候选金葡菌新优势疫苗菌株及LB等培养基介质。6、纯化的奶牛5、8和336血清型金黄色葡萄球菌、无乳、停乳和乳房链球菌乳房 炎灭活荚膜多糖疫苗原液，用偶联剂与破伤风毒素蛋白(TT)、白喉毒素蛋白(DT)、无毒力 白喉毒素蛋白(CRM197)或其他合适的载体蛋白分子。依Pr-L-Ps结构式偶联，其中，Pr 是载体蛋白，Ps是奶牛金葡菌荚膜多糖，L是共价键、或连接基团，且Ps Pr的质量比为 0.5-3.5 1。先采用溴化氢活化多糖，然后再采用碳二亚胺将活化的多糖与蛋白共价偶 联。制备出奶牛金葡菌、链球菌乳房炎荚膜多糖结合蛋白抗原原液，TT或DT或CRM197载 体蛋白与各血清型荚膜多糖结合蛋白都有好的交联效果，交联率达85%以上，由此TT或DT 或CRM197均可作为该疫苗载体结合蛋白。在本发明专利中，包括但不限于5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌 灭活荚膜多糖和TT、DT、CRM197交联载体蛋白；包括适用于当前和今后广泛流行金葡菌、链 球菌株荚膜多糖及其他载体蛋白。7、制备的有效剂量纯化奶牛5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌乳房 炎灭活全菌(比如1 10 X IOltlCFU)、全菌(比如1 10 X IOltlCFU) +荚膜多糖(比如10 60Ug)抗原、荚膜多糖结合蛋白抗原(比如40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT或CRM197)、 X-IO大肠杆菌乳房炎灭活全菌(比如1 10X101(ICFU)，与常规用量的白花油、FIA、铝盐、 MF59.SP01和SP02等疫苗佐剂均勻，制备奶牛乳房炎三联(金葡菌、链球菌、大肠杆菌)灭 活全菌、全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c鼠、家兔和奶牛动物，间 隔28天，皮下或肌肉或乳头管或微针透皮免疫2次，间断采集奶汁、血清、血细胞及脾细胞， 观察奶牛产奶量与质量、体温、体重、体细胞计数、细菌计数及ELISA、ELISP0T测定抗体效 价、细胞免疫水平及死亡情况。试验结果可见，这几种佐剂均能提高奶牛乳房炎灭活疫苗抗 体滴度、依次是FIA、白花油、SP01、MF59和铝盐佐剂，且在不同动物呈现一致性趋势。由此 SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐均可有效的作为奶牛乳房炎三联灭活疫苗的佐剂。 在本发明专利中，包括但不限于SPO1、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一 种或几种用于奶牛乳房炎三联灭活疫苗的制备；包括免疫刺激复合物、细胞因子、脂质体等 佐剂。 8、本发明的奶牛乳房炎三联灭活疫苗可不含有佐剂，也可以含有SP01、SP02、 MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一种或几种，①制备有效剂量的有或无佐剂的奶牛乳房 炎单联灭活(比如1 10 X IOiciCFU金葡菌或1 10 X IOiciCFU链球菌或1 10 X IOiciCFU X-大肠杆菌)全菌疫苗注射剂型、三联灭活(比如1 IOX IOltlCFU金葡菌+1 IOX IOltlCFU 链球菌+1 IOXIOiciCFU χ-大肠杆菌)全菌疫苗注射剂型；②制备有或无佐剂的奶牛乳 房炎单联灭活(比如1 10 X IO10CFU全菌+荚膜多糖10 60Ug金葡菌、1 10 X IO10CFU 全菌+荚膜多糖10 60Ug链球菌)疫苗注射剂型、三联灭活(比如1 10 X IOltlCFU全菌 +荚膜多糖10 60Ug金葡菌+1 IOX IOltlCFU全菌+荚膜多糖10 60Ug链球菌+1 IOXIO10CFU Χ-大肠杆菌)全菌+荚膜多糖疫苗注射剂型；③制备有或无佐剂的奶牛单联 灭活(比如40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT或CRM197金葡菌或链球菌)荚膜多糖结 合蛋白疫苗注射剂型、三联灭活(比如40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT或CRM197金葡 菌 +40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT 或 DT 或 CRM197 链球菌 +1 10 X IO10CFU X-大肠杆菌)8荚膜多糖结合蛋白疫苗注射剂型、微针透皮剂型。9、本发明的奶牛乳房炎三联灭活疫苗注射剂型可皮下注射，也可以肌肉、乳头管 注射，也可以微针透皮，也可以一种或几种途径联合免疫，制备有或无佐剂的奶牛乳房炎不 同剂量单联、三联灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫 BALB/c、豚鼠、家兔和奶牛动物，观察过敏性反应、异常毒性、热源质反应、一般毒性。结果表 明奶牛乳房炎三联灭活疫苗制品接种动物是安全的。