专利名称：制备含游离半胱氨酸残基的蛋白质的方法就病人和医护人员而言，对于开发低成本，长效，“使用方便”(“user-friendly”)的蛋白质疗法具有极大兴趣。蛋白质制备昂贵且不同于其它常规小分子药物，它通常不容易被身体吸收。而且如果经口服给药它们会被消化掉。因此，蛋白质一般必须经注射给药。注射后，大多数蛋白质被迅速从体内清除，因此必须经常，通常是每天，都要进行注射。病人不喜欢注射，这样就导致应变性下降并降低药物效力。有些蛋白质，如促红细胞生成素(EPO)，当不经常给药时也是有效的，但这是由于该蛋白质是糖基化的事实引起的。糖基化需要使用哺乳动物表达系统来生产重组蛋白质，但这较昂贵且增加了蛋白质药物的成本。因此，强烈需要开发降低病人和医护人员对蛋白质药物花费的蛋白质传递技术。解决该问题的一个方法是开发延长蛋白质治疗剂在体内的循环半衰期的方法使得不需经常注射该蛋白质。这一解决方法也可满足病人对“使用方便”的蛋白质疗法(即，不需要经常注射的蛋白质疗法)的需要和希望。已证实用聚乙二醇(PEG)对蛋白质的共价修饰是延长蛋白质在体内的循环半衰期的有用方法(Abuchowski等，1984；Hershfield，1987；Meyers等，1991)。将PEG共价附着到蛋白质上增加了蛋白质的有效大小并降低了从体内清除它的速率。可买到几种大小的PEG，通过使用不同大小的PEG可以使得PEG修饰的蛋白质的循环半衰期适应于个体适应症。其它文献证实PEG修饰的体内益处在于增强了蛋白质的可溶性，稳定性(很可能是防止蛋白质被蛋白酶消化)和降低蛋白质的免疫原性(Katre等，1987；Katre，1990)。PEG连接蛋白质的一个已知方法是使用诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-PEG的化合物将PEG附着列游离胺上，一般是在赖氨酸残基或在N-末端氨基酸上。该方案的一个主要的局限性在于蛋白质除了N-末端氨基酸外，一般还含有几个赖氨酸，PEG部分非特异性地附着到蛋白质的任何可接近的游离胺上，产生不同种的产物混合物。许多NHS-PEG化蛋白质由于其低比活和异质性而不适用于商业用途。失活是由生物学活性所需的一个或多个赖氨酸残基或N-末端氨基酸被共价修饰或者由于PEG部分靠近蛋白质的活性位点的共价附着而引起的。与本申请特别相关的是这样的发现，即用包括NHS-PEG试剂的胺反应试剂修饰的人生长激素(hGH)使得蛋白质的生物学活性降低了超过10倍(Teh和Chapman，1988；Clark等，1996)。GH是由垂体腺分泌的一种22KD的蛋白质。GH刺激骨骼，软骨和肌肉的代谢并且是儿童时期刺激躯体生长的主要激素。重组人GH(rhGH)用于治疗由于GH不足引起的躯体矮小症，特纳综合症和儿童肾机能不全症。GH不被糖基化且当在细菌中生产时具有完全的活性。该蛋白质具有较短的体内半衰期且必须每天皮下注射给药以达到最大效力(MacGillivray等，1996)。对于开发长效形式的hGH具有极大的兴趣。用胺反应性PEG试剂经PEG连接蛋白质产生长效形式的hGH的尝试取得的成功有限，因为PEG连接时生物学活性明显下降。而且，该蛋白质变成在多个位点与PEG连接(Clark等，1996)。hGH除了N-末端氨基酸外，含有9个赖氨酸。这些赖氨酸中有些位于该蛋白质已知对受体结合关键的区域(Cunningham等，1989；Cunningham和Wells，1989)。这些赖氨酸残基的修饰明显降低了受体结合和该蛋白质的生物学活性(de la Llosa等，1985；Martal等，1985；Teh和Chapman，1988；Cunningham和Wells，1989)。hGH容易被NHS-PEG试剂修饰，但NHS-PEG蛋白质的生物学活性严重受损，用5Kda PEG部分修饰的GH蛋白质仅占野生型GH生物学活性的1％(Clark等，1996)。这种多PEG化GH蛋白质的EC50为440ng/ml或大约20nM(Clark等，1996)。除了生物学活性明显下降外，由于不同数目的PEG部分附着到蛋白质上和在不同的氨基酸残基上附着，NHS-PEG-hGH具有极大的异质性，这也影响了其作为潜在治疗剂的有用性。Clark等(1996)表明NHS-PEG-hGH在动物中的循环半衰期相对于未修饰的GH明显延长。尽管体外生物学活性明显降低，但在大鼠GH-缺陷模型中NHS-PEG-hGH是有效的且比未修饰的hGH给药频率要低(Clark等，1996)。然而，在动物模型中需要高剂量的NHS-PEG-hGH(每只大鼠每次注射60-180μg)产生效力，因为修饰的蛋白质比活较低。明显的是需要更好的方法以产生保留更高生物学活性的PEG化hGH蛋白质。还需要开发PEG连接hGH的方法，以这种方式产生同型PEG-hGH产物。其它几种商业上重要的蛋白质的生物学活性也被胺反应PEG试剂显著降低。EPO含有几个对蛋白质的生物学活性关键性的赖氨酸残基(Boissel等，1993；Matthews等，1996)且EPO中赖氨酸残基的修饰导致几乎完全丧失生物学活性(Wojchowski和Caslake，1989)。用胺反应性PEG共价修饰α-干扰素-2导致生物学活性丧失40-75％(Goodson和Katre，1990；Karasiewicz等，1995)。用大型(例如，10KDa)PEG使得生物学活性丧失最大(Karasiewicz等，1995)。用胺反应性PEG共价修饰G-CSF导致生物学活性丧失60％以上(Tanaka等，1991)。用胺反应性PEG广泛修饰IL-2导致生物学活性丧失90％以上(Goodson和Katre，1990)。用于PEG连接蛋白质的第二种已知的方法是使用半胱氨酸反应性PEG将PEG共价附着到半胱氨酸残基上。可以买到许多具有不同反应基团(例如，马来酰亚胺，乙烯砜)和不同大小PEG(2-40kDa)的高特异性半胱氨酸反应性PEG。在中性pH下，这些PEG试剂选择性地附着到“游离”半胱氨酸残基，即，不形成二硫键的半胱氨酸残基上。大多数蛋白质中的半胱氨酸残基参与形成二硫键且不可能用于使用半胱氨酸反应性PEG的PEG连接。通过使用重组DNA技术的体外诱变，可将额外的半胱氨酸残基导入蛋白质的任意位置。这种新添加的“游离”半胱氨酸可用作使用半胱氨酸反应性PEG的PEG部分特异性附着位点。该添加的半胱氨酸残基可取代蛋白质中已有的氨基酸，或添加到蛋白质的氨基末端之前或蛋白质的羧基末端之后，或插入到蛋白质的两个氨基酸之间。另外，可以删除天然二硫键中涉及的两个半胱氨酸中的一个或用另一氨基酸取代它，使得天然的半胱氨酸(该蛋白质中正常情况下与缺失或取代的半胱氨酸残基形成二硫键的半胱氨酸残基)游离并用于化学修饰。取代该半胱氨酸的氨基酸优选是中性氨基酸，如丝氨酸或丙氨酸。生长激素有两个能被碘乙酰胺还原并烷基化而不影响其生物学活性的二硫键(Bewley等，(1969))。4个半胱氨酸中的每一个都可以是用于缺失或以另一氨基酸取代的理想靶。
已知一些天然存在的蛋白质含有一个或多个“游离”的半胱氨酸残基。这种天然存在的蛋白质的例子包括人白细胞介素(IL)-2，β干扰素(Mark等，1984)，G-CSF(Lu等，1989)和碱性成纤维细胞生长因子(Thompson，1992)。IL-2，G-CSF和β干扰素含有奇数个半胱氨酸残基，而碱性成纤维细胞生长因子含有偶数个半胱氨酸残基。
然而，含游离半胱氨酸残基的重组蛋白质的表达由于游离巯基在生理学条件下的反应性而仍成问题。在诸如大肠杆菌的细菌中作为细胞内蛋白已经表达了一些含有游离半胱氨酸的重组蛋白质。其例子包括中性蛋白质，如IL-2，β干扰素，G-CSF，碱性成纤维细胞生长因子和改造的IL-2半胱氨酸突变蛋白(Goodson和Katre，1990)，IL-3(Shaw等，1992)，肿瘤坏死因子结合蛋白(Tuma等，1995)，IGF-I(Cox和Mcdermott，1994)，IGFBP-1(Van DenBerg等，1997)和蛋白酶连接蛋白和相关蛋白(Braxton，1998)。所有这些蛋白质当在细菌细胞内表达时都是不溶性的。这些不溶性蛋白质经过进行一系列的变性，还原和再折叠过程可再折叠成天然的构象。这些步骤增加了用于在细菌中生产这些蛋白质的生产方法的时间和成本。经过用另一氨基酸，例如丝氨酸，取代游离的半胱氨酸残基已经获得提高了稳定性和产量的IL-2(Mark等，1985)和β干扰素(DeChiara等，1986)。以可溶性，生物学活性形式表达重组蛋白以消除这些额外的步骤将是优选的。
