S-苯基-l-半胱氨酸酶法转化制备方法

焦庆才, 徐礼生, 刘均忠, 王治元, 张宏娟, 刘茜

2012年12月5日

2012年7月20日

2012年7月20日

南京大学

C12R1/385GK102808007SQ20121025162

半胱氨酸 酶法 苯基 转化

1.一种S-苯基-L-半胱氨酸的酶法转化制备方法，其特征是由以下步骤构成 (1)具有色氨酸合成酶活性的菌株在培养基中培养，产生含色氨酸合成酶的湿菌体； (2)将含有色氨酸合成酶的湿菌体或粗酶液与含L-丝氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入磷酸吡哆醛和表面活性剂和苯硫酚或苯硫酚钠，在25 55°C，pH 6 11条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离得到S-苯基-L-半胱氨酸2.根据权利要求I所述的S-苯基-L-半胱氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(I)所述的菌株是大肠杆菌ATCC15489或铜绿假单胞菌CGMCC NO 1. 1129或施氏假单胞菌 CGMCC NO I. 202 或枯草芽孢杆菌 CGMCC NO I. 16283.根据权利要求I所述的S-苯基-L-半胱氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(1)所述的培养基是葡萄糖和麦芽糖和蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓度为5 50g/L ;氮源采用牛肉膏和酵母膏和玉米浆和蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为I 30 g/L4.根据权利要求I所述的S-苯基-L-半胱氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)所述的含L-丝氨酸的混合氨基酸料液来源于角蛋白水解液或蚕丝水解液或酶法合成L-丝氨酸的反应液，混合氨基酸料液中总氨基酸含量为1% 50%重量百分比，其中L-丝氨酸在总氨基酸中含量为5% 95%重量百分比5.根据权利要求I所述的S-苯基-L-半胱氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)所述的表面活性剂为吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵或聚乙二醇辛基苯基醚，其浓度为 0. 005 g/L 5. 0 g/L

