一种三角板形核酸纳米制剂及制备方法和应用的制作方法[0002]小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)作为RNA干扰发挥效应的关键，可高效、特异地抑制靶基因mRNA翻译过程，实现靶基因的表达下调，目前siRNA成为一种应用于各种人类疾病的基因治疗研究具有临床应用价值的有力工具，其发挥作用的关键在于siRNA本身的性质以及能否高效转染细胞与靶细胞结合。如何促进细胞摄取，保证运输过程中siRNA的稳定性是目如急需解决的问题。[0003]siRNA稳定性差，不易被细胞摄取的重要原因有:RNA分子对核酸酶高度不稳定，导致其半衰期短暂；其聚阴离子性质也导致其不易为细胞摄取；同时其电荷密度导致其充分水化，不易与一些蛋白相互作用而被迅速清除。目前研究经常是通过化学修饰，如应用锁核酸、4-硫代核糖核苷等核糖修饰可以增强siRNA抵抗核酸酶的降解能力，或者磷酸链的变化也可以提高siRNA的抗核酸酶作用，但一些研究表明大量磷酸酯键修饰有细胞毒性；siRNA的碱基修饰虽能提高其稳定性，也会造成干扰活性降低。本发明的三角板形核酸纳米制剂属于双螺旋结构修饰，使siRNA双螺旋化，完全避免了核酸酶的降解，并且siRNA片段形成纳米环结构，不但可以保持RNA干扰活性，同时提高siRNA的细胞摄取效率。[0004]核酸自组装纳米载体携带的目标主要是具有研究或治疗用途的药物或基因。核酸纳米载体由于具有较高的可编程性、较好的生物稳定性和生物相容性，不会导致细胞异常转化或死亡，而且具有纳米粒子特殊的结构和表面电荷，能较好的被细胞摄取，并将释放交联系统中的siRNA，使其具有较高的转染效率。基于核酸自组装纳米载体的多种优势，其在基因研究和治疗中也得到了不断的发展。
[0005]本发明的目的是提供一种三角板形核酸纳米制剂，该制剂对肺癌细胞的转染效率显著提高，能有效抑制肿瘤细胞的生长。[0006]本发明的技术方案是:[0007]一种三角板形核酸纳米制剂，该制剂包括DNA-RNA交联构成三角板形自组装纳米制剂。
[0008]所述的三角板形自组装纳米制剂由RNA序列如SEQ ID NO:1所示的mTOR siRNA、DNA序列如SEQ ID NO:2所示的mT_2A和DNA序列如SEQ ID NO:3所示的mT_lA3通过单链核酸分子碱基互补配对的自组装纳米制剂。
[0009]所述的三角板形自组装纳米制剂中mTOR siRNA、mT_2A和mT_lA3的摩尔比为3:3:1。
[0010]三角板形核酸纳米制剂的制备方法有以下步骤:[0011]I)取mTOR siRNA、mT_2A和mT_lA3的冻干干粉，分别加H2O稀释，混匀，得到mTORsiRNA、mT-2A 和 mT_lA3 溶液；
[0012]2)取mTOR siRNA溶液加入等体积的mT_2A溶液，放入90°C水浴中自然冷却至37 0C，随后加入mT-lA3溶液，充分混匀，37 °C水浴30min，室温下放置30min，4°C放置20min，得到mTOR siRNA、mT-2A和mT-lA3的摩尔比为3: 3: I的用于治疗肺癌的制剂。
[0013]本发明所述的制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。
[0014]三角板形核酸纳米制剂分子量为95，040。