在细菌中表达可溶性重组蛋白的一个已知方法是将它们分泌进周质空间或分泌进培养基。已知诸如GH的某些重组蛋白当它们分泌进大肠杆菌周质时以可溶性活性形式表达，而当它们在大肠杆菌细胞内表达时是不可溶的。经过将编码生长激素或其它目的蛋白的DNA序列与诸如来自stII(Fujimoto等，1988)和ompA蛋白(Ghrayeb等，1984)的那些编码细菌信号序列的DNA序列融合可实现分泌。在细菌中分泌重组蛋白是所希望的，因为可保留该重组蛋白的天然N-末端。重组蛋白的细胞内表达需要在该重组蛋白的氨基末端存在N-末端甲硫氨酸。在许多人类蛋白质的成熟形式的氨基末端正常情况下并不存在甲硫氨酸。例如，人生长激素成熟形式的氨基末端氨基酸是苯丙氨酸。为了在细菌中有效表达该蛋白质，如果在重组蛋白的氨基末端不存在甲硫氨酸，必须在该位置加上一个氨基末端甲硫氨酸。一般经过在编码重组蛋白质的DNA序列前加上ATG甲硫氨酸密码子实现添加氨基末端甲硫氨酸。加上的N-末端甲硫氨酸通常不能从重组蛋白上去掉，特别是如果重组蛋白是不溶性蛋白时。hGH就是这种情况，当在大肠杆菌细胞内表达该蛋白时，N-末端甲硫氨酸不去掉。加入的N-末端甲硫氨酸产生“非天然”的蛋白质，它可潜在地刺激人体免疫反应。相反，在使用stII(Chang等，1987)或ompA(Cheah等，1994)信号序列分泌进周质空间的hGH上没有添加的甲硫氨酸；该重组蛋白以天然氨基末端氨基酸苯丙氨酸为起始氨基酸。由于细菌酶在stII(或ompA)信号序列和成熟hGH蛋白起始处之间裂解stII-hGH蛋白质(或ompA-hGH蛋白质)，因此保留了天然的hGH蛋白质。尽管据信周质空间是一个促进二硫键形成的氧化环境，但蛋白质二硫化物异构酶与牛胰腺胰蛋白酶抑制剂的共表达导致来自大肠杆菌周质的正确折叠的蛋白质产量提高6倍(Ostermeier等，(1996))。这一结果表明周质蛋白折叠有时可能是无效的且需要改进以适用大规模的蛋白质生产。
hGH具有4个半胱氨酸，形成两个二硫键。可使用stII或ompA信号序列将hGH分泌进大肠杆菌周质中。分泌的蛋白质是可溶的且具有生物学活性(Hsiung等，1986)。hGH的主要分泌形式是一种单体，以十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测得的表观分子量为22kDa。经过使用渗透压休克方法可从周质空间分离重组hGH(Koshland和Botstein，1980)，其中优先释放周质蛋白质而不是细胞内蛋白质进入渗透压休克缓冲液。然后经过柱层析纯化释放的hGH蛋白质(Hsiung等，1986)。
当尝试相似的方法分泌含游离半胱氨酸残基的hGH变异体(5个半胱氨酸；2N+1)时，发现当使用用于hGH的标准渗透压休克和纯化方法分离时重组hGH变异体形成多聚体并聚集。在渗透压体克裂解产物中或在柱层析纯化蛋白质期间以非还原性SDS-PAGE可检测到极少的单体hGH。
α-干扰素(IFN-α2)也含有4个半胱氨酸残基，形成两个二硫键。可使用stII信号序列将IFN-α2分泌进大肠杆菌周质中(Voss等，1994)。分泌的蛋白质是可溶的且具有生物学活性(Voss等，1994)。IFN-α2的主要分泌形式是一种单体，以SDS-PAGE测得的表观分子量为19kDa。经过柱层析纯化分泌的重组IFN-α2蛋白质(Voss等，1994)。
当尝试相似的方法分泌含游离半胱氨酸残基的IFN-α2变异体(5个半胱氨酸；2N+1)时，发现当使用用于IFN-α2的标准纯化方法分离时重组IFN-α2变异体形成多聚体并聚集。从柱中洗脱的IFN-α2变异体极不同于IFN-α2且使用用于IFN-α2的柱层析方法可纯化极少的单体IFN-α2变异体。
合成含游离半胱氨酸残基的蛋白质的另一方法是经过与琥珀酰亚胺6-[(3-2-吡啶二硫代)丙酰胺基]己酸(LC-SPDP，可从Pierce化学公司买到)进行化学反应将巯基引入翻译后的蛋白质中。LC-SPDP与赖氨酸残基反应产生游离巯基。使用该试剂结合马来酰亚胺蛋白修饰试剂可制备化学交联二聚体EPO(Sytkowsk等，1998)。由于EPO中各个赖氨酸残基的非特异性修饰，纯化后回收到化学交联的EPO蛋白质的异型混合物。已观察到化学交联的EPO蛋白质的药物动力学和体内效价增强。
已被用于增加蛋白质大小并提高其体内效价的另一方法包括使用化学交联剂将蛋白质二聚体化。据认为GH通过交联两个GH受体转导细胞信号。GH-GH二聚体可能有助于增强受体二聚体化并因此放大细胞内信号。
Mockridge等(1998)已描述了化学交联的二聚体hGH蛋白质。使用水溶性交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)，可随机衍化GH以主要产生酰胺连接的二聚体，取决于所用的EDC试剂的浓度也可产生酰胺交联的多聚体。尽管观察到体内效价提高，但由于EDC试剂与蛋白质中的各种氨基酸，包括赖氨酸，天冬氨酸和谷氨酸残基和氨基和羧基末端的非特异性反应使得最终的蛋白制品是异型的。由于EDC的毒性和对蛋白质之间形成的非天然酰胺键的潜在免疫原性反应，将该制品注射进人体是不理想的。在生产规模上产生一致批次的纯化蛋白也是困难的。
因此，尽管作出了极大的努力，仍然需求经过增加分子量产生长效重组蛋白的同型制品的方法。也需要允许以高产量分泌和回收含游离半胱氨酸残基的重组蛋白的方法。本发明满足了这些需要并提供了相关优势。
发明概述本发明涉及获得具有游离半胱氨酸的可溶性蛋白质的方法。该方法一般通过获得能表达该可溶性蛋白质的宿主细胞，将该宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触，并从该宿主细胞中分离该可溶蛋白来完成。在一个实施方案中，蛋白质不被宿主细胞分泌进培养基中，在半胱氨酸封闭剂存在的条件下破碎宿主细胞并从破碎的宿主细胞可溶性部分分离或纯化该可溶性蛋白质。在另一种其中宿主细胞将该可溶性蛋白质分泌进培养基的实施方式中，在宿主细胞合成该可溶性蛋白质之前，期间或之后将宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触。
合适的宿主细胞包括细菌，酵母，昆虫或哺乳动物细胞。优选的是，宿主细胞是细菌细胞，特别是大肠杆菌。
优选的是，以本发明的方法生产的可溶性蛋白质是重组蛋白质，特别是蛋白质的半胱氨酸变异体或突变体。该方法用于产生包括，但不限于下列的蛋白质，人生长激素，EPO和干扰素，特别是α干扰素，它们的衍生物或拮抗剂。其它蛋白质包括TGF-β超家族的成员，血小板衍生的生长因子-A，血小板衍生的生长因子-B，神经生长因子，脑源性神经营养(neurotophic)因子，神经营养蛋白-3，神经营养蛋白-4，血管内皮生长因子，或其衍生物或拮抗剂。也包括免疫球蛋白重链或轻链或其衍生物的半胱氨酸突变蛋白。
有用的半胱氨酸封闭剂包括任何巯基反应性化合物，包括例如，胱氨酸，胱胺，二巯基乙醇酸，氧化型谷胱甘肽，碘，过氧化氢，二氢抗坏血酸，连四硫酸盐，邻-亚碘酰基苯甲酸或在金属离子存在下的氧。
本方法还包括将PEG部分附着到可溶性蛋白上形成PEG化蛋白质的各种方法，其中PEG部分通过游离半胱氨酸附着到可溶性蛋白质上。含有两个或更多个可溶性蛋白质偶连的更高级多聚体蛋白质也在本发明的范围内。
本发明还包括以本文公开的方法制备的可溶性蛋白质及其衍生物，包括PEG化蛋白质。该PEG化蛋白质包括单PEG化hGH，EPO和α干扰素。
本发明还提供了以本文描述的方法获得的PEG化可溶性蛋白质的方法。所述方法包括纯化蛋白质，用二硫键(disulfie)还原剂至少部分还原该蛋白质并将该蛋白质与半胱氨酸反应性部分接触。任选的是，可从未修饰的蛋白质中分离该修饰的半胱氨酸蛋白。
本发明还包括治疗可用生长激素，EPO和α干扰素治疗的症状的方法。将可溶性蛋白质或其衍生物，包括PEG化衍生物给病人用药，其中已知生长激素，EPO或α干扰素对其所患的症状有效。
附图简述

图1是通过重叠延伸进行诱变的图解，其中从一个靶DNA片段扩增两个不同的片段。