本发明属于生物技术领域，具体涉及S-苯基-L-半胱氨酸的酶法转化制备方法背景技术 S-苯基-L-半胱氨酸是一种非蛋白质组成的氨基酸，其所带的巯基具有重要的生理功能，S-苯基-L-半胱氨酸是治疗艾滋病药物萘非那韦(抗HIV蛋白酶抑制剂Nelfinavir)的合成原料(US5484926 ;EP0889036)S-苯基-L-半胱氨酸可用于化妆品添加剂、医药领域、食品领域和饲料添加剂领域等，具有非常广泛的应用根据目前文献报导S-苯基-L-半胱氨酸的制备方法主要有化学合成法和酶转化 法I、化学合成法 S-苯基-L-半胱氨酸的化学合成法主要利用铜催化L-半胱氨酸和苯胺重氮盐的反应，最后得到S-苯基-L-半胱氨酸，S-苯基-L-半胱氨酸化学合成的反应步骤多，操作难度大，不适合大规模工业化生产王建武等(中国药物化学杂志，2000，(10)4 =283-284)采用铜催化L-半胱氨酸和苯胺重氮盐反应合成S-苯基-L-半胱氨酸，苯胺溶于浓盐酸中，滴加亚硝酸钠得到重氮盐，加入半胱氨酸盐酸盐和氯化亚铜，反应后在通风橱中加入硫化钠抽滤，用氨水调pH6，白色晶体析出，过滤，烘干，产率为60%，纯度为95%高玉冠等(CN 200410089193. 9，2005)用亚硝酸钠与苯胺反应成苯胺重氮盐，苯胺重氮盐再与L-半胱氨酸溶液进行反应，加入氯化亚铜，然后用硫化钠进行脱铜反应，抽滤，调PH6，过滤烘干得到粗品S-苯基-L-半胱氨酸，产率50%张关永等(CN 03128884. 7，2003)将L-半胱氨酸盐酸盐与可溶性一价铜盐反应生成铜的络合物，然后与苯胺重氮盐反应生成S-苯基-L-半胱氨酸，加入可溶性硫化物溶液进行脱铜反应，冷却，过滤，滤液中加入氨水进行中和，采用乙醇和水混合液对粗品S-苯基-L-半胱氨酸重结晶2、酶转化法 酶法转化因具有专一性强、反应条件温和、环境友好等优点而日益受到重视，酶促转化法具有终产物积累量高、反应周期短、分离提纯容易等优点，它是廉价生产S-苯基-L-半胱氨酸有效的方法，国内外研究者利用色氨酸合成酶酶法制备S-苯基-L-半胱氨酸，酶法生产S-苯基-L-半胱氨酸已成为近年来人们关注和研究的方向Thomas HP Maier (Nature Biotechnology, 21(4) 422-427,2003)以苯硫酌■和O-乙酰-L-丝氨酸为底物，pH调至6. 7，CysM酶酶法制备S-苯基-L-半胱氨酸，产率为72%欧洲专利(EP1247869-A，2002)报道了采用含有O-乙酰-L-丝氨酸、苯硫酚和产CysM菌株DH5 a /pFL145细胞悬液制备S-苯基-L-半胱氨酸，pH调至6. 7，收率为65%焦庆才等(BioresourceTechnology, 102 3554-3557, 2011)以混合氛基酸含有的L-丝氨酸和吲哚为底物，以色氨酸合成酶酶法合成了 L-色氨酸但据文献报道色氨酸合成酶不仅能够催化L-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸，还能催化纯品L-丝氨酸和苯硫酚反应生成S-苯基-L-半胱氨酸日本专利(JP10001468A，1996 JP9313195-A，1997 JP9084592-A，1997)和美国专利(US5756319-A，1998)报道了以DL-丝氨酸或L-丝氨酸为底物，以苯硫酚为巯基供体，色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸，以上色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸的报道均以DL-丝氨酸纯品或L-丝氨酸纯品为底物目前,我国S-苯基-L-半胱氨酸生产主要来源于化学合成法,该方法工艺成熟,但化学合成法反应步骤多，操作难度大，生产成本高，不适合大规模工业化生产而另一方面我国在氨基酸工业生产中，会产生大量不能直接用于食品和医药方面的富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液，该混合氨基酸料液直接分离制备L-丝氨酸成本高、效率低发明内容 本发明需要解决的问题是提供一种高效、低成本的制备S-苯基-L-半胱氨酸的方法 本发明以氨基酸工业中富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为底物，色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸本发明可以通过以下技术方案实现 S-苯基-L-半胱氨酸的酶法转化制备方法，其步骤为 (I)具有色氨酸合成酶活性的大肠杆菌ATCC15489或铜绿假单胞菌CGMCC NO 1. 1129或施氏假单胞菌CGMCC NO I. 202或枯草芽孢杆菌CGMCC NO I. 1628，在培养基中培养，产生含色氨酸合成酶的湿菌体(2)将含有色氨酸合成酶的湿菌体或粗酶液与含L-丝氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入磷酸吡哆醛和表面活性剂和苯硫酚或苯硫酚钠，在25 55°C，pH 6 11条件下进行酶促反应；反应生成S-苯基-L-半胱氨酸上述步骤(I)中的培养基碳源采用葡萄糖和麦芽糖和蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓度为5 50 g/L ;氮源采用牛肉膏和酵母膏和玉米浆和蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为I 30 g/L上述步骤(2)中含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为角蛋白水解液或蚕丝水解液或酶法合成L-丝氨酸的反应液，混合氨基酸料液中总氨基酸含量为1% 50%重量百分比，其中L-丝氨酸在总氨基酸中含量为5% 95%重量百分比上述步骤(2)的转化液中加入适量的表面活性剂吐温-80或十六烷三甲基溴化铵(CTAB)或聚乙二醇辛基苯基醚(0P)，其浓度为O. 005 g/L 5. O g/L本发明与现有技术相比具有如下优点 (O本发明采用含色氨酸合成酶的大肠杆菌ATCC15489或铜绿假单胞菌CGMCC NO I.1129或施氏假单胞菌CGMCC NO I. 202或枯草芽孢杆菌CGMCC NO I. 1628，在优选的培养基中培养可以高效表达色氨酸合成酶，使酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸有较高的催化速率和转化率，其中L-丝氨酸摩尔转化率达到84%以上(2)本发明采用廉价的含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为反应原料，充分利用了工业副产物，解决了混合氨基酸料液中L-丝氨酸高效分离的难题，同时也为大规模低成本生产S-苯基-L-半胱氨酸提供了更为丰富的原料，具有良好的经济效益和社会效益(3)酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸具有反应条件温和，酶立体选择性强，催化效率高，成本低，工艺流程简单等优点，适合工业化生产具体实施例方式 以下实施例仅用于对本发明进行具体说明，但本发明的保护范围并不仅限于以下实施例中实施例一 I.将1000 mL大肠杆菌(ATCC15489)发酵液离心得到20 g湿菌体，加入到500 mL转化液中，转化液中含17. 