[0015]本发明的三角板形核酸纳米制剂通过单链核酸分子碱基互补配对(adenine简写A，代表腺嘌呤；cytonine简写为C，代表胞喃唳；guanine简写为G，代表鸟嘌呤；thymine简写T，代表胸腺嘧啶；uracil简写为U代表尿嘧啶；其中A可以与T或U互补配对，G和C互补配对)进行纳米组装。DNA作为三角板形支撑骨架位于各条边，siRNA位于三角板形的三个角，单一功能性三角板形核酸纳米结构可祀向递送三个siRNA的DNA纳米粒子(参见图1)。与其它的药物运输载体相比较，三角板形核酸纳米制剂具有以下优点:1)核酸是生物相容性材料且易于功能化修饰，应用其作为药物载体可以降低细胞毒性。2)核酸分子标记方法多样，对示踪研究药物的途径和机理提供了较大的便利。3)合成过程简单，核酸的变性和复性容易受温度的控制，其自组装具有较强的可操控性。4)裸露siRNA进入细胞容易被核酸酶降解，三角板形核酸纳米制剂中的siRNA与DNA结合，提高siRNA稳定性，具有一定的缓释作用；5)在三角板形核酸纳米制剂的基础上，具有核酸的基本性质，可以继续与目前国内外报道的药物运输载体结合，如类脂、脂质体、合成多聚体等，有利于细胞的摄取。
[0016]三角板形核酸纳米制剂在介导siRNA的靶向表达或递送方面具有较好的优势，将mTOR siRNA(SEQ ID N0:l)、 mT_2A DNA(SEQ ID NO:2)序列与 mT_lA3DNA(SEQ ID NO:3)序列先交联，将siRNA包裹于三角板形核酸纳米结构内，siRNA与DNA单链结合，提高siRNA的稳定性，使其不易被核酸酶降解。三角板形纳米载体的特殊结构和表面电荷在转染试剂的辅助作用下，较易被细胞摄取，使siRNA进入细胞发挥作用。
[0017]三角板形核酸纳米制剂,在核酸与lipofectamine2000使用量降低为I比0.6,使用50pmol纳米制剂，对肺癌细胞的转染效率仍然较高，达到82.7 %，同时证实用DNA携带siRNA, siRNA生物学活性尚存并能发挥作用； 申请人:通过实验，其结果表明重组材料可显著降低mTOR的mRNA和蛋白表达水平，可有效抑制肿瘤细胞的生长。
[0018]为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。



[0019]图1三角板形核酸纳米制剂结构图；
[0020]图2三角板形核酸纳米制剂结构原子力显微镜扫描图；
[0021]图3三角板形核酸纳米制剂PAGE图；
[0022]图4A激光共聚焦观察不同剂量转染试剂对三角板形核酸纳米制剂细胞摄取的影响；
[0023]图4B IPP分析激光共聚焦观察三角板形核酸纳米制剂的细胞摄取；
[0024]图5A流式细胞仪检测不同剂量转染试剂对三角板形核酸纳米制剂细胞转染的影响；峰图1代表纳米制剂与转染试剂的比为1: O ;峰图2代表纳米制剂与转染试剂的比为I: 0.25;峰图3代表纳米制剂与转染试剂的比为1: 0.6 ;峰图4代表纳米制剂与转染试剂的比为1:1 ;峰图5代表纳米制剂与转染试剂的比为1: 2;
[0025]图5B统计分析流式细胞仪检测不同剂量转染试剂对三角板形核酸纳米制剂细胞转染的转染效率；
[0026] 图6A激光共聚焦观察不同剂量三角板形核酸纳米制剂细胞转染摄取；
[0027]图6B IPP分析激光共聚焦观察三角板形核酸纳米制的细胞摄取；
[0028]图7A流式细胞仪检测不同剂量三角板形核酸纳米制剂细胞转染的影响；峰图1代表纳米制剂浓度为Opmol/ml ;峰图2代表纳米制剂浓度为12.5pmol/ml ;峰图1代表纳米制剂浓度为25pmol/ml ;峰图1代表纳米制剂浓度为50pmol/ml ;峰图1代表纳米制剂浓度为100pmol/ml ；
[0029]图7B统计分析流式细胞仪检测不同剂量三角板形核酸纳米制剂细胞转染的转染效率；
[0030]图8A不同时间点H292细胞mTOR mRNA表达水平；其中，泳道I为DNA Marker ；泳道2为转染三角板形核酸纳米制剂后O小时细胞内mTOR mRNA表达；泳道3为转染三角板形核酸纳米制剂后12小时细胞内mTORmRNA表达；泳道4为转染三角板形核酸纳米制剂后24小时细胞内mTOR mRNA表达；泳道5为转染三角板形核酸纳米制剂后36小时细胞内mTORmRNA 表达；
[0031 ] 图8B不同时间点H292细胞mTOR mRNA表达水平分析；