本发明的描述本发明提供了获得具有游离半胱氨酸残基的蛋白质的新方法。本发明还提供了以这些新方法生产的新蛋白质，特别是重组蛋白质以及这些重组蛋白质的衍生物。制备这些蛋白质的新方法一般通过下列步骤完成(a)获得能够表达具有游离半胱氨酸的蛋白质的宿主细胞；(b)将该宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触；和(c)从该宿主细胞分离该蛋白质。
在一个实施方案中，所述方法包括在半胱氨酸封闭剂存在的条件下破碎该宿主细胞，随后从破碎细胞的可溶性部分中分离该蛋白质的步骤。
在另一实施方案中，该蛋白质由原核或真核宿主细胞分泌进培养基中，该方法包括下列步骤(a)获得能够表达具有游离半胱氨酸的蛋白质的宿主细胞；(b)在该具有游离半胱氨酸残基的蛋白质的合成期间，或合成之后但在纯化之前将该宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触；和(c)从培养基的其它细胞成份中分离该蛋白质。
如上所述，这些方法的第一步是获得能够表达具有游离半胱氨酸残基的蛋白质的宿主细胞。合适的宿主细胞可以是原核或真核细胞。可用于表达重组蛋白质的合适的宿主细胞的例子包括细菌，酵母，昆虫和哺乳动物细胞。细菌细胞特别有用，特别是大肠杆菌。
本文所用的术语“具有游离半胱氨酸残基的蛋白质”指任意含有2N+1个半胱氨酸残基的天然或重组蛋白肽，其中，N可以是0或任意整数，和含有2N个半胱氨酸的蛋白质或肽，其中两个或多个半胱氨酸在正常情况下不参与形成二硫键。因此，本发明的方法可有效用于增强具有游离半胱氨酸的任意蛋白质或肽，特别是具有一个或多个游离半胱氨酸和/或具有2个或多个在天然情况下形成二硫键的半胱氨酸的半胱氨酸添加型重组蛋白质变体(本文称为“半胱氨酸突变蛋白”或“半胱氨酸变异体”)的表达，回收和纯化。尽管可用本发明的方法增强被其天然宿主细胞表达的具有游离半胱氨酸的天然蛋白质的表达，回收和纯化，但本文的描述主要是指仅用于说明目的的重组蛋白质。另外，所述蛋白质可来自任何动物种类，包括人类，陪伴(companion)动物和农场动物。
因此本发明包括广泛的重组蛋白质。这些蛋白质包括，但不限于，胶质来源的神经营养因子(GDNF)，转化生长因子-β1(TGF-β1)，TGF-β2，TGF-β3，抑制素A，抑制素B，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)，BMP-4，抑制素α，米勒抑制物质(MIS)，OP-1(成骨蛋白1)，它们都是TGF-β超家族的成员。TGF-β超家族的单体亚基有一些共同的结构特征它们一般含有8个高度保守的半胱氨酸残基，形成4个分子内二硫键。一般第9个保守的半胱氨酸在蛋白质的单体形式中是游离的，但参与单体亚基的同型二聚体化或杂二聚体化期间形成的分子间二硫键。TGF-β超家族的其它成员由Massague(1990)，Daopin等(1992)，Kingsley(1994)，Kutty等(1998)和Lawton等(1997)描述，本文引用以供参考。
免疫球蛋白重链和轻链单体也含有参与分子内二硫键的半胱氨酸残基以及游离半胱氨酸(Roitt等，1989和Paul，1989)。这些游离半胱氨酸一般仅参与多聚体化事件中形成的二硫键，例如，重链同型二聚体化，重链-轻链杂二聚体化，杂二聚体(重链-轻链)的同型二聚体化，和其它高级装配，例如，IgM中杂二聚体(重链-轻链)的五聚体化。因此，可采用本发明的方法增强诸如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，分泌型IgA，IgD和IgE等人类免疫球蛋白重链和/或轻链(或其各结构域)的表达，回收和纯化。也可同样表达，回收和纯化来自其它物种的免疫球蛋白。同样，也可表达，回收和纯化Chammow & Ashkenazi(1996)中所述的遗传融合到免疫球蛋白或免疫球蛋白结构域上的蛋白质。
本方法也可增强包括生长激素超家族成员的其它重组蛋白质的表达，回收和纯化。下列蛋白质由生长激素(GH)超基因家族的基因编码(Bazan(1990)；Bazan(1991)；Mott和Campbell(1995)；Silvennoinen和Ihle(1996)；Martin等，1990；Hannum等，1994)生长激素，泌乳素，胎盘催乳激素，促红细胞生成素(EPO)，血小板生成素(TPO)，白细胞介素-2(IL-2)，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12(p53亚基)，IL-13，IL-15，制癌蛋白M，睫状神经营养因子，白血病抑制因子，α干扰素，β干扰素，γ干扰素，Ω干扰素，τ干扰素，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，心脏营养蛋白-1(CT-1)，干细胞因子和flt3/flk2配体(“GH超基因家族”)。可预期将来可通过基因克隆和测序鉴定该基因家族中的其它成员。GH超基因家族的成员具有相似的二级和三级结构，尽管事实上它们一般具有有限的氨基酸或DNA序列相同性。共同的结构特征使得该基因家族的新成员容易被鉴定。
根据称为“半胱氨酸结”的共同结构基序将一组蛋白质分类为结构超家族。半胱氨酸结由6个保守的半胱氨酸残基限定，形成拓扑学上“打结”的3个分子内二硫键(McDonald和Hendrickson，1993)。这些蛋白质也形成同型二聚体或杂二聚体，且有些但不是所有情况下二聚体化涉及分子间二硫键形成。该家族的成员包括TGF-β超家族的成员和其它蛋白质，例如，血小板衍生的生长因子-A(PDGF-A)，PDGF-B，神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3(NT-3)，NT-4，和血管内皮生长因子(VEGF)。胱氨酸和其它半胱氨酸封闭剂也可增强具有该结构基序的蛋白质的表达，回收和纯化。
本方法也可增强其它重组蛋白质和/或这些蛋白质的半胱氨酸添加型变异体的表达，回收和纯化。蛋白质的类型包括蛋白酶和其它酶，蛋白酶抑制剂，细胞因子，细胞因子拮抗剂，过敏原，趋化因子，促性腺激素，趋化素(chemotactin)，脂结合蛋白，垂体激素，生长因子，生长调节素，免疫球蛋白，白细胞介素，干扰素，可溶性受体，疫苗和血红蛋白。蛋白质的具体例子包括，例如，leptin，胰岛素，胰岛素样生长因子1(IGF1)，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，天冬氨酸酶，尿酸酶，成纤维细胞生长因子，精氨酸酶，苯丙氨酸氨(phenylalanine ammonia)，制管张素，内抑制素(endostatin)，VIII因子，IX因子，白细胞介素1受体拮抗剂，蛋白酶连接蛋白和抗凝血酶III。
其它得益于PEG化且因此可作为半胱氨酸添加型修饰的合理候选者的蛋白质变异体包括具有微弱可溶性或容易聚集的蛋白质或肽，对蛋白水解易感的蛋白质或肽，需要增强机械稳定性的蛋白质或肽，从体内迅速清除的蛋白质或肽，或具有不需要的免疫原性或抗原性特征的蛋白质或肽。
如果需要，一般可使用以定点PCR为基础的诱变构建天然蛋白质的突变体，一般按下述文献的描述进行分子生物学方法第15卷PCR方法常规(current)方法和应用，White，B.A.编(1993)，Humana Press，Inc.，Totowa，NJ和PCR方法方法和应用指南，Innis，M.A.等编，(1990)，学院出版社，San Diego，CA。通常将PCR引物寡核苷酸设计为能在蛋白质的编码序列中掺入核苷酸改变，导致在蛋白质特定位置的一个氨基酸被半胱氨酸残基取代。也可将这类诱变的寡核苷酸引物设计成在蛋白质编码序列的羧基末端或氨基末端掺入一个额外的半胱氨酸残基。如果需要的话，在后一种情况下，也可将一个或多个其它氨基酸残基掺入到所添加的半胱氨酸残基的氨基末端和/或羧基末端。而且如果需要的话，可将寡核苷酸设计成在蛋白质编码序列的特定位置将半胱氨酸残基作为插入突变而掺入。同样，也可与半胱氨酸残基一起插入一个或多个其它氨基酸，这些氨基酸可位于该半胱氨酸残基的氨基末端和/或羧基末端。