5 g L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量15%)、19 g苯硫酚、0.2 g/L磷酸吡哆醛和O. 005 g/L OP, pH 8. 5，37°C酶促反应15 h，反应结束后转化液中S-苯基-L-半胱氨酸为29. 2 g，对L-丝氨酸摩尔转化率为89% pH O. 5，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液用5 mol/L NaOH调pH 3. 0，冷却，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得27. 7 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得26. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+74° (c=l，1.5 mol/L硫酸)实施例二 I.将1000 mL铜绿假单胞菌(CGMCC NO 1. 1129)发酵液离心得到20 g湿菌体，加入到500 mL转化液中，转化液中含36 g L-丝氨酸的蚕丝水解液(氨基酸总含量30%)、42 g苯硫酚、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L吐温-80，pH 9. O，25 °C酶促反应20 h，反应结束后转化液中S-苯基-L-半胱氨酸为58. 2 g，对L-丝氨酸摩尔转化率为86 %2.将转化液4000 r/min离心15 min，去除菌体细胞，上清液用6 mol/L盐酸调pH O. 5，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液用5 mol/L NaOH调pH 3. 0，冷却，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得55. 3g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得51. 9 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+74° (c=l，1.5 mol/L硫酸)实施例三 I.将1000 mL施氏假单胞菌(CGMCC NO I. 202)发酵液离心得到湿菌体18 g，加入到500 mL转化液中,转化液中含12 g L-丝氨酸的酶法制备L-丝氨酸料液、14 g苯硫酹、0.2g/L磷酸吡哆醛和O. 005 g/L吐温-80，pH 6.0, 55°C酶促反应15 h，反应结束后转化液中S-苯基-L-半胱氨酸为19. 4 g，对L-丝氨酸摩尔转化率为86 %2.将转化液4000 r/min离心15 min，去除菌体细胞，上清液用6 mol/L盐酸调pH 0.5，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液用5 mol/L NaOH调pH 3. 0，冷却，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得17. 7 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得16. I g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l, I. 5 mol/L硫酸)实施例四 I.将1000 mL枯草芽孢杆菌(CGMCC NO I. 1628)发酵液离心得到20 g湿菌体，加入到500 mL转化液中,转化液中含48 g L-丝氨酸的酶法制备L-丝氨酸料液、56 g苯硫酹、0.2 g/L磷酸吡哆醛和0.5 g/L吐温-80，pH 9. 0，35°C酶促反应20 h，反应结束后转化液中S-苯基-L-半胱氨酸为79. 4 g，对L-丝氨酸摩尔转化率为88 %2.将转化液4000 r/min离心15 min，去除菌体细胞，上清液用6 mol/L盐酸调pH 0.5，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液用5 mol/L NaOH调pH 3. 0，冷却，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得75. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得71. 6 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)实施例五 I.将1000 mL施氏假单胞菌(CGMCC NO I. 202)发酵液离心得到20 g湿菌体，加入到500 mL转化液中，转化液中含60 g L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量50%)、70 g苯硫酚、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L CTAB, pH 9，35°C酶促反应20 h，反应结束后转化液中S-苯基-L-半胱氨酸为94. 6 g，对L-丝氨酸摩尔转化率为84 %2.将转化液4000 r/min离心15 min，去除菌体细胞，上清液用6 mol/L盐酸调pH O. 5，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液用5 mol/L NaOH调pH 3. 0，冷却，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得89. 8 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得85. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸) 实施例六 I.将1000 mL施氏假单胞菌(CGMCC NO I. 202)发酵液离心得到18 g湿菌体，加入到500 mL转化液中，转化液中含24 g L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量20%)、28 g苯硫酚、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L OP, pH 11，35°C酶促反应16 h，反应结束后转化液中S-苯基-L-半胱氨酸为40. 2 g，对L-丝氨酸摩尔转化率为89 %2.将转化液4000 r/min离心15 min，去除菌体细胞，上清液用6 mol/L盐酸调pH 0.5，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液用5 mol/L NaOH调pH 3. 0，冷却，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得38. 2 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得36. 3 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+74° (c=l，1.5 mol/L硫酸)实施例七 I.