10、本发明的奶乳房炎三联灭活疫苗有或无佐剂的灭活单、三联不同剂量灭活全 菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c、家兔和奶牛动 物，间断采集奶汁、血清、血细胞及脾细胞，观察奶牛奶产量、奶汁质量、体温、体细胞计数、 细菌数、抗体效价、脾细胞计数及细胞因子变化，通过量效、时效、次效测定抗体和细胞免 疫水平以评价免疫原性；进一步在2-3岁即将进入泌乳期(即产前25d，怀孕8个月20d) 健康奶牛，有效免疫剂量是灭活全菌疫苗(比如5X IOltlCFU)、灭活全菌+荚膜多糖(比如 5X101QCFU+50UgCPs)、荚膜多糖结合蛋白(比如 50UgCPs+20UgTT 或 DT 或 CRM197)疫苗，0， 28，56天各免疫1次(即产前25天，产后3天、31天)，末次免疫后14天用1500CFU (5、8、 336型金葡菌、无乳、停乳、乳房型链球菌、01111、0157型大肠杆菌)野生菌株乳头管内注 射攻毒，间断采集奶汁、血清、血细胞及脾细胞，观察奶牛奶产量、奶汁质量、体温、体细胞计 数、细菌数、抗体效价、脾细胞计数及细胞因子等指标评价免疫保护率。结果显示，制备的不 管是皮下或是以肌肉或是乳头管注射、不管是有佐剂或是无佐剂奶牛乳房炎三联灭活疫苗 都有产生高效价抗体滴度，与剂量呈相关，且5X 101(lCFU、50UgCPS、20Ug TT或DT或CRM197 达到平台期，加佐剂好于无佐剂组，三联联好于单联、且有叠加效应，荚膜多糖好于灭活全 菌疫苗，在不同动物有一致免疫应答趋势，加荚膜多糖可提高免疫保护率，在奶牛体内免疫 保护率90%以上。9、本发明的奶牛乳房炎三联灭活疫苗有或无佐剂的灭活单价、多价不同剂量 灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗制品，分别置于4°C、室温 (20-25) °C和37°C，从外观、pH、蛋白含量、动物免疫原性等指标观察疫苗稳定性。结果表明， 奶牛乳房炎三联灭活疫苗制品放置2 8°C稳定性良好，有效期2年以上。10、在本发明的方法中，可以采用任何适宜于制备灭活全菌体、全菌+荚膜多糖、 荚膜多糖结合蛋白疫苗的奶牛乳房炎金葡菌、链球菌、大肠杆菌各血清型株进行疫苗生产， 但疫苗株的选择应具有代表性，依据流行病学调查资料选择的、当前和今后广泛流行的野 生株。另外，菌株产量高、诱导免疫保护的能力强、交叉保护谱广、稳定。11、本发明的奶牛乳房炎三联灭活疫苗用于不同品种、不同年龄奶牛乳房炎的免 疫预防。综上所述该疫苗主要含有含奶牛乳房炎5、8、336型金黄色葡萄球菌、无乳、停乳、乳房型链 球菌、0008、01216、02138和02555等大肠杆菌株，具有代表我国金葡菌、链球菌、大肠杆菌 感染所致奶牛乳房炎优势流行菌株；敲除0008、01216、02138和02555等大肠杆菌LPS编 码基因galE，筛选大肠杆菌缺乏鸟苷二磷酸半乳糖异构酶突变菌株，命名为X-IO大肠杆菌 菌株，具有G-广谱性。优势野菌株、突变株，制备的5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X-IO大肠杆菌菌兔抗血清，与现有国内外临床分离奶牛乳房炎金葡菌、链球菌、大肠杆菌代 表株免疫交叉中和达97%以上，由此选择5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、 X-IO大肠杆菌菌具有代表国内外奶牛乳房炎流行株和疫苗株特征。建立符合疫苗生产要求的5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X-IO 大肠杆菌菌及各突变株的奶牛乳房炎灭活疫苗原始种子批、主种子批和工作种子批库。通过BHI、BST、LB培养基放大培养工业化生产，制备奶牛乳房炎5、8和336型金葡 菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X-IO大肠杆菌菌苗原液，经甲醛灭活、离心分离、生化提取 制备了纯化5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X-IO大肠杆菌菌灭活全菌。通过BHI、TSB、LB等培养基放大培养工业化生产，制备奶牛乳房炎5、8和336型金 葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌菌苗原液，经甲醛灭活、离心分离、生化提取制备了纯化5、 8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌荚膜多糖抗原。制备的5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌荚膜多糖抗原用溴化氢、 碳二亚胺偶联剂与TT、DT、CRM197或其他合适的载体蛋白共价偶联出奶牛乳房炎5、8和336 型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌荚膜多糖结合蛋白。任一所述的奶牛5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X_10大肠杆菌 乳房炎灭活全菌疫苗、灭活全菌+荚膜多糖疫苗、灭活荚膜多糖结合蛋白疫苗。疫苗中不含有佐剂，制备无佐剂奶牛乳房炎三联灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖 疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗。该疫苗中含有佐剂，佐剂为如下的一种①白花油，为商品化佐剂；②FIA，为商 品化佐剂；③铝盐，为氢氧化铝或磷酸铝；④MF59，为商品化佐剂；⑤SP01，为2%角鲨烯、 0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚混勻水包油样；⑥SP02，为2%角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖 麻油、0. 聚醚、IOug细菌鞭毛混勻水包油样。佐剂也可如上的两种或多种组合或其它佐 剂。制备有佐剂的奶牛乳房炎三联灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白 疫苗。该疫苗制备成临床适用的注射剂型包括皮下注射剂型、肌肉注射剂型、乳头管注 射剂型、微针透皮剂型。该疫苗有或无佐剂奶牛乳房炎三联灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多 糖结合蛋白疫苗通过皮下或肌肉或乳头管注射，表明该疫苗都能产生良好的免疫应答，皮 下注射高于肌肉、乳头管途径；免疫加佐剂好于无佐剂组；有荚膜多糖好于灭活全菌疫苗； 在不同动物有一致免疫应答趋势，奶牛乳房炎三联灭活疫苗在奶牛体内免疫保护率90%以 上。该疫苗制品在动物体内使用安全，无不良反应。该疫苗制品放置2 8°C稳定性良好，有效期在2年以上。该疫苗制品通过皮下注射、肌肉注射、乳头管注射、微针透皮用于不同品种、不同 年龄奶牛免疫接种，可安全、稳定、全面有效预防金葡菌、链球菌、大肠杆菌感染性奶牛乳房 炎的发生。本发明的优点是选择我国奶牛乳房炎金葡菌、链球菌和大肠杆菌优势流行菌株 作为疫苗株、通过灭活全菌、灭活全菌+荚膜多糖及荚膜多糖结合蛋白为疫苗靶抗原、加入 或不加入佐剂，制备奶牛乳房炎三联(金葡菌+链球菌+大肠杆菌)灭活疫苗(灭活全菌10疫苗、灭活全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白疫苗)注射剂型、微针透皮剂型，为安全、稳 定、全面有效预防金葡菌、链球菌和大肠杆菌感染性奶牛乳房炎的发生提供了有力保证，将 是奶牛乳房炎疫苗发展的新里程碑。下面参考实施例对本发明作进一步说明。给出这些实施例只是为了举例说明，它 们不以任何方式限制本发明的范围。5.致病性分析将其分离金葡菌、链球菌、大肠杆菌主要血清型奶牛乳房炎菌株 在TSB、LB培养基培养传代，分离纯化各血清型金葡菌、链球菌、大肠杆菌菌株分别注入 6-18周BALB/c鼠腹腔3 X IO8个活菌、1. 5-2岁家兔腹腔IX IO9个活菌数、3_4岁奶牛乳 管1200个活菌，可使小鼠、家兔动物发病，甚至在1周内死亡，对奶牛观察产奶量与质量、体 温、体重、体细胞数、细菌数等。对接种后发病、死亡动物肝脏、奶牛乳房进行病原菌重分离。 进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查，观察所分离菌株为5、8和336型金葡菌、无乳、停 乳和乳房型链球菌、0008、01216、02138和02555大肠杆菌等血清型奶牛乳房炎主要的致病 菌。以上通过选择性培养基上分离与筛选、生化鉴定、基因分析、BALB/c、家兔、奶牛动 物的致病性等评价，确定了 5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、0008、01216、 02138和02555大肠杆菌株主要血清型为我国流行优势株，占奶牛乳房炎的93%，为候选奶 牛乳房炎优势疫苗株提供了依据。实施例2 构建并筛选奶牛乳房炎大肠杆菌基因工程优势菌株作为疫苗菌株1.采用致死质粒同源重组方法，通过构建自杀性致死质粒pCVD442_galE，运用同 源重组常规方法敲除0008、01216、02138和02555等大肠杆菌候选优势菌株的LPS编码基 因galE以暴露其核心抗原，影响脂多糖合成，而不影响除0抗原之外的其它抗原的免疫原 性，筛选大肠杆菌缺乏鸟苷二磷酸半乳糖异构酶突变菌株；2.从中筛选到并命名为乂-10、乂-89、乂-326、乂-2138和乂-2555等大肠杆菌基因工 程菌株，在体外普通培养基中生长良好，该菌株免疫Balb/c小鼠、豚鼠具有良好免疫原性， 初步确定为奶牛大肠杆菌乳房炎疫苗优势候选菌株。进一步检定并筛选奶牛乳房炎大肠杆 菌基因工程优势菌株，经全面检定把X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌基因工 程菌株(又称X-大肠杆菌菌株)作为奶牛乳房炎灭活疫苗菌株。将重配的X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌疫苗株，与从ATCC购买 的J-5标准血清进行玻片凝集，结果显示重配疫苗株具有型特异性，而没有交叉反应。