对诱变型寡核苷酸(oligo)的序列的选择依赖于所需半胱氨酸将要放入的位置和有用的限制性核酸内切酶位点的相似性。一般来说，需要在靠近寡核苷酸中央的位置放置突变，即，错配片段以增强寡核苷酸与模板的退火。也需要使该诱变型寡核苷酸跨越一个特有的限制性位点，以便可裂解PCR产物产生一个容易被克隆进合适载体的片段。一个例子是可用于表达突变蛋白或提供用于切下突变基因并容易将其克隆进所述表达载体的常规限制性位点的寡核苷酸。一般需要采用长度为80个碱基以下的诱变型寡核苷酸，更优选30-40个碱基长度。有时突变位点和限制性位点分开，其距离大于合成性寡核苷酸合成所需的距离。在这种情况下，可采用多轮PCR递增式延长PCR产物的长度，以便它可包括所需有用的限制性位点或可重新改造或重新合成作为诱变的靶的基因以便在合适的位置插入限制性位点。另外，也可采用PCR诱变方法的变化形式构建该突变，例如，所谓的“大引物方法”(Barik，S.，分子生物学方法，第15卷，第277-286页；PCR方法常规方法和应用，White，B.A.编辑(1993)Humana出版社，Totowa，NJ)或“通过重叠延伸实施的基因剪接”(Horton，R.M.分子生物学方法，第15卷，第251-261页；PCR方法常规方法和应用，White，B.A.编辑(1993)Humana出版社，Totowa，NJ)，均为本文引用以供参考。
接着，将宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触。在一个实施方案中，该封闭剂在细胞破碎时存在，且优选在破碎细胞前加入。细胞破碎可经过，例如，机械剪切(例如费氏细胞压碎器)，酶消化，超声处理，匀浆，玻璃珠旋转，去污剂处理，有机溶剂，冻融，用氧化铝或沙研磨等(Bollag等，1996)。
在另一实施方案中，在诱导宿主细胞表达所需蛋白质之前，期间或之后将半胱氨酸封闭剂与宿主细胞接触。例如，可在半胱氨酸封闭剂存在的条件下培养宿主细胞，其中优选表达将被分泌进培养基的蛋白质，如促红细胞生成素。或者，在宿主细胞接触半胱氨酸封闭剂之前或期间，可诱导宿主细胞，或者作为分泌进周质或培养基中的蛋白质，或者作为胞质蛋白质，来表达所需蛋白质。可根据细胞来源使用本领域已知的方法诱导该细胞质中的表达或指导分泌，包括，例如，在下面实施例中所述的方法。已成功使用各种信号肽将蛋白质运输到周质空间。其例子包括原核信号序列，例如，ompA，stII，PhoA信号(Denefle等，1989)，OmpT(Johnson等，1996)，LamB和OmpF(Hoffman和Wright，1985)，β-内酰胺酶(Kadonaga等，1984)，肠毒素LT-A，LT-B(Morioka-Fujimoto等，1991)，和来自金黄色葡萄球菌的蛋白A(Abrahmsen等，1986)。帮助某些蛋白质分泌的许多非天然的，合成的信号序列也是本领域的技术人员已知的。
对于分泌进周质的蛋白质，可使用渗透压休克处理选择性地破坏宿主细胞的外膜使得周质蛋白质释放。渗透压休克缓冲液可以是本领域已知的任何渗透压休克缓冲液，包括，例如，Hsiung等(1986)所述的渗透压休克缓冲液和方法，或如下面实施例所述。对于分泌进培养基的蛋白质，优选在细胞表达和分泌该蛋白质时培养基含有半胱氨酸封闭剂。也可以在蛋白质分泌后但在蛋白质纯化之前向培养基中加入半胱氨酸封闭剂。
向培养基中加入的半胱氨酸封闭剂的浓度范围是大约0.1μM至大约100mM。优选的是，培养基中半胱氨酸封闭剂的浓度是大约50μM至大约5mM。
尽管不希望受任何特定的理论所束缚，但据信用于本方法的半胱氨酸封闭剂共价附着到“游离”的半胱氨酸残基上，形成混合的二硫化物，从而稳定游离的半胱氨酸残基并防止蛋白质的多聚体化和聚集。另外，如果在蛋白质分泌进周质空间后发生不完全复性，那么在渗透压休克缓冲液中氧化剂的存在可能扩大蛋白质的再折叠过程。然而，如上所述，周质蛋白质再折叠的效率可能较低(ineffcient)。因此，据信向渗透压休克缓冲液中加入胱氨酸也可增加含有偶数个半胱氨酸残基的重组蛋白质的回收，即使在正常情况下半胱氨酸形成二硫键。另外，本发明人相信在细菌生长期间向发酵培养基中加入胱氨酸或类似化合物可能是具有优势的，因为由于细菌外膜的多孔性这些化合物可扩散进周质。蛋白折叠和游离半胱氨酸的封闭可在细胞回收和裂解前完成。早期的蛋白质稳定可防止蛋白水解且有助于获得更高的重组蛋白回收率。
许多巯基反应性化合物可用作半胱氨酸封闭剂以稳定含有游离半胱氨酸的蛋白质。除了胱氨酸外，封闭剂也包括含二硫键的试剂，例如，胱胺，二巯基乙醇酸，氧化型谷胱甘肽，5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(Ellman′s试剂)，吡啶二硫化物，R-S-S-CO-OCH3型化合物，胱氨酸的其它衍生物，例如二甲酰胱氨酸，二乙酰胱氨酸，二甘氨酰胱氨酸，二丙氨酰胱氨酸，二谷氨酰胱氨酸，胱氨酰二甘氨酸，胱氨酰二谷氨酰胺，二丙氨酰胱氨酸二酐，胱氨酸苯基乙内酰脲，高胱氨酸，二硫代二丙酸，二甲基胱氨酸，或任何二巯基化合物或能进行二硫化物交换反应的化合物。亚氧硫基卤化物也可用于制备混合的二硫化物。可用于稳定半胱氨酸添加型蛋白变异体的其它巯基封闭剂包括能与游离巯基可逆反应的化合物。这些试剂包括某些重金属盐或锌，汞和银的有机衍生物。其它硫醇盐形成剂或可逆性巯基反应性化合物如R.Cecil和J.R.McPhee，(1959)和Torchinskii，(1971)所述。
在一般方法的最后一步中，所需的蛋白质从可溶性细胞质部分，可溶性周质部分或培养基的可溶性部分回收和纯化。可使用从培养基，细胞质或周质部分回收和纯化蛋白质的任何方法。这些回收和纯化方法是已知的或本领域的技术人员容易确定的，包括，例如，离心，过滤，透析，层析，包括大小排阻层析等方法。回收和纯化所需蛋白质的合适方法部分取决于蛋白质的特性和目的用途。
本发明还提供了产生可溶性干扰素，特别是α干扰素的新方法，导致回收的正确加工的干扰素的百分比显著提高。该方法包括在大约5到大约6.5，且优选大约5.5到大约6.5的pH范围内培养能表达干扰素的宿主细胞。已公开的报道(Voss等，(1994))使用更高的pH仅产生50％正确加工的干扰素，而本发明的新方法在较低的pH下回收到大约80-90％。
已发现某些单体hGH半胱氨酸变异体在使用层析方法纯化这些蛋白质时形成二硫键连接的二聚体hGH蛋白质。当从柱缓冲溶液中去除胱氨酸时形成二硫键连接的hGH二聚体。由于二硫键连接的二聚体hGH蛋白质在使用柱层析步骤纯化该蛋白质的过程中行为不同于单体hGH蛋白质，因此开发了纯化二硫键连接的二聚体hGH蛋白质的新方法。意想不到的是，已发现这些二硫键连接的二聚体hGH蛋白质在体外生物试验中具有生物学活性。具有生物学活性的，同型的，二硫键连接的二聚体hGH蛋白质是新的。因此，本发明还涉及这些具有生物学活性的，同型的，二硫键连接的二聚体hGH蛋白质。也包含高级多聚体，包括三聚体，四聚体等，如下面实施例所述。
如果需要，可进一步加工纯化的蛋白质。例如，该蛋白质可用各种半胱氨酸反应性PEG试剂在游离半胱氨酸位点被PEG化，并随后作为单PEG化蛋白质纯化。术语“单PEG化”定义为指通过单个PEG部分共价附着到蛋白质的特定位点而修饰的蛋白质。可使用本领域的技术人员已知的任何方法，包括，例如，下面实施例，特别是实施例11中描述的方法。
Braxton(1998)教导了使蛋白质的半胱氨酸突变蛋白，特别是GH和促红细胞生成素的半胱氨酸突变蛋白PEG化的方法。特别是Braxton(1998)教导了用于PEG化半胱氨酸突变蛋白的缓冲液不应含有还原剂。Braxton(1998)提供的还原剂的例子是β巯基乙醇(BME)和二硫苏糖醇(DTT)。当使用相似方法来PEG化GH，促红细胞生成素和α干扰素的半胱氨酸突变蛋白时，发现这些半胱氨酸突变蛋白不与PEG连接。现在已发现用还原剂处理纯化的半胱氨酸突变蛋白是蛋白质与PEG化蛋白质所必需的。尽管不希望被任何具体理论所束缚，但本发明人相信还原剂是还原混合的二硫化物并暴露蛋白质中的游离半胱氨酸残基以便游离的半胱氨酸与PEG试剂反应所必需的。因此，本发明还涉及使GH，促红细胞生成素，α干扰素的半胱氨酸突变蛋白和其它含有2N+1个半胱氨酸残基的蛋白质，含有2N个半胱氨酸残基且其中2个或多个半胱氨酸残基游离的蛋白质，特别是游离半胱氨酸残基被混合的二硫化物封闭的那些突变体和蛋白质PEG化的方法。