将1000 mL大肠杆菌(ATCC15489)发酵液离心得到18 g湿菌体，加入到500 mL转化液中，转化液中含18 g L-丝氨酸的蚕丝水解液(氨基酸总含量15%)、21 g苯硫酚、0.2 g/L磷酸吡哆醛和0.5 g/L OP, pH 9. O，35°C酶促反应15 h，反应结束后转化液中S-苯基-L-半胱氨酸为29 g，对L-丝氨酸摩尔转化率为86 %2.将转化液4000 r/min离心15 min，去除菌体细胞，上清液用6 mol/L盐酸调pH 0.5，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液用5 mol/L NaOH调pH 3. 0，冷却，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得27. 5 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得26. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)实施例八 I.将1000 mL铜绿假单胞菌(CGMCC NO 1. 1129)发酵液离心得到的18 g湿菌体，力口入到500 mL转化液中，转化液中含12 g L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量10%)、16. 8 g苯硫酚钠、0. 2 g/L磷酸吡哆醛和0. 5 g/L CTAB, pH 9. O, 35°C酶促反应15 h，反应结束后转化液中S-苯基-L-半胱氨酸为19. 3 g，对L-丝氨酸摩尔转化率为86 %2.将转化液4000 r/min离心15 min，去除菌体细胞，上清液用6 mol/L盐酸调pH 0.5，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液用5 mol/L NaOH调pH 3. 0，冷却，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得17. 3 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得16. 5 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+74° (c=l, I. 5 mol/L硫酸)实施例九 I.将1000 mL枯草芽孢杆菌(CGMCC NO I. 1628)发酵液离心得到20 g湿菌体，加入到500 mL转化液中，转化液中含24 g L-丝氨酸的蚕丝水解液(氨基酸总含量20 %)、33. 6g苯硫酚钠、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L吐温-80，pH 9. 0，35°C酶促反应18 h，反应结束后转化液中S-苯基-L-半胱氨酸为38. 2 g，对L-丝氨酸摩尔转化率为85 %2.将转化液4000 r/min离心15 min，去除菌体细胞，上清液用6 mol/L盐酸调pH O. 5，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液用5 mol/L NaOH调pH 3. 0，冷却，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得36. 2 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得34. 4 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)实施例十 I.将1000 mL大肠杆菌(ATCC15489)发酵液离心得到18 g湿菌体，加入到500 mL转化液中，转化液中含36 g L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量30%)、50. 4 g苯硫酚钠、O. 2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L吐温-80，pH 9. O, 35°C酶促反应20 h，反应结束后转化液中S-苯基-L-半胱氨酸为57. I g，对L-丝氨酸摩尔转化率为85 % 2.将转化液4000 r/min离心15 min，去除菌体细胞，上清液用6 mol/L盐酸调pH O. 5，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液用5 mol/L NaOH调pH 3. 0，冷却，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得54. 2 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得51. 5 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)实施例^^一 I.将100 mL枯草芽孢杆菌(CGMCC NO I. 1628)发酵液离心得到2 g湿菌体，加入到50 mL转化液中，转化液中含I. 2 g L-丝氨酸的蚕丝水解液(氨基酸总含量l%)、1.4g苯硫酚、0.2 g/L磷酸吡哆醛和0.005 g/L CTAB，pH 9. O，35°C酶促反应5 h，反应结束后转化液中S-苯基-L-半胱氨酸为I. 94 g，对L-丝氨酸摩尔转化率为86 %2.将转化液4000 r/min离心15 min,去除菌体细胞,上清液用6 mol/L盐酸调pH 0.5，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液用5 mol/L NaOH调pH 3. 0，冷却，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得I. 82 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得I. 63 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)实施例十二 I.将1000 mL铜绿假单胞菌(CGMCC NO 1. 1129)发酵液离心得到20 g湿菌体，加入到500 mL转化液中,转化液中含24 g L-丝氨酸的酶法制备L-丝氨酸料液、28 g苯硫酹、0.2 g/L磷酸吡哆醛和5 g/L吐温-80，pH 9. 0，35°C酶促反应18 h，反应结束后转化液中S-苯基-L-半胱氨酸为38. 7 g，对L-丝氨酸摩尔转化率为86 %2.将转化液4000 r/min离心15 min，去除菌体细胞，上清液用6 mol/L盐酸调pH 0.5，加热，活性碳脱色，抽滤，滤液用5 mol/L NaOH调pH 3. 0，冷却，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得36. 7 g S-苯基-L-半胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得34. 9 g S-苯基-L-半胱氨酸精品，比旋光=+73° (c=l，1.5 mol/L硫酸)