实施例3 制备奶牛乳房炎优势疫苗菌株免疫血清及检定从确定具有代表性5、8和336血清型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X_10、 X-89、X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌奶牛乳房炎流行优势株，制备5、8和336血清型金 葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X-10、X-89、Χ-326、Χ-2138和Χ-2555大肠杆菌主要血清 型菌株抗原，分别用3 5 X 107CFU/lml剂量皮下免疫家兔(抗原及抗体阴性)，免后21天 心脏放血，血清抗体效价达到1 1600以上，再分别与临床分离奶牛金葡菌、链球菌、大肠 杆菌主要乳房炎毒株、购买美国ATCC和中国菌种库主要奶牛乳房炎标准株进行免疫试验， 结果显示免疫中和交叉率达95%以上，由此确定所选用奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、无 乳、停乳和乳房型链球菌、X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌血清型优势疫苗株 具有广泛的代表性。实施例4 建立奶牛乳房炎灭活疫苗株三级种子批库及检定从确定具有代表奶牛乳房炎5、8和336血清型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球 菌、X-IO型大肠杆菌疫苗优势株，分别接种于培养基中，37°C培养24小时，收取菌液，建立 奶牛乳房炎三联灭活疫苗三级种子批库及全面检定。1.原始种子批的建立选取奶牛乳房炎5、8和336血清型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X-IO型大肠杆菌优势株菌落划线接种5%绵羊血琼脂培养基上培养，置37°C 培养20-24小时培养，用脱脂牛奶冲下，第二代作为原始种子批库，加入5%脱脂奶粉分装 于冻存管，冻干后-70°C以下长期保存。2.主种子批的建立取第二代5、8和336血清型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球 菌、X-IO型大肠杆菌疫苗原始种子批菌株接种于BHI或LB培养基，37°C培养20-24小时， 第三代作为主种子批库，加入5%脱脂奶粉分装于冻存管，冻干后-70°C以下长期保存。3.工作种子批的建立取第三代5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球 菌、X-IO型大肠杆菌疫苗主种子批菌株接种于BHI或LB培养基，37°C培养24小时，第四代 作为主种子批库，加入20%的甘油分装于培养瓶内，放置_70°C保存。4.三级种子批的检定通过对奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房 型链球菌、X-IO型大肠杆菌疫苗菌株原始种子批、主种子批、工作种子批菌株以及传代30 代菌株的外观、血清型别、PH值、溶解时间、水分含量、菌落变异率、形态与染色、菌株质粒图 谱、荚膜多糖、菌株毒性和免疫原性进行了全面检定。结果显示，建立的奶牛5、8和336型金 葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X-IO型大肠杆菌金葡菌乳房炎疫苗三级种子批库安全、 稳定，符合疫苗生产的要求。实施例5 规模化发酵培养奶牛乳房炎灭活疫苗原液及灭活取奶牛5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X_10大肠杆菌乳房炎三 联灭活疫苗工作种子批库菌株，接种于IOL细菌培养罐的BHI或LB培养基，37°C培养24h ； 然后转接于1000L发酵罐中进行培养，37°C培养约20h，收获菌液，取样作纯检并计算菌数； 随后加入终浓度为0. 4%的甲醛溶液(v/v)，37°C，转速150rpm，灭活36_48h。随机取样连 传三代无细菌生长，用无热源的PBS洗菌三次，每次4°C，6500rpm离心15min，沉淀用于制备 灭活全菌疫苗抗原，金葡菌、链球菌培养液离心上清液用于制备荚膜多糖疫苗抗原。实施例6 纯化奶牛乳房炎灭活全菌、荚膜多糖及检定1.制备灭活全菌抗原取规模化发酵培养的奶牛5、8和336型金葡菌、无乳、停乳 和乳房型链球菌、X-IO型大肠杆菌乳房炎疫苗灭活全菌，用PBS洗涤2次，6500rpm/min, 4°C 离心15min，要沉淀，用PBS溶解，测定含量，冻干或液体为纯化的灭活全菌疫苗抗原。2.粗提荚膜多糖抗原取规模化发酵培养的奶牛5、8和336型金葡菌、无乳、停 乳和乳房型链球菌乳房炎疫苗发酵上清液，加入终浓度为1 %的十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)，连续搅拌后4°C静置过夜，10000rpm/min离心收沉淀为复合多糖。将复合多糖溶入 2M氯化钙溶液，使十六烷基三甲基溴化铵与多糖解离，加入终浓度为25 %的乙醇，4°C静置 3h或过夜，5000rpm，4°C离心30min去核酸沉淀。收集澄清的上清液，中加入冷却的终浓度 为80%的乙醇，4°C静置3h或过夜沉淀多糖，IOOOOrpm, 4°C离心15min，收集沉淀为粗糖，用 无水乙醇及丙酮各洗2次，干燥，即为多糖粗制品，放置-20°C以下备用。3.纯化荚膜多糖抗原将奶牛5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌荚 膜多糖粗制品溶解于10%饱和中性乙酸钠中，按1 2容量用冷酚提取2-4次，lOOOOrpm， 4°C离心20min，收集上清液，用0. IM氯化钙溶液透析过夜，再加无水乙醇至终浓度为75%， 充分振摇，4°C静置3h或过夜沉淀多糖，lOOOOrpm，4°C离心20min，收集沉淀，用无水乙醇及 丙酮各洗2次，测含量，冻干或液体即得纯化荚膜多糖抗原。