本发明还涉及由本文公开的方法产生的纯化的，单PEG化蛋白质变异体，它们不仅具有生物学活性，还在蛋白质依赖型哺乳动物细胞增殖试验中保持高比活。所述蛋白质变异体包括，例如，下列纯化的，单PEG化半胱氨酸突变蛋白hGH，EPO和αIFN。例如，单PEG化hGH变异体的体外生物学活性比使用NHS-PEG试剂PEG化的hGH的生物学活性高10-100倍。
在单PEG化hGH的一个实施方案中，聚乙二醇附着到hGH的C-D环上，所得的单PEG化hGH的EC50不到大约110ng/ml(5nM)，优选不到大约50ng/ml(2.3nM)。另外，聚乙二醇部分可附着到hGH的靠近螺旋A的区域，所得的单PEG化hGH的EC50不到大约110ng/ml(5nM)，优选不到大约11ng/ml(0.5nM)，更优选不到大约2.2ng/ml(0.1nM)。
在单PEG化EPO的一个实施方案中，聚乙二醇附着到EPO的C-D环上，所得的单PEG化EPO的EC50不到大约1000ng/ml(21nM)，优选不到大约100ng/ml(大约6nM)，更优选不到大约10ng/ml(0.6nM)，最优选不到大约1ng/ml(大约0.06nM)。另外，聚乙二醇分子可附着到EPO的A-3环上，所得的单PEG化EPO的EC50不到大约100ng/ml(大约5nM)，优选不到20ng/ml(大约1nM)，且更优选不到大约1ng/ml(大约0.05nM)。
在单PEG化αIFN的一个实施方案中，聚乙二醇附着到αIFN的靠近螺旋A的区域，所得的单PEG化αIFN的IC50不到大约100pg/ml(大约5pM)，更优选不到大约50pg/ml(大约2.5pM)，最优选大约22ng/ml(大约1.2pM)。另外，聚乙二醇分子可附着到IFN-α2的C-D环上，所得的单PEG化IFN-α2的EC50不到大约100pg/ml(大约5pM)。
有25个以上不同的IFN-α基因(Pestka等，1987)。IFN-α家族的成员具有不同程度的氨基酸同源性且表现出生物学活性的重叠。通过将不同IFN-α蛋白质的区域连接起来产生的非天然重组IFN-α处于临床开发的各个阶段(Horisberger和DiMarco，1995)。也描述了在IFN-α的各位置掺入最常见氨基酸的非天然“共有”干扰素(Blatt等，1996)。使IFN-α2的半胱氨酸突变蛋白PEG化的合适位置可直接适用于IFN-α基因家族的其它成员和非天然IFN-α。Kinstler等，(1996)描述了单PEG化共有干扰素，其中该蛋白质在N-末端，非天然的甲硫氨酸残基上优先与单个PEG连接。PEG化蛋白质的生物学活性比未修饰的共有干扰素降低大约5倍(Kinstler等，1996)。
本发明还提供了互相之间或与化学基团之间能共价附着或连接以产生高级多聚体，如二聚体，三聚体和四聚体的蛋白质变异体。可按照本领域的技术人员已知的方法或按下面实施例15所述的方法产生该高级多聚体。例如，该连接可产生比相应的天然蛋白质具有更高分子量的hGH，EPO或αIFN加合物。适用于偶连的化学基团优选是非毒性的和非免疫原性的。这些化学基团包括糖类或聚合物，例如多元醇。
用于附着本发明的半胱氨酸变异体以形成“PEG化”蛋白质的“PEG部分”包括任何合适的多聚体，例如，线性或带支链的多元醇。优选的多元醇是聚乙二醇，它是由环氧乙烷单元组成的合成多聚体。可改变环氧乙烷单元以便通过大小排阻层析获得表观分子量范围为大约30-500,000的PEG化蛋白质变异体。PEG部分的大小直接影响其循环半衰期(Yamaoka等，(1994))。因此，可通过改变PEG部分的大小或结构来加工具有不同循环半衰期的蛋白变异体使之用于具体治疗应用或优选的剂量方案。因此，本发明包含GH蛋白质变异体，其以大小排阻层析测定具有超过大约30kDa，且更优选超过大约70kDa的表观分子量，其EC50不到大约400ng/ml(18nM)，优选不到10ng/ml(5nM)，更优选不到大约10ng/ml(0.5nM)，甚至更优选不到大约2.2ng/ml(0.1nM)。本发明还包含EPO蛋白质变异体，其以大小排阻层析测定具有超过大约30kDa，且更优选超过大约70kDa的表观分子量，其EC50不到大约1000ng/ml(21nM)，优选不到100ng/ml(6nM)，更优选不到大约10ng/ml(0.6nM)，甚至更优选不到大约1ng/ml(0.06nM)。本发明还包含αIFN(IFN-α)蛋白质变异体，其以大小排阻层析测定具有超过大约30kDa，且更优选超过大约70kDa的表观分子量，其IC50不到大约1900pg/ml(100pM)，优选不到400pg/ml(21pM)，更优选不到100pg/ml(5nM)，甚至更优选不到大约38pg/ml(2pM)。
用于半胱氨酸修饰的反应性PEG末端基团包括但不限于乙烯砜，马来酰亚胺和碘乙酰基团。PEG末端基团应对游离巯基具有特异性，在不损伤蛋白质的条件下发生反应。
也可使用添加了半胱氨酸的变异型GH制备拮抗剂hGH变异体，其中化学衍化不干扰受体结合但阻止信号加工。可得益于GH拮抗剂给药的病症包括肢端肥大症，血管性眼病，糖尿性肾病，血管形成术后的再狭窄和生长激素反应性恶性肿瘤。
本文使用的术语“衍生物”指以本文方法表达和回收的任何蛋白质变异体。这类变异体包括，但不限于，PEG化形式，二聚体或其它高级变异体，氨基酸变异体，融合蛋白，糖类的改变，磷酸化或在天然蛋白质中发现的其它附着基团，以及本文公开的任何其它变异体。
本文方法产生的化合物可用于各种体外和体内用途。本发明的蛋白质及其衍生物可用于对于其野生型，天然的，或以前已知的修饰型对应物已知的研究，诊断或治疗目的。体外用途包括，例如，使用该蛋白质用于筛选，检测和/或纯化其它蛋白质。
对于治疗用途，技术人员可容易地确定合适的剂量，给药频率和给药途径。作出这些决定的因素包括，但不限于，所施用的蛋白质的特性，所需治疗的病症，潜在的病人应变性，病人的年龄和体重等。本发明的化合物也可用作传递载体用于增强所附着的治疗剂的循环半衰期或指导向体内特异性靶的传递。
下面的实施例并不打算限制本发明，而仅仅是对本发明的具体实施方案的举例。
实施例1人生长激素体外生物测定的建立已建立了使用以兔GH受体稳定转染的鼠FDC-P1细胞系的hGH细胞增殖测定(Rowlinson等，1995)。小鼠FDC-P1细胞系从美国典型培养物保藏中心购买且按常规在补充了10％胎牛血清，50μg/ml青霉素，50μg/ml链霉素，2mM谷氨酰胺和17-170单位/ml小鼠IL-3的RPMI1640培养基(FDC-P1培养基)中繁殖。
A.克隆编码兔GH受体的cDNA使用正向引物BB3(5’-CCCCGGATCCGCCACCATGGATCTCTGGCAGCTGCTGTT-3’)(SEQ.ID.NO.1)和反向引物BB36(5’-CCCCGTCGACTCTAGAGCCATTA GATACAAAGCTCT TGGG-3’)(SEQ.ID.NO.2)经过PCR克隆兔GH受体。BB3与编码受体的起始甲硫氨酸和氨基末端部分的DNA序列退火。BB3含有一个在起始甲硫氨酸之前的优化的KOZAK序列和用于克隆目的的Bam HI位点。BB36与兔GH受体mRNA的3’不翻译区退火且含有用于克隆目的的Xba I和Sal I限制性位点。兔肝脏poly(A)+mRNA(从CLONTECH公司购买)用作单链cDNA第一链合成的底物以产生用于PCR扩增的模板。使用Boehringer Mannheim公司的用于RT-PCR(AMV)的第一链cDNA合成试剂盒完成单链cDNA的第一链合成。使用随机六聚体或BB36作引物进行平行的第一链cDNA合成。使用第一链合成的产物作模板以引物BB3和BB36进行随后的PCR反应。在使用随机6聚体引发的或BB36引发的cDNA作模板的PCR反应中观察到预期的～1.9kb的PCR产物。用Bam HI和Xba I消化随机6聚体引发的cDNA，产生两个片段(～365bp和～1600bp)，因为兔GH受体基因含有一个内部Bam HI位点。凝胶纯化两个片段。然后以两步克隆全长兔GH受体cDNA。首先将～1600bp的Bam HI-Xba I片段克隆进已用相同的这两个酶消化的pCDNA3.1(+)(Invitrogen公司)中。这些克隆容易以合理的频率获得并且以限制性消化和随后的测序显示没有缺失。为了完成兔受体cDNA克隆，将含有1600bp Bam HI-Xba I片段的一个测序质粒用Bam HI消化，用小牛碱性磷酸酶处理，凝胶纯化并与含有兔GH受体基因5’部分的凝胶纯化的～365bp Bam HI片段连接。挑出连接后的转化子并经过限制性消化和PCR分析以证实存在～365bp的片段并测定其相对于兔GH受体基因远端片段的方向。然后证实全长克隆的序列。该质粒命名为pBBT118，用于稳定转染FDC-P1细胞。