[0032]图9A不同时间点H292细胞mTOR蛋白表达水平；其中，泳道I为正常细胞内mTOR蛋白表达；泳道2为转染三角板形核酸纳米制剂后细胞内mTOR蛋白表达；泳道3为转染单独的siRNA后细胞内mTOR蛋白表达；
[0033]图9B不同时间点H292细胞mTOR蛋白表达水平分析；
[0034]图10MTT检测三角板形核酸纳米制剂对H292细胞的生长抑制。

[0035]下面结合对本发明作进一步详细的说明。
[0036]一.材料
[0037]NCI H292细胞购自美国模式培养物研究所；
[0038]磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Hyclone公司；
[0039]mTOR siRNA、mT_2A DNA序列和mT_lA3DNA由上海生工有限公司合成；
[0040]0.25%胰蛋白酶购自Hyclone公司；
[0041]4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自上海江莱生物科技有限公司；
[0042]1640培养基、胰蛋白酶、OPT1-MEM为Gibco公司产品；
[0043]胎牛血清为中国医学科学院血液研究所产品，
[0044]Lipofectamine2000 转染试剂为美国 Invitrogen 公司产品；
[0045]蛋白裂解液购自美国Thermo公司；
[0046]双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸镁、β -巯基乙醇购自江苏聚
[0047]成精细化工有限公司；[0048]NaCl、KCl、Tris碱、HCl、酚购自上海时代生物科技有限公司；
[0049]mTOR和GAPDH引物由上海生工公司合成；
[0050]mTOR 和 GAPDH 抗体购自 Chemicon 公司；
[0051]羊抗鼠或羊抗兔二抗购自Amersham公司
[0052]RT-PCR试剂盒由日本Takara公司提供。
[0053]磁力搅拌器购自英国Jenway公司。
[0054]二甲基亚砜、MTT购自美国Sigma公司
[0055]二.实施例
[0056]实施例1:三角板形核酸纳米制剂的合成
[0057]将mTOR siRNA (SEQ ID NO:1)、mT_2A (SEQ ID NO:2)和 mT_lA3(SEQ ID NO:3)各序列干粉样品用灭菌灭酶的去离子水稀释为0.2 μ g/ μ I ;合成10 μ I三角板形核酸纳米制剂，其中mTOR siRNA、mT-2A DNA序列和mT_lA3DNA序列的摩尔比为3: 3: 1，按比例加入到灭酶的离心管中，先加入 1.6μ I H2O (free Rase) ,3.4μ I mTOR siRNA 和 3.4μ1 mT_2A，混合均匀，在90°C水浴中自然冷却至37°C，之后再加入1.6μ I mT-lA3，充分混匀，37°C水浴30分钟，室温(约25°C )放置30分钟，4°C放置20分钟，得到的治疗肺癌的核酸自组装纳米材料，简称三角板形核酸纳米制剂。三角板形核酸纳米制剂结构的原子力显微镜扫描图见图2 ;将合成的少量样品在6%非变性PAGE胶中电泳，通过凝胶呈像系统扫描图片，三角板形核酸纳米制剂电泳图片见图3。经image J图像分析软件分析，结果显示三角板形核酸纳米制剂的条带含量约占89%，具有较高的纯度。
[0058]实施例2:不同剂量转染试剂对三角板形核酸纳米制剂转染的影响
