专利名称：一种快速单核苷酸多态性的检测方法及试剂盒的制作方法SNPs是指在基因组水平上，特定核苷酸位置上存在两种或两种以上不同的碱基，其中任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%。SNPs已成为继限制性酶切片断长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP),短串联重复序列(Short TandemRepeat, STR)多态标记后的第三代分子遗传标记。因此，SNP的检测正成为广泛关注的焦点。目前，用于SNPs检测的方法大多以PCR技术为基础，并与荧光、质谱法、基因芯片或测序等方法结合。这些方法操作复杂、价格昂贵、检测时间长，因此不适合于基层医院使用。本发明利用PCR核酸扩增技术和核酸试纸条检测技术发明的一种操作简单、价格低廉的检测技术。因此，可广泛地应用于与单核苷酸多态性检测相关的领域。下面就几种现有SNP检测技术进行概述。I限制性酶切片断长度多态(RFLP)利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用不同的限制性内切酶作用于同一片断，并根据琼脂糖凝胶电泳的结果来判断SNPs位点的碱基类型。2 寡核苷酸连接分析(Oligos Ligation Assay, OLA)预先设计的两条寡核苷酸在与靶序列杂交后，连接酶可使其以共价连接，然后通过凝胶电泳等方法对连接产物进行检测，即可判断SNPs位点的碱基类型。3 基因芯片(Gene chip)通过在芯片上密集排列的已知序列的探针，与若干靶序列进行杂交后检测，从而达到检测SNPs位点碱基类型的目的。4 实时突光定量 PCR(Real-time Quantitive PCR)根据荧光共振的原理，利用荧光检测装置检测荧光变化，从而进行SNPs位点碱基类型的检测。5. DNA 测序法DNA测序能够准确、直接的反映序列的差异，但是该方法从样品的处理到给出结果至少需要3-4天，而且价格也比较昂贵。6.突光偏振检测技术(Fluorescence polarization)利用特异探针与扩增产物杂交，使探针的3’端在聚合酶的作用下连接上一个标有特定荧光素的ddNTP，然后根据检测到的荧光素种类和偏振光强度判定SNPs位点碱基类型。 7.杂交双探针荧光PCR技术在PCR反应体系中加入横跨突变位点的荧光标记探针，并通过熔解曲线(meltingcurve)分析而判定SNPs位点碱基类型。随着SNPs的发现以及一些SNPs数据库的建成，特定SNPs在特定群体的验证和频率分析以及SNPs与某些生理或病理状态关系的研究成为重点。但目前市场上的各种方法大多需要专门的分析仪器，不仅价格昂贵，而且操作复杂，专业性强，因此在应用上受到了一定的限制。
本发明是在专利申请200610003429. 1“核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途”专利的基础上，结合聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)而发明出一种新的快速SNPs检测方法-PCR-核酸试纸条快速检测SNPs技术。目的在于为人们提供一种操作简单，价格低廉和结果准确的检测已知SNPs位点或单碱基突变方法。本发明的首要目的在于提供一种快速单核苷酸多态性的检测方法。本发明的第二发明目的在于提供一种快速单核苷酸多态性的检测试剂盒。为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为本发明涉及一种快速单核苷酸多态性的检测方法，所述检测方法采用在同一反应体系中一步PCR反应和核酸检测试纸条对特异性扩增产物进行检测的方法；首先通过第一种PCR温度循环非特异性扩增含有SNPs位点的片段，然后通过AS-PCR特异性扩增含有单核酸多态性位点的碱基，最后通过核酸检测试纸条对特异性扩增产物进行检测。本发明的第一优选技术方案为在同一个反应中，包含不同作用的引物和探针。不同的引物和探针的作用分别为(I) 一对扩增包含SNPs位点的模板序列的不带任何标记的引物A，非特异性扩增靶模板以增加靶模板数量；引物A能对包含SNPs位点的模板序列进行特异性扩增，并且不带任何标记；(2)针对SNPs位点上的不同碱基类型进行特异性扩增的特异性引物B，当引物B与模板序列完全互补时，引物B才能延伸；(3)与引物B延伸产物进行特异性杂交的探针C，从而完成对SNPs位点碱基类型的检测。本发明的第二优选技术方案为所述特异性引物B上标记有抗原或半抗原，所述抗原或半抗原选自生物素、地高辛或荧光染料，所述荧光染料选自Cy3、Cy5,Tetramethylrhodamine> AlexaFluor> Rhodamine> Fam 或 FitC,优选生物素或地高辛。