B.选择表达兔GH受体的稳定转染的FDC-P1细胞使用Qiagen的“无内毒素的质粒纯化试剂盒”制备无内毒素的pBBT118DNA用于转染FDC-P1细胞。从R&D系统购买小鼠IL-3。使用从GIBCO购买的DMRIE-C阳离子化的脂试剂，按照生产商的说明用质粒pBBT118转染FDC-P1细胞。简单地说，在6孔组织培养盘中将4μg质粒DNA与4-30μl DMRIE-C试剂在1ml的OptiMEM培养基(GIBCO)中混合45分钟。复合物形成后，向各孔中加入2×106个在200μl补充了小鼠IL-3的OptiMEM培养基中的FDC-P1细胞且混合物在37℃放置4小时。最终的小鼠IL-3浓度为17单位/ml。向各孔中加入2ml含有15％胎牛血清的FDC-P1培养基并将细胞在37℃放置过夜。第二天将转染的细胞转移到含有15ml补充了IL-3(17U/ml)，hGH(5nM)和10％马血清而非胎牛血清的FDC-P1培养基中。由于有报道胎牛血清含有对FDC-P1细胞的生长促进活性而使用马血清。3天后离心细胞并重悬于含有400μg/ml G418，17U/ml IL-3，5nM hGH，10％马血清的新鲜FDC-P1培养基中并在37℃下培养。每过几天更换培养基。将各次转染的细胞分进含有新鲜培养基以及小鼠IL-3(17U/m1)，或者hGH(5nM)的T-75组织培养瓶中。从含有IL-3以及含有hGH的培养瓶中都获得了G418抗性细胞。用于生物测定的转化子来自含有hGH的培养瓶。经过有限稀释选择了12个独立的细胞系。其中5个细胞系(GH-R3，-R4，-R5，-R6和-R9)显示出对hGH较好的增殖应答。初步实验表明各个细胞系对于hGH的EC50是相似的，尽管生长应答的大小随细胞系发生变化。对GH-R4细胞系进行了最详细的研究并用于下面提供的测定。细胞系按常规在含有10％马血清，50单位/ml青霉素，50μg/ml链霉素，2nM谷氨酰胺，400μg/ml G418和2-5nM垂体hGH或由GH的RPMI 1640培养基中繁殖。
C.使用表达兔GH受体的FDC-P1建立hGH生物测定建立Rowlinson等(1995)所述的MTT细胞增殖测定的改良形式以测量hGH的生物学活性。我们在测定中测量了染料MTS的吸收和还原，该染料产生可溶性产物，它不同于MTT，MTT产生必须用有机溶剂溶解的不溶性产物。使用MTS的优势在于可测定孔中的吸光度而不需用有机溶剂裂解细胞。
用无酚红的RPMI 1640培养基洗涤GH-R4细胞三次并以1×105个细胞/ml的浓度重悬于测定培养基(无酚红的RPMI 1640，10％马血清，50单位/ml青霉素，50μg/ml链霉素，400μg/ml G418)中。向96孔平底组织培养板的孔中加入50微升细胞悬液(5×103个细胞)。在测定培养基中制备3倍系列稀释的蛋白质样品并以50μl的体积加入微滴定孔中。产生每孔100μl的最终体积。蛋白质样品以一式三份孔进行测定。平板在湿润的5％CO2组织培养箱中37℃下培养66-72小时，此时向各孔中加入20μl MTS/PES(PES是电子偶合剂)试剂混合物(CellTITER 96 Aqueous One溶液试剂，Promega公司)。2-4小时后在490nm下测定孔中的吸光度。计算一式三份孔中的吸光度平均值+/-标准偏差。对照孔含有培养基但无细胞。从样品孔的吸光度值中减去对照孔的吸光度值(通常为0.06-0.2个吸光度单位)。对照实验证实与在吸光度值2以内吸光度信号细胞数相关。所有测定包括人垂体GH标准品。除了测定培养基不含G418且用胎牛血清取代马血清外按上面所述进行使用亲本FDC-P1细胞系的实验。
实施例2克隆和表达rhGHA.克隆编码人生长激素(GH)的cDNA使用聚合酶链式反应(PCR)技术和引物BB1和BB2从人垂体单链cDNA(从CLONTECH公司，Palo Alto，CA购买)扩增人GH cDNA。BB1的序列是(5’-GGGGGTCGACCATATGTTCCCAACCATTCCCTTATCCAG-3’)(SEQ.ID.NO.4)。BB2的序列是(5’-GGGGGATCCTCACTAGAAGCCACAGCTGCCCTC-3’)(SEQ.ID.NO.4)。引物BB1设计成编码成熟GH的第一个氨基酸(苯丙氨酸)之前的起始甲硫氨酸和用于克隆目的的SalI和NdeI位点。反向引物BB2含有用于克隆目的的Bam HI位点。PCR反应含有各20pmole的各种寡核苷酸引物，1XPCR缓冲液(含有MgCl2的Perkin-Elmer缓冲液)，4种核苷酸dA，dC，dG和dT的浓度各为200μM，2ng单链cDNA，2.5单位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer)和2.5单位的Pfu聚合酶(Stratagene公司)。PCR反应条件为96℃3分钟，35个循环的(95℃，1分钟；63℃30秒；72℃1分钟)，接着72℃10分钟。使用的热循环仪是Amplitron II热循环仪(Thermolyne)。大约600bp的PCR产物用Sal I和Bam HI消化，凝胶纯化并克隆进同样消化的质粒pUC19(可从新英格兰生物实验室，Beverly，MA买到)中。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株DH5α中并在含氨苄青霉素的LB平板上选择转化子。几个菌落在LB培养基上生长过夜，使用从Qiagen公司(Valencia，CA)买到的小质粒DNA分离试剂盒分离质粒DNA。测定克隆LB6具有正确的DNA序列。
为了在大肠杆菌中表达，用Nde I和Eco RI消化克隆LB6，凝胶纯化大约600bp的片段并克隆进已用相同的酶消化并用小牛碱性磷酸酶处理的质粒pCYB1(可从新英格兰生物实验室，Beverly，MA买到)中。将连接混合物转化进大肠杆菌DH5α中并在含氨苄青霉素的LB平板上选择转化子。从几个转化子分离质粒DNA并通过用Nde I和Eco RI消化进行筛选。鉴定了一个正确的克隆并命名为pCYB1wtGH(pBBT120)。将该质粒转化进大肠杆菌菌株JM109或W3110(可从新英格兰生物实验室和美国典型培养物保藏中心获得)中。
B.stII-GH的构建使用野生型GH克隆LB6(pUC19野生型GH)作模板以构建含有大肠杆菌stII信号序列的GH克隆。由于其长度，在连续两个PCR反应中加入stII序列。第一个反应使用正向引物BB12和反向引物BB10。BB10具有序列(5’CGCGGATCCGATTAGAATCCACAGCTCCCCTC3’)(SEQ.ID.NO.5)。BB12具有序列(5’-GCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCTTACGCATTCCCAACCATTCCCTTATCCAG-3’)(SEQ.ID.NO.6)。PCR反应按扩增野生型GH的所述方法进行。使用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)凝胶纯化大约630bp的PCR产物，在水中稀释50倍，取2μl用作第二次PCR反应的模板。第二次PCR反应使用反义引物BB10和正向引物BB11。BB11具有序列(5’CCCCCTCTAGACATATGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG-3’)(SEQ.ID.NO.7)。引物BB11含有用于克隆目的的XbaI和NdeI位点。PCR条件按第一次反应所述进行。大约660bp的PCR产物用XbaI和BamHI消化，凝胶纯化并克隆进同样酶切的质粒pCDNA3.1(+)(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)中。测定克隆pCDNA3.1(+)∷stII-GH(5C)或“5C”具有正确的DNA序列。