4.荚膜多糖抗原的鉴定纯化的奶牛5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌乳房炎疫苗荚膜多糖抗原，通过核酸、蛋白、总氮、总磷、分子大小、纯度、糖醛酸、氨基 己糖和甲基戊糖等指标检测。结果显示，制备的奶牛5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房 型链球菌乳房炎疫苗荚膜多糖抗原纯度达到95%以上，呈单各血清型荚膜多糖抗原成分。实施例7 制备奶牛乳房炎荚膜多糖结合蛋白抗原及检定将纯化奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌荚膜多糖分别 加入溴化氢(多糖与溴化氢的重量比例为1 0.5)活化，再加入己二酰井处理，衍化率为 1-3%。再加入TT或DT蛋白或CRM197和碳二亚胺(19. 17mg/ml)，反应得到金葡菌荚膜多 糖与TT或DT蛋白或CRM197的化学共价偶联物。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即 将荚膜多糖结合蛋白抗原，悬浮于lOOmMTris，pH8. 6缓冲液中，再经过分子筛柱层析进行 分离，去除未结合的蛋白，分离后的溶液除菌过滤后，即为荚膜多糖结合TT或DT或CRM197 蛋白抗原。通过高压液相纯度、外源因子测定，结果显示荚膜多糖结合蛋白纯度达95%、偶 联率达88%，呈单一结合物成分，无外源因子。实施例8 制备奶牛乳房炎三联灭活疫苗及检定1.奶牛乳房炎三联(5、8和336型金葡菌+无乳、停乳和乳房型链球菌+X_10型 大肠杆菌)灭活(全菌)疫苗①将纯化奶牛5、8和336型金葡菌+无乳、停乳和乳房型 链球菌+X-IO型大肠杆菌灭活全菌抗原不加佐剂，配制1 X 1010CFU/lml,5X1010CFU/5ml 无佐剂注射剂型；②将纯化奶牛5、8和336型金葡菌+无乳、停乳和乳房型链球菌+X-IO 型大肠杆菌灭活全菌抗原加入氢氧化铝或磷酸铝，配制1 X 101(lCFU/0. 5mg (铝盐)/1ml、 5X1010CFU/2. 5mg (铝盐)/5ml有铝盐佐剂注射剂型；③将纯化奶牛5、8和336型金葡菌+ 无乳、停乳和乳房型链球菌+X-IO型大肠杆菌灭活全菌抗原加入等量SPOl佐剂(2%角鲨 烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)或SP02佐剂(2%角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、 0. 聚醚、IOug细菌鞭毛)混勻水包油样，配制1 X 1010CFU+0. 5ml SPOl (或SP02)/lml、 5X1010+2. 5mlSP01 (或SP02CFU) /5ml有SPOl或SP02佐剂注射剂型；④将纯化奶牛5、8和 336型金葡菌+无乳、停乳和乳房型链球菌+X-IO型大肠杆菌灭活全菌抗原加入等量白花 油佐剂混勻油包水样，配制1X101qCFU+0. 5ml白花油(IFA)/lml、5X 10lclCFU/+2. 5ml白花油 (IFA)/5ml有白花油佐剂注射剂型，以上注射疫苗剂型可用为皮下注射、肌肉注射、乳头管 注射、微针透皮剂型，放置2-8 °C备用。2.奶牛乳房炎三联(5、8和336型金葡菌+无乳、停乳和乳房型链球菌+X-IO 型大肠杆菌)灭活(全菌+荚膜多糖)疫苗①将纯化奶牛5、8和336型金葡菌+无 乳、停乳和乳房型链球菌+X-IO型大肠杆菌灭活全菌+荚膜多糖抗原不加佐剂，配制 5 X 10lclCFU+10ugCPs/lml、10 X 10lclCFU+100ugCPs/5ml 无佐剂注射剂型；②将纯化奶牛 5、8和336型金葡菌+无乳、停乳和乳房型链球菌+X-IO型大肠杆菌灭活全菌+荚膜 多糖抗原加入氢氧化铝或磷酸铝，分别配制5 X 1010CFU+10ugCPs/0. 5mg (铝盐)/lml、 10X1010CFU+100ugCPs/2. 5mg(铝盐)/5ml有铝盐佐剂注射剂型；③将纯化奶牛5、8和 336型金葡菌+无乳、停乳和乳房型链球菌+X-IO型大肠杆菌灭活全菌+荚膜多糖抗 原加入等量SPOl佐剂(2%角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)或SP02佐剂 (2%角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug细菌鞭毛)混勻水包油样，配制 5X 10lclCFU+10ugCPs+0. 5ml SPOl (或 SP02) /lml, 10 X 10lclCFU+100ugCPs+2. 5ml SPOl (或 SP02)/5ml有SP01、SP02佐剂注射剂型；④将纯化奶牛5、8和336型金葡菌+无乳、停乳和乳房型链球菌+X-IO型大肠杆菌灭活全菌+荚膜多糖抗原加入等量白花油佐剂混勻油包水 样，分别配制 5X10lclCFU+10ugCPs+0. 5ml 白花油(IFA)/lml, 10X 10lclCFU+100ugCPs+2. 