[0059]将处于对数生长期的H292用0.25%胰蛋白酶消化，细胞爬片，细胞接种于24孔板内(内置盖玻片)，置于37°C、5% CO2孵箱中培养48小时后，待细胞密度达30%~50%时即可用于转染；实验分组为:三角板形核酸纳米制剂:Lipofectamine2000的比例分别为1: 0、1: 0.25,1: 0.6、1:1和 1: 2，将 mTOR 纳米制剂按照 Lipofectamine2000 说明书进行转染；培养6小时后，弃去转染混合液，加入5mL的PBS洗涤后弃去，更换为含10%胎牛血清的1640培养基，置于37°C、5% CO2孵箱中培养12小时。之后，将24孔板培养基弃掉，用37°C PBS轻轻漂洗3minX3次；沿着培养板壁加入4%多聚甲醛1ml，室温固定5分钟;PBS冲洗5minX3次，弃去PBS液体;加入60 μ I DAPI染液，室温固定3分钟;PBS冲洗5minX5次，弃去PBS液体；取出盖玻片，使用抗淬灭封片剂(约10 μ I)封片，避光保存；激光共聚焦显微镜下照相，利用IPP软件对荧光强度进行定量分析。
[0060]流式细胞检测转染效率。转染后并孵育12小时，收集细胞，用PBS清洗贴壁细胞2遍后弃去液体；加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞逐渐变圆变亮时，吸弃胰蛋白酶，加入培养基终止消化，用滴管反复地轻轻吹打贴壁细胞，制成单细胞悬液；1000rpm，离心10分钟，弃上清，每个样本中加入1ml PBS缓冲液吹打重悬细胞，重复此步骤一次；采用激光光源为IS离子气体激光器，激发波长为530nm,运用Beckman公司流式细胞仪检测，软件分析细胞转染效率，每组实验重复3次。
[0061]由激光共聚焦图4A和图4B，DNA纳米载体携带的Cy3_mT0R siRNA在细胞中呈红色荧光分布，并且伴随着转染试剂LipOfectamine2000的增加，DNA纳米制剂进入细胞的量增加。而流式细胞仪检测结果(见图5A和图5B)也有相同的趋势，在三角板形核酸纳米制剂与Lipofectamine2000的比例为I: 0.6时，转染效率就达到了 63.2%0
[0062]实施例3:不同剂量三角板形核酸纳米制剂对细胞转染的影响
[0063]设计三角板形核酸纳米制剂的浓度分组为0pmol、12.5pmoI>25pmoI>50pmoI和IOOpmol五个浓度，其激光共聚焦观察细胞转染效率实验和流式细胞仪检测转染效率的实验操作与实施例2相同。
[0064]由激光共聚焦图6A和图6B，三角板形核酸纳米载体携带的Cy3-mT0R siRNA在细胞中呈红色荧光分布，并且伴随着三角板形核酸自组装纳米制剂的增加，DNA纳米粒进入细胞的量增加。流式细胞仪检测结果(见图7A和图7B)显示:在三角板形核酸纳米制剂在50pmol时，转染效率就达到了 82.7%。
[0065]实施例4:三角板形核酸纳米制剂对细胞mTOR mRNA、蛋白表达的影响
[0066]转染前一天，计数H292细胞，细胞爬片，接种于细胞培养瓶中，以50pmol/ml三角板形核酸纳米制剂转染H29 2细胞，将合成纳米材料重组体转染H292细胞进行比较。转染后分别在O小时、12小时、24小时和36小时后，应用PBS冲洗2遍；加入TRIzoI试剂(美国Invitrogen公司)Iml,按照TRIzol试剂提取说明书进行RNA提取。应用核酸定量分析仪测定RNA浓度和纯度。所有RNA的A260/A280比值均在1.8~2.0之间。然后用逆转录PCR(RT-PCR)试剂检测各时间点mTOR mRNA的情况，GAPDH作为阳性对照。引物设计如下:
[0067]mT0R(195bp),
[0068]F:5’CGCAGGGAAGGTGATGAGGAAT3’，(SEQ ID NO:4)
[0069]R:5’GCTAAGGAGCAGCCAGGGAGAT3’ ； (SEQ ID NO:5)
[0070]GAPDH (296bp)，
[0071]F:5’CACTGCCACCCAGAAGACTGTG3’ (SEQ ID NO:6)
[0072]R:5’ GGTGCTCAGTGTAGCCCAGGAT3’ (SEQ ID NO:7)?