本发明的第三优选技术方案为所述探针C上标记有抗原或半抗原，所述抗原或半抗原选自生物素、地高辛或荧光染料，所述荧光染料选自Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine> AlexaFluor> Rhodamine> Fam 或 FitC,优选突光染料。本发明的第四优选技术方案为所述同一体系中PCR的条件为先在90 98°C条件下保温I 4分钟；然后在90 96°C条件下5 15秒，66 75°C条件下10 20秒，共30 50个循环；接着在90 96°C条件下10 20秒，40 50°C条件下15 25秒，共5 20个循环；最后在92 98 °C条件下保温I 4分钟。 本发明的第五优选技术方案为所述同一体系中PCR的条件为先在92 95°C条件下保温I. 5 2. 5分钟；然后在92 95°C条件下8 12秒，66 72°C条件下12 18秒，共35 45个循环；接着在92 95°C条件下12 18秒，45 50°C条件下18 22秒，共8 15个循环；最后在92 95°C条件下保温I. 5 3分钟；进一步优选先在95°C条件下保温2分钟；然后在94°C条件下10秒，72°C条件下15秒，共40个循环；接着在94°C条件下15秒，45°C条件下20秒，共10个循环；最后在95°C条件下保温2分钟。本发明的第六优选技术方案为由于引物B、探针C和引物A设计的退火温度不同，在第一个非特异扩增循环过程中，引物B和探针C并不参与反应；而完成非特异性扩增靶模板达到一定数量时，第二个循环开始时，低退火温度的引物B和探针C参与反应，达到特异性检测的结果。本发明的第七优选技术方案为引物A的退火温度为55°C 72°C，引物B和探针C的退火温度为35°C 50°C，引物A的退火温度优选65°C 72°C，引物B和探针C的退火温度优选40°C 45°C。本发明的第八优选技术方案为所述核酸检测试纸条上设置有与引物B/探针C杂交产物所标记的抗原或半抗原特异性结合的抗体形成的检测线。本发明的第九优选技术方案为所述同一体系中PCR的PCR扩增体系为模板2 4μ1;正向非特异性引物A :0. 025 O. 05 μ mo I ；反向非特异性引物A :0· I O. 2μπιο1 ;特异性引物B :O. I O. 2 μ mol ;特异性探针C :O. 025 O. 05 μ mol ;dNTP O. I O. 2mmol ；(NH4) 2SO4 5 IOmmol ；KCl 5 IOmmol ；pH 9. O 的 Tris-HCl 5 IOmmolTriton-100 O. 5% 1.0%;MgCl I. 25 2. SmmoI ；Taq DNA聚合酶 I 2单位；总体积为10 20微升。所述扩增体系优选为模板4μ1;正向非特异性引物A :0· 05 μ mol ;反向非特异性引物A :0· 2 μ mol ;特异性引物B :0. 2 μ mol ；特异性探针C :0. 05 μ mol ；dNTP 0. 2mmol ；(NH4) 2 SO4 10mmol ；KCl 10mmol ；pH 9. O 的 Tris-HCl 10mmolTriton-100 1.0%；MgCl 2. 5mmol ；Taq DNA聚合酶2单位；总体积为20微升。本发明的第十优选技术方案为根据SNPs位点上的不同碱基类型设计不同核苷酸序列的特异性引物B，每一个PCR扩增体系中仅含有一种核苷酸序列的特异性引物B。本发明还涉及该检测方法在检测单核苷酸突变中的应用。本发明还涉及一种快速单核苷酸多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包括(I)室温保存的核酸检测试纸条装置；(2) _20°C保存的本发明所述的PCR扩增体系(3) -20 V保存的阳性对照液；(4)_20°C保存的阴性对照液；(5)-20 0C 保存的 ddH20。其中，当扩增反应液为20人份时，阳性对照液为40ul，阴性对照液为40ul，ddH20为 140ul。其中，本发明中所述的阳性对照液含有可以使检测试纸条产生阳性反应的包含SNPs位点的模板序列，所述的阴性对照液为不含有使检测试纸条产生阳性反应的包含SNPs位点的模板序列的液体。只有当引物B延伸产物与探针C特异性的结合在一起时，才能在核酸检测试纸条的检测线上形成有色的条带；同时，如果当引物B没有延伸，那么就无法与探针C进行特异性的结合，也就无法在检测线上形成有色的条带。本发明还涉及本试剂盒在病原体已知耐药基因的检测、器官移植中供体和受体间的配对选择、法医研究中罪犯身份的鉴别或亲子鉴定中的应用。本发明还涉及该快速单核苷酸多态性的检测方法在病原体已知耐药基因的检测、器官移植中供体和受体间的配对选择、法医研究中罪犯身份的鉴别或亲子鉴定中的应用。下面对本发明的技术方案进行进一步的详细说明。本发明主要原理为先通过PCR扩增含SNPs位点的片段，然后针对SNPs的碱基类型进行等位基因特异性扩增(Allele specific Polymerase Chain Reaction, AS-PCR)；AS-PCR产物可与特异性探针进行杂交，杂交产物可最终被核酸试纸条检测到。