用NdeI和BamHI裂解克隆“5C”并克隆进同样酶切的pBBT108(pUC19的缺失Pst I位点的衍生物，该质粒在下面描述)中。用这些酶消化后鉴定具有正确插入片段的克隆。该克隆命名为pBBT111，用Nde I和Sal I消化该克隆，凝胶纯化含有stII-GH融合基因的660bp的片段并克隆进用相同酶消化并用小牛碱性磷酸酶处理的质粒表达载体pCYB1(新英格兰生物实验室)中。用限制性核酸内切酶消化鉴定含有stII-GH插入片段的重组质粒。选择一个这样的分离物用于进一步的研究并命名为pBBT114。将该质粒转化进大肠杆菌菌株JM109或W3110(可从新英格兰生物实验室和美国典型培养物保藏中心获得)中。
C.构建ompA-GH使用野生型GH克隆LB6(pUC19野生型GH)作模板以构建含有大肠杆菌ompA信号序列的GH克隆。由于其长度，在连续两个PCR反应中加入ompA序列。第一个反应使用正向引物BB7(5’GCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAG3’)(SEQ.ID.NO.8)和反向引物BB10(5’CGCGGATCCGATTAGAATCCACAGCTCCCCTC3’)(SEQ.ID.NO.5)。除了使用大约4ng的质粒LB6作为模板而不用单链cDNA外，按扩增野生型GH所述进行PCR反应，PCR条件为96℃3分钟，30个循环的(95℃，1分钟；63℃30秒；72℃1分钟)，接着72℃10分钟。使用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)凝胶纯化大约630bp的PCR产物，在水中稀释50倍，取2μl用作第二次PCR反应的模板。第二次PCR反应使用反义引物BB10和正向引物BB6(5’CCCCGTCGACACATATGAAGAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTC3’)(SEQ.ID.NO.9)。PCR条件按第一次反应所述进行。大约660bp的PCR产物凝胶纯化，用Sal I和BamH1消化并克隆进用Sal I和BamH1酶切的pUC19(新英格兰生物实验室)中或用Xho I和BamH1酶切(Sal I和Xho I产生相容性单链突出端)的pCDNA3.1(+)(Invitrogen公司)中。当测序几个克隆时，发现所有的pUC19(8/8)克隆在ompA序列区域含有错误。仅测序了一个pCDNA3.1(+)克隆且它在ompA区域含有序列多义性(ambiguity)。为了产生正确的ompA-GH融合序列，将含有用常规限制性位点分离的不同错误的两个已测序克隆的基因片段重组并克隆进缺少PstI位点的pUC19衍生物(见下述pBBT108)中。所得的质粒称为pBBT112，它携带ompA-GH融合基因，将该基团作为NdeI-BamH1片段克隆进pBBT108的这些相同位点。该质粒命名为pBBT112，用于下面所述的以PCR为基础的，GH的定点诱变。
D.构建Pst I-pUC19(pBBT108)为了促进克隆的GH基因的诱变以构建选定的半胱氨酸取代和插入突变，按如下构建质粒pUC19(新英格兰生物实验室)的缺失了Pst I位点的衍生物。用Pst I消化pUC19质粒DNA并随后使用补充了200μM dNTP的卖主提供的反应缓冲液用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)在75℃下处理。在这些条件下，聚合酶将消化用Pst I切割产生的3’单链突出端但不消化成双链区，其净结果为缺失含有Pst I识别位点中间4个碱基的4个单链碱基。所得的分子具有双链末端，即钝末端。经过这些酶反应后，使用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)凝胶纯化线型单体。按照卖主的方案用T4 DNA连接酶(新英格兰实验室)处理纯化的DNA，用Pst I消化并用于转化大肠杆菌DH5α。挑出转化子并经过用Pst I和Bam H1限制性消化进行分析。挑出的一个转化子不被Pst I裂解但在其邻近的Bam H1位点被裂解，将该转化子命名为pBBT108。
E.在大肠杆菌中表达met-hGH和stII-hGH将编码met-hGH的pBBT120和编码stII-hGH的pBBT114转化进大肠杆菌菌株W3110中。将亲本载体pCYB1也转化进W3110中。所得的菌株命名如下BOB130W3110(pCYB1)＝仅含载体BOB133W3110(pBBT120)＝met-hGHBOB132W3110(pBBT114)＝stII-hGH这些菌株在含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria肉汤(LB)中37℃下生长过夜。饱和的过夜培养物在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中稀释至A600下为大约0.025 O.D并在摇瓶中37℃下培养。当培养物的O.D.达到大约0.25-0.5时，加入IPTG至最终浓度为0.5mM以诱导重组蛋白质的表达。对于起始实验，在诱导后0，1，3，5和大约16小时时取培养物样品。沉淀诱导的和未诱导的培养物样品且需要时重悬于加入了1％β-巯基乙醇(BME)的SDS-PAGE样品缓冲液。样品在预制的14％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用考马斯兰染色凝胶或经过Western印迹分析。
对表达met-hGH的BOB133菌株和表达stII-hGH的BOB132的全细胞裂解产物的考马斯兰染色显示出一条与购自Research Diagnostics公司的纯化rhGH标准品一起迁移的大约22kDa的带。诱导过夜后在诱导的培养基中rhGH带是最显著的。使用购自美国生物学公司的多克隆兔抗hGH抗血清的Western印迹证实在诱导后3和16小时的诱导的BOB132和BOB133培养物裂解产物中均存在rhGH。在诱导后3或16小时的对照菌株BOB130(仅含载体)的诱导培养物中经过Western印迹检测不到rhGH。
按上述制备诱导的BOB132(表达stII-hGH)培养物并根据Koshland和Botstein(1980)的分析方法进行渗透压休克。该方法破裂大肠杆菌的外膜并将周质内容物释放进周围的培养基中。随后的离心分离可溶性周质成分(在上清中回收)与细胞质，不溶性周质和细胞相关成分(在沉淀中回收)。具体地说，含有st-IIhGH质粒的大肠杆菌菌株W3110在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中37℃下生长过夜。饱和的过夜培养物在25ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中稀释至A600下为0.03 O.D并在250ml摇瓶中37℃下培养。当培养物的O.D.达到大约0.4时，加入100mM IPTG至最终浓度为0.5mM以诱导重组蛋白质的表达。然后将诱导培养物在37℃下培养过夜(大约16小时)。当诱导的过夜培养物在A600下O.D.达到3.3时，在Eppendorf 5415C型微量离心机中4℃下以14,000rpm离心4 O.D.(1.2ml)5分钟。细胞沉淀经研磨和旋转重悬于冰冷却的20％蔗糖，10mM Tris-HCl pH8.0中达到大约10O.D.，加入EDTA pH8.0至最终浓度为17mM。重悬的细胞在冰上培养10分钟并按上述离心。所得的沉淀经研磨和旋转重悬于冰冷却的水中达到大约10 O.D.并在冰上培养10分钟。然后按上述离心重悬的细胞并经过SDS-PAGE分析所得的上清(可溶性周质部分)和细胞沉淀(不溶性周质和细胞相关成分)。
发现BOB132合成的大量rhGH是可溶的且位于周质中。周质rhGH蛋白质与纯化的垂体hGH标准品在大小上无区别表明stII信号序列在蛋白分泌期间被除去。
实施例3