[0073]RT反应条件:45°C、45分钟，95°C、30秒，4°C、10分钟，反应体积为10 μ I ;PCR反应条件为:94°C、3分钟变性，循环条件为94 V、30秒，54°C、30秒，72 °C、30秒，35次循环，72 °C延伸10分钟，反应体积为50 μ I。应用自动成像分析仪对PCR产物进行半定量分析。
[0074]转染前一天，计数Η292细胞，细胞爬片，接种于6孔板中，以50pmol/mlmT0RsiRNA，转染H292细胞进行比较。转染24小时后，从培养箱中取出细胞，弃掉细胞培养液，应用预冷的PBS冲洗2遍。每瓶加入细胞裂解液200 μ I蛋白裂解液提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度。取40 μ g蛋白经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳2小时分离蛋白[聚丙烯酰胺凝胶配方如下:去离子水，1.7ml ;30%双丙烯酰胺(丙烯酰胺298加上队^ -亚甲双丙烯酰胺lg，溶解于IOOm去离子水)，1.3ml ;Tris缓冲盐溶液(在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、
0.2g KCl和3g Tris碱，pH值调至7.4，用蒸馏水定容至1L)，1.9ml ；10% SDS:(称取100gSDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至1L), 0.05ml ; 10%过硫酸镁(IOg过硫酸镁溶于100mL去离子水中),0.05ml ； β -巯基乙醇,
0.008ml)]，电泳结束后应用电转印装置将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，300毫安电流转膜3小时。应用含5%奶粉的洗膜液-Tris缓冲盐溶液(Tris buffered saline Tween20,TBST，即100ml TBST中加入5g脱脂奶粉)封闭2小时。分别加入兔抗人mTOR (1:1000稀释使用)、鼠抗人GAPDH(1:5000稀释使用)TBST稀释的一抗室温孵育2小时，TBST漂洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔二抗常温孵育I小时，TBST漂洗3次，配制增强化学发光(enhanced chemilumines cence, ECL)显色剂,滴加至PVDF膜上,避光孵育5分钟，将膜放在暗盒中，于X线室曝光显像，采用Alpha InnoTechTM2000凝胶成像系统获取X线片的蛋白条带图象，并应用image J分析蛋白条带的相对吸光度。
[0075]检测发现三角板形核酸纳米制剂携带的mTOR siRNA能够在细胞中下调mTOR mRNA的表达，在24小时，36小时mTOR的mRNA显著低于O小时组(*代表p〈0.05)(见图8A和图8B),并且Western Blotting结果也显示三角板形核酸纳米包裹siRNA能干扰mTOR蛋白的表达，较单独转染siRNA的干扰效果明显增强(见图9)，说明三角板形核酸纳米制剂在细胞中能够稳定的发挥作用。
[0076]实施例5:三角板形核酸纳米制剂对H292细胞增殖的影响
[0077]将处于对数生长期的H292用0.25%胰蛋白酶消化，进行细胞计数，制成细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔加入100 μ I细胞悬液，细胞密度为I X IO4细胞/孔。设置OpmoI>25pmoI>50pmoI和IOOpmol四组实验，每组设置5个复孔，另设调零孔。置于37°C、5% CO2孵箱中培养24小时后用于转染，转染培养6小时后，弃去混合液，加入200 μ I的PBS洗涤残余的转染混合液2次，弃去PBS混合液，更换为含10%胎牛血清的1640培养基，于37°C、5 % CO2孵箱中培养，分别在O小时、12小时、24小时、36小时和48小时，每孔加入5mg/ml MTT溶液10 μ 1，继续培养4小时后终止培养；吸尽孔内液体，每孔加入150ul DMSO,置于水平摇床振荡摇匀lOmin，使结晶充分溶解；酶标仪检测在490nm波长处各孔的吸光度(A值)，重复实验3次；细胞生长抑制率(InhibitionRate，IR)按以下公式计算:抑制率(％ )=[(对照组A值-实验组A值)/对照组A值]X 100%。
[0078]MTT法检测结果显示三角板形三角板形三角板形核酸纳米制剂随着浓度增加，对细胞生长的抑制率显著升高，单一浓度在24小时达到较高，之后随时间延长抑制率上升缓慢，具体的试验结果如图10，说明mTOR Nano能有效的抑制肿瘤细胞的生长。
[0079] 虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属【技术领域】的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。