5ml 白花油(IFA)/5ml有白花油佐剂注射剂型，以上注射疫苗可作为皮下注射、肌肉注射、乳头 管注射、微针透皮剂型，放置2-8 °C备用。3.奶牛乳房炎三联(5、8和336型金葡菌+无乳、停乳和乳房型链球菌+X_10型大 肠杆菌)灭活荚膜多糖结合蛋白疫苗①将纯化奶牛5、8和336型金葡菌荚膜多糖结合蛋 白(载体蛋白TT或DT或CRM197) +无乳、停乳和乳房型链球菌荚膜多糖结合蛋白(载体蛋 白TT或DT或CRM197) +X-IO型大肠杆菌灭活全菌抗原不加佐剂，配制50ugCPs+20ugTT (或 DT 或 CRM197)+lX10lclCFU/lml、100ugCPs+50ugTT(或 DT 或 CRM197)+5 X 10lclCFU/5ml 无 佐剂注射剂型；②将纯化奶牛5、8和336型金葡菌荚膜多糖结合蛋白(载体蛋白TT或 DT或CRM197)抗原+无乳、停乳和乳房型链球菌荚膜多糖结合蛋白(载体蛋白TT或DT 或CRM197)抗原+X-IO型大肠杆菌灭活全菌抗原加入等量氢氧化铝或磷酸铝，分别配制 50ugCPs+20ugTT (或DT 或CRM197) +1 X 10lclCFU/0. 5mg (铝盐)/lml、100ugCPs+50ugTT (或DT 或CRM197) +5 X 1010CFU/2. 5mg (铝盐)/5ml有铝盐佐剂注射剂型；③将纯化奶牛5、8和336 型金葡菌荚膜多糖结合蛋白(载体蛋白TT或DT或CRM197)抗原+无乳、停乳和乳房型链球 菌荚膜多糖结合蛋白(载体蛋白TT或DT或CRM197)抗原+X-IO型大肠杆菌抗原加入等量 SPOl佐剂(2%角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)、SP02佐剂(2%角鲨烯、0. 1% 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug细菌鞭毛)混勻水包油样，分别配制50UgCPS+20UgTT (或 DT 或 CRM197) +1 X 10lclCFU+0. 5ml SPOl (或 SP02 或 CRM197)/lml、100ugCPs+50ugTT (或 DT
CRM197) +5 X 1010CFU+2. 5ml SPOl (或 SP02)/5ml 有 SPOl、SP02 佐剂注射剂型；④将纯 化奶牛5、8和336型金葡菌荚膜多糖结合蛋白(载体蛋白TT或DT或CRM197)抗原+无 乳、停乳和乳房型链球菌荚膜多糖结合蛋白(载体蛋白TT或DT或CRM197)抗原+X-10型 大肠杆菌抗原加入等量白花油或IFA佐剂混勻油包水样，分别配制50UgCPs+20UgTT(或 DT 或 CRM197)+lX10lclCFU+0. 5ml 白花油或 IFA/lml、100ugCPs+50ugTT (或 DT 或 CRM197)+5X1010CFU+2. 5ml白花油或IFA/5ml有白花油佐剂注射剂型，以上注射疫苗可作 为皮下注射、肌肉注射、乳头管注射、微针透皮剂型，放置2-8°C备用。4.将本发明实施例8制备的奶牛乳房炎三联(金葡菌、链球菌、大肠杆菌)灭活 (全菌、全菌+荚膜多糖、全菌+荚膜多糖结合蛋白)疫苗有佐剂或无佐剂剂型进行安全 性评价。结果可见，奶牛金葡菌乳房炎三联灭活疫苗外观见均一，无异味和染菌；PH7. 0 7. 2，通过豚鼠、家兔试验无热原、异常毒性和急性毒性反应；通过染色和镜检无杂菌污染、 热源质检测在范围内；通过SDS-PAGE和WB检测抗原蛋白成分存在；通过免疫Balb/C小鼠 1次血清中和抗体效价在1600以上。实施例9 本发明的奶牛乳房炎三联灭活疫苗在动物体内的免疫效果评价1.将本发明实施例8制备的奶牛乳房炎三联(金葡菌、链球菌、大肠杆菌)灭活 (全菌、全菌+荚膜多糖、全菌+荚膜多糖结合蛋白)疫苗及金葡菌三价灭活荚膜多糖结合 蛋白、链球菌三价灭活荚膜多糖结合蛋白、大肠杆菌灭活全菌加入或不加入相应佐剂，制备 的皮下、肌肉、乳管注射疫苗剂型、微针透皮剂型，并用PBS、铝盐、SPOU SP02、白花油、IFA、 细菌鞭毛为对照组，分别免疫6-8周Balb/C小鼠、18月家兔，每组10只，其免疫剂量按实 施例8疫苗剂量组，免疫两次(0，28天)；末次免疫后14天将各组小鼠、家兔取血、分离血
15清和免疫细胞，及通过ELISA法测定血清、乳汁抗体效价都在1 6400以上，采用MTT法测 定中和抗体效价都在1 3200以上，采用流式细胞仪、ELISP0T仪测定免疫细胞与血清中 重要细胞因子、炎性分子、趋化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变化使得TH2/Thl 应答平衡，采用ELISA法测定乳汁slgA抗体效价都在1 120以上。说明制备的奶牛乳房 炎三联灭活疫苗不管是加入佐剂或没加入佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且呈现出 试验组有佐剂优于无佐剂组、高剂量组高于低剂量组免疫应答效果，而对阴性照组没有产 生双重免疫应答；制备的奶牛乳房炎灭活疫苗不管是皮下注射还是肌肉、乳管注射剂型均 都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂血清抗体效价高于乳管内注射剂型，乳管内注射 的黏膜和细胞免疫效应好于肌肉和皮下免疫途径；制备的奶牛乳房炎三联灭活全菌+荚膜 多糖结合蛋白疫苗免疫应答效力优于灭活全菌疫苗和全菌+荚膜多糖疫苗；制备的奶牛乳 房炎灭活三联灭活疫苗免疫应答效力优于单联灭活疫苗；由此制备的奶牛乳房炎三联灭活 疫苗在小鼠、家兔体内具有好的免疫应答效果；SPOl或SP02佐剂整体优于铝盐、白花油和 IFA佐剂组，且在不同动物有一致免疫应答趋势。