rhGH的纯化和生物活性A.野生型rhGH的纯化为了大量纯化野生型rhGH，根据Hsiung等(1986)所述的制备方法对330ml的BOB132培养物(表达stII-hGH)进行诱导，培养过夜并进行渗透压休克。具体地说，将含有stII-hGH质粒的大肠杆菌菌株W3110在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃下生长过夜。饱和的过夜培养物在2×250ml(500ml总体积)含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中稀释至A600下为0.03 O.D.并在2L摇瓶中37℃下培养。当培养物的O.D.达到大约0.4时，加入100mM IPTG至最终浓度为0.5mM以诱导重组蛋白质的表达。然后将诱导培养物在37℃下培养过夜(大约16小时)。诱导的过夜培养物在A600下O.D.达到大约3.8，使用Sorval RC-5离心机和GSA转子4℃下以8,000rpm离心5分钟。合并细胞沉淀，经研磨重悬于冰冷却的20％蔗糖，10mMTris-HCl pH8.0中达到大约47 O.D.，加入EDTA pH8.0至最终浓度为大约25mM。重悬的细胞在冰上培养10分钟并在带有854转子的IEC Centra MP4R离心机中4℃下以8,500rpm离心7分钟。所得的沉淀经研磨和旋转重悬于冰冷却的水中达到大约47 O.D.并在冰上培养30分钟。然后按上述在IEC离心机中离心重悬的细胞并经过SDS-PAGE分析所得的上清(可溶性周质部分)和细胞沉淀(不溶性周质和细胞相关成分)。该凝胶同样表明所产生的rhGH是可溶的且位于周质中，与垂体hGH标准品在大小上无区别。
rhGH在根据Becker和Hsiung(1986)所述的两步方法中纯化。将来自渗透压休克的上清上样到在10mM Tris-HCl pH8.0中平衡的5ml PharmaciaHiTrap Q Sepharose柱上，并用15倍柱体积的50-250mM线型NaCl梯度洗脱结合的蛋白质。经过SDS-PAGE分析柱级分。以大约100-125mM的盐浓度洗脱的级分22-25富含hGH，合并这些级分，浓缩并进一步在Superdex 200HR 10/30大小分离柱上分离。来自Superdex柱的级分34-36(根据分子量标准的洗脱曲线代表分子量大约21-22kDA)含有大多数rhGH，合并且作为冷冻等分试样贮存于-80℃。以280nm下的吸光度测定和使用Bradford蛋白测定试剂盒(Bio-Rad实验室)测定的rhGH最终产量为大约2mg。以SDS-PAGE分析时非还原的垂体hGH比还原的垂体hGH以略小的表观分子量迁移。该分子量变化是正确的二硫键形成的指标。我们纯化的rhGH与垂体hGH在还原和非还原条件下共同迁移表明rhGH正确折叠且形成二硫键。下述数据表明rhGH的生物学活性与垂体hGH无区别。
B.垂体hGH和rhGH的生物测定结果亲本FDC-P1细胞系显示出对小鼠IL-3强烈的增殖应答，但对垂体hGH无应答。在没有IL-3时，大多数FDC-P1细胞死亡，产生不到0.2的吸光度值。相反，在细胞数和吸光度值方面的剂量依赖型增大证明用兔生长激素受体转化的FDC-P1细胞应答垂体hGH而增殖。在不同的实验中该效果的EC50(达到最大刺激的一半所需的蛋白质浓度)范围为0.75-1.2ng/ml垂体hGH(0.03-0.05nM)，与文献(Rowlinson等，1995)的报道相似。亲本FDC-P1细胞系与用兔生长激素受体转化的FDC-P1细胞之间的明显差异在于在没有IL-3或hGH时后一种细胞存活，产生更高的吸光度值(在零生长因子对照孔中依赖于测定和与MTS一起保温的时间一般为0.6-1.1)。兔生长激素受体转化子和分离的所有5个不依赖生长激素受体的细胞系的起始合并物表现出相同的效果。用第二组独立分离的兔生长激素受体转染子获得了相似的结果。Rowlinson等，(1995)观察到相似的效果，表明IL-3/GH的非依赖型存活是转化过程的后果。尽管生长激素受体细胞系的生长不需要IL-3或hGH，但它们仍然对IL-3和hGH显示出强烈的增殖应答。没有hGH时吸光度值更高的实际效果是减小了hGH应答的“窗口”(最大与最小吸光度值之间的差别)。该窗口的范围经常为零生长因子值的40-70％，与Rowlinson等，(1995)的报道相似。
垂体GH和我们制备的野生型rhGH在生物测定中具有相似的剂量反应曲线，在不同的实验中EC50范围为0.6-1.2ng/ml(表1)。
表1hGH和hGH半胱氨酸突变蛋白的生物活性
N/A，未应用1EC50值来自各个实验。显示当N＞5时的EC50范围。
实施例4构建hGH半胱氨酸突变蛋白半胱氨酸取代突变T135C构建如下。设计诱变型反向寡核苷酸BB28(5’CTGCTTGAAGATCTGCCCACACCG GGGGCTGCCATC’3)(SEQ.ID.NO.10)以便将在氨基酸残基135处的苏氨酸密码子ACT改变成编码半胱氨酸的密码子TGT并跨越邻近的Bgl II位点。在PCR中使用该寡核苷酸以及与ompA-GH融合基因连接区退火且不具诱变性的BB34(5’GTAGCGCAGGCCTTCCCAACC ATT’3)(SEQ.ID.NO.11)。PCR反应在50μl反应液中进行，它含有1 X PCR缓冲液(含有1.5mM MgCl2的Perkin-Elmer缓冲液)，4种核苷酸dA，dC，dG和dT的浓度各为200μM，各0.5μM的各种寡核苷酸引物，5pg pBBT112(上述)作模板，1.25单位的AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer)和0.125单位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)。反应在Robocycler Gradient 96热循环仪(Stratagene公司)中进行。使用的程序限定为95℃3分钟，接着进行25个循环的[95℃60秒；45℃或50℃或55℃75秒；72℃60秒]，接着在6℃保持。经琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应，表明3种退火温度均明显产生大约430bp的预期产物。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”45℃反应并用Bgl II和Pst I消化。凝胶纯化所得278bp Bgl II-Pst I片段，它包括推断的T135C突变，将它连接进用Bgl II和Pst I消化过的pBBT111，即携带stII-GH融合基因的pUC19衍生物(上述)并凝胶纯化。经过用Bgl II和Pst I消化开始筛选来自该连接的转化子，随后测序一个克隆以证实存在T135C突变且不存在经过PCR反应或经过合成寡核苷酸可能导入的任何其它突变。发现测序的克隆具有Bgl II-Pst I片段的正确序列。
使用上述用于T135C的方法构建取代突变S132C，该方法有下列区别使用诱变型反向寡核苷酸BB29(5’CTGCTTGAAGATCTGCCCAGTCCGGGGGCAGCCATCTTC’3)(SEQ.ID.NO.12)代替BB28且使用退火温度为50℃的PCR反应用于克隆。发现测序的两个克隆中的一个具有正确的序列。
使用类似的方案但采用不同的克隆策略构建了取代突变T148C。在PCR中使用诱变型正向寡核苷酸BB30(5＞GGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACTGCAACTCACACAAC＞3)(SEQ.ID.NO.13)和与GH编码序列最3’端退火且跨越其下游紧邻的Bam H1位点的非诱变性反向引物BB33(5＞CGCGGTACCCGGGATCCGATTAGAATCCACAGCT＞3)(SEQ.ID.NO.14)。除了使用的退火温度为46，51和56℃外按上述进行PCR。PCR后按上述进行凝胶分析，合并46和51℃反应物用于克隆。用Bam H1和Bgl II消化该反应物，凝胶纯化所得的188bp片段并克隆进已用Bam H1和Bgl II消化，用小牛碱性磷酸酶(Promega)按卖主方案处理的pBBT111中，并凝胶纯化。经过用Bam H1和BglII消化分析来自该连接的转化子以鉴定以正确方向克隆了188bp BamH1-BglII诱变性PCR片段的克隆由于Bam H1和Bgl II产生相匹配的末端，该克隆步骤无方向特异性。测试的6个克隆中有5个显示出正确的方向。测序了其中的一个且表明含有所需的T148C突变。已证实在该克隆中188bp Ba