由此，研制的奶牛乳房炎三联灭活疫苗在 小鼠、家兔体内有很好的免疫原性。2.将本发明实施例8制备的奶牛乳房炎三联(金葡菌、链球菌、大肠杆菌)灭活 (全菌、全菌+荚膜多糖、全菌+荚膜多糖结合蛋白)疫苗及金葡菌三价灭活荚膜多糖结合 蛋白、链球菌三价灭活荚膜多糖结合蛋白、大肠杆菌灭活全菌及金葡菌三价灭活荚膜多糖 结合蛋白、链球菌三价灭活荚膜多糖结合蛋白、大肠杆菌灭活全菌加入或不加入相应佐剂， 制备的皮下、肌肉、乳管注射疫苗剂型、微针透皮剂型，并用PBS、铝盐、SPOU SP02、白花油、 IFA、细菌鞭毛为对照组，分别按皮下、肌肉、乳管注射途径选择2-3岁即将进入泌乳期(即 产前25d，怀孕8个月20d)健康(即疫苗抗体阴性，病原体阴性)奶牛，每组10头；其免疫 剂量按实施例8疫苗剂量组，免疫程序是0，28，56天各免疫1次(即产前25天，产后3天、 31天)；末次免疫后14天取血、分离血清和免疫细胞，采集、乳汁，观察奶牛产奶量与质量、 体温、体细胞计数、细菌计数及通过ELISA法测定血清抗体效价25600以上、乳汁抗体效价 达到1 6400以上，采用MTT法测定中和抗体效价都在1 12800以上，说明制备的奶牛乳 房炎三价灭活疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且呈现出 试验组有佐剂优于无佐剂组、高剂量组高于低剂量组免疫应答效果，而对阴性照组没有产 生双重免疫应答；制备的奶牛乳房炎三联灭活疫苗不管是皮下注射还是肌肉、乳管注射剂 型均都能产生满意的双重免疫应答，且皮下、肌肉注射剂血清抗体效价高于乳管内注射剂 型，乳管内注射的黏膜和细胞免疫效应好于肌肉和皮下免疫途径；制备的奶牛乳房炎三联 灭活荚膜多糖结合蛋白疫苗免疫应答效力优于灭活全菌疫苗和全菌+荚膜多糖疫苗；制备 的奶牛乳房炎灭活三价灭活疫苗免疫应答效力优于单价灭活疫苗；由此制备的奶牛乳房炎 三联灭活疫苗在奶牛体内具有好的免疫应答效果；SP01、SP02佐剂整体优于铝盐、白花油、 FIA佐剂组，且与剂量呈正相关免疫应答趋势。依上末次免疫14天后，分别用临床分离5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房链 球菌、001111大肠杆菌野毒株进行攻毒，通过导管奶头注射将1200CFU(5、8、336型金葡菌、 无乳、停乳、乳房型链球菌、01111、0157型大肠杆菌)野生菌株注入乳区。攻毒后观测临床 症状(发烧、乳腺肿胀)，奶样质量(血奶、异常块、奶量减少)、进食情况(进食减少)及发 病情况，通过奶样细菌学检测、体细胞计数SCC和血清抗体ELISA分析指标评价保护率。试验结果显示，研制的奶牛乳房炎三联灭活疫苗在奶牛体内有良好的保护率，且高于单用金 葡菌三价灭活疫苗、链球菌三价灭活疫苗、大肠杆菌灭活疫苗组的保护率，保护率达到90% 以上。实施例10 本发明奶牛乳房炎三联灭活疫苗在奶牛体内的长效免疫保护评价将本发明实施例8制备的奶牛金葡菌乳房炎三联灭活疫苗颈部皮下注射免疫2-3 岁即将进入泌乳期(即产前25d，怀孕8个月20d)健康(即疫苗抗体阴性，病原体阴性)奶 牛，每组 20 头；免疫剂量在(抗原 100ugCPs+50ugTT (或 DT 或 CRM197)+5X101QCFU+2. 5ml SPOl (或SP02)/5m，免疫程序是0，28，56天各免疫1次(即产前25天，产后3天、31天)， 第二年后加强免疫1次，观察三年(1083天)，其间每隔3个月取血、奶汁，观察奶牛产奶量 与质量、体细胞计数、细菌计数及通过ELISA、ELISP0T测定抗体效价、细胞免疫的长效免疫 应答及保护效果。试验结果显示，研制的奶牛乳房炎三联灭活疫苗具有长效免疫应答和免 疫保护，第一年免疫3次后，以后每年加强免疫一次，其保护率达90%以上。实施例11 本发明的奶牛乳房炎三联灭活疫苗安全性试验(1)无菌、支原体试验将实施例8制备的奶牛乳房炎三联灭活疫苗接种硫乙醇 酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养14d，并以无菌生理盐水做阴性对 照，培养温度为25°C、35°C。结果显示，奶牛乳房炎三联灭活疫苗未见细菌生长。将奶牛乳 房炎三联灭活疫苗分别用半流体和肉汤培养基，37°C初代培养21天，次代培养21天，无菌 生理盐水做阴性对照，结果显示奶牛乳房炎三联灭活疫苗无支原体生长。结果显示，奶牛乳 房炎三联灭活疫苗无支原体生长。(2)溶血性试验选取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血1ml，用PBS洗涤 3次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍。PBS稀释奶牛乳房炎三联灭活疫苗(由实施例8 制备)，分别为2倍、4倍、8倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检佐剂中，8小时后，评价血球 溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。结果显示，没有发生血球破 裂，无溶血现象。说明奶牛乳房炎三联灭活疫苗中的成分不能使红细胞裂解。因此，奶牛乳 房炎三联灭活疫苗无溶血反应。(3)急性毒性试验取实施例8制备的奶牛乳房炎三联灭活疫苗0. 5ml腹腔注射 体重为12 18g Balb/C小鼠，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的 活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行 动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明奶牛乳房炎三联灭活疫苗在试验的浓度下 对动物是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。在体重为8 IOkg的Beagle狗体内的急性毒性结果取实施例8制备的奶牛乳房炎三联灭活疫苗肌肉 注射15ML，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重和存活率变化。结 果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有 所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。因此，奶牛乳房炎三联灭活疫苗无急 性毒性反应，使用是安全的。(4)过敏试验研究取实施例8制备的奶牛乳房炎三联灭活疫苗皮下接种体重为 250 350g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0.5ml，隔日一次，共3次。第 3次注射后21天，耳静脉给予相同奶牛奶牛乳房炎三联灭活疫苗0. 5ml，并用人血白蛋白和 生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后30分钟及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，奶牛乳房炎三联灭活疫苗组豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦 躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，奶牛乳房炎三联灭活疫苗在动物体内无过 敏反应。(5)兔热源质试验取预检合格的体重为2 3kg家兔3只固定，30分钟后测 量体温，共测2次，间隔30分钟，要求2次温差不大于0. 2°C，各家兔2次平均温度在 38. 6-39. 5°C。将实施例8制备的奶牛乳房炎三联灭活疫苗预热至38°C，于第2次测温后 15分钟内，自家兔耳边静脉缓缓注入0. 5ml/只。注射后每隔30分钟测量体温1次，连测6 次。结果显示奶牛乳房炎三联灭活疫苗给予家兔个体升温未超过0.2°C，3只家兔升温总 和未超过0. 40C，没有引起家兔的发热反应。因此，制备的奶牛乳房炎三联灭活疫苗无热源 质。(6)免疫病理损伤试验由实施例8制备的奶牛乳房炎三联灭活疫苗通过小鼠、家 兔和奶牛外周血抗体亚型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性细胞及 气管、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏等检测。试验结果显示，奶牛乳房炎三联灭活疫苗免疫接种不 管在小动物，或是在奶牛体内Th2/Thl免疫应答趋于平衡，没有免疫器官损伤的迹象，因此 具有安全性。实施例12 本发明奶牛乳房炎三联灭活疫苗的稳定性实验由实施例8制备的奶牛乳房炎三联灭活疫苗，分别置于2_8°C、室温(20-25°C )、 37 °C 1周、2周、1个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月，取样观察外观、PH值、 无菌、电镜观察粒径、免疫动物观察安全性。结果显示奶牛乳房炎三联灭活疫苗放置 2-80C 24个月内均无变色分层等现象，PH值在7. 0-7. 2之间无变化，电镜观察粒径大小保持 一致，且注射给Balb/c小鼠表现正常；奶牛乳房炎三联灭活疫苗放置室温25°C 3个月内均 有好的稳定性；奶牛乳房炎三联灭活疫苗放置室温37°C 1个月内均有好的稳定性效果。由 结果说明，奶牛乳房炎三联灭活疫苗放置2-8°C理化性质、生物学性能稳定，有效期至少48 个月。


本发明公开了一种奶牛乳房炎三联灭活疫苗及其制备方法，主要包括5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌及经基因定点缺失鸟苷二磷酸半乳糖异构酶突变菌株的X-10大肠杆菌主要优势疫苗菌株，通过发酵规模化生产培养菌液、灭活、纯化等工艺，经此形成奶牛乳房炎三联灭活抗原，不加或加入白花油、FIA、铝盐、MF59、SP01、SP02佐剂、免疫刺激复合物、免疫细胞因子等佐剂，制备奶牛乳房炎三联灭活疫苗注射剂型、微针透皮剂型，通过皮下注射、肌肉注射、乳头管注射、微针透皮的一种或几种联合免疫接种奶牛后，可安全、稳定、全面有效预防金葡菌、链球菌和大肠杆菌感染性奶牛乳房炎的发生。