PCR-核酸试纸条法检测SNPs的反应原理和步骤如图I所示。本发明检测SNPs的方法主要包括以下四个步骤I)通过PCR对包含SNPs位点的靶模板进行扩增。PCR反应的退火温度在66°C 72°C之间，循环数为35 40。在这步骤中，PCR扩增并不对SNPs位点的碱基类型进行区分，只为了富集靶序列以便参与步骤2中的AS-PCR。同时，应用于这一步骤中的扩增引物并不进行任何的标记，其Tm应该在66°C 72°C左右。2)针对SNPs位点的碱基类型进行AS-PCR。AS-PCR反应的退火温度在45°C -50°C之间，循环数为5-10个。通过控制AS-PCR的反应退火温度，使得只有当参与AS-PCR的引物与靶模板完全互补时，才能使得引物得以延伸。因此，可针对SNPs位点的不同碱基类型进行特异性扩增。设计引物时，可根据SNPs位点的碱基类型设计5’末端带生物 素(Biotin)标记的等位基因特异性引物，并将SNPs位点设计在该引物的3’末端。弓丨物的Tm在45°C 50°C左右，以避免其参与到步骤I中，从而提高反应的特异性。3) AS-PCR的扩增产物与特异性探针进行杂交。特异性探针的3’末端带异硫氰酸突光素(fluorescein isothiocyanate, FITC), Tm 在 50°C 60°C左右。探针与 AS-PCR 的扩增产物杂交后能形成同时带有Biotin和FITC标记的杂交复合物。4)利用核酸试纸条对杂交产物进行检测。检测时，同时带有Biotin和FITC标记的杂交复合物先与表面带亲和素标记的红色颗粒结合，形成带FITC标记的红色颗粒复合物。该红色颗粒复合物在缓冲液的作用下，通过毛细现象沿纤维膜向核酸试纸条的吸收端流动。当其遇到核酸试纸条检测线上的Anti-FITC时，由于FITC与Anti-FITC的相互作用可将有色颗粒复合物固定在检测线上，并形成肉眼可见的红色线条，此为阳性。但如果在AS-PCR中，等位基因特异性引物未得到延伸，那么该引物就无法与特异性探针进行杂交并形成同时带有Biotin和FITC标记的杂交复合物，也就无法在核酸试纸条的检测线上形成红色的线条，此为阴性。本发明的一种快速单核苷酸多态性的检测方法，采用在同一反应体系中一步PCR反应和核酸检测试纸条对特异性扩增产物进行检测；首先通过第一种PCR温度循环非特异性扩增含有SNPs位点的片段，然后通过AS-PCR特异性扩增含有单核酸多态性位点的碱基，最后通过核酸检测试纸条对特异性扩增产物进行检测。在同一个反应体系中，包含不同作用的引物和探针。针对同一 SNPs上存在的两种或两种以上不同的碱基分别设计与该位点核苷酸相对应的引物B的核苷酸序列，设置平行的PCR扩增体系，每一个PCR扩增体系中有一种引物B的核苷酸，在检测过程中将待测样品加入两个或以上的平行PCR体系进行扩增，反应完成后采用核酸试纸条进行检测，从而得到检测结果。本发明采用的核酸试纸条可采用专利申请号为200610109620. 4的全封闭核酸防污染检测装置，该检测装置具有全封闭检测、特异性强、操作简单快速、扩增后检测不需要任何仪器设备。该装置使核酸扩增检测和分析均在封闭状态完成，最大限度降低常规扩增法中交叉污染的危险。该试剂盒操作简单、时间短，同时也减低了检测成本，使检测结果更加快速、可靠。其装置中的试纸条的原理在申请人的另一项专利申请200610003429. I中的进行了叙述。专利申请200610003429. I公开了一种核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途。该专利申请公开了一种特异性核酸序列的检测方法，该方法将一种特异性抗体A吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被；将另一种特异性抗体-无色抗B抗体固定于膜上形成检测线；待测核酸进行扩增时，将所使用的探针或是引物用A抗原或B抗原标记，形成扩增物、探针、引物、抗原A、抗原B的复合物，将该复合物与吸附有色颗粒的抗体A结合，得到的该有色颗粒复合物在溶液中通过毛细血管现象眼纤维膜向上流动只抗体B检测条时，与线条上的抗体B结合，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条。该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序有样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上还设有检测线和质控线，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗A抗体包被,检测线上有抗B抗体包被,质控线上有抗A抗体,有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。其中，在本发明的核酸检测试纸条上设置有与引物B/探针C杂交产物所标记的抗原或半抗原特异性结合的抗体形成的检测线。本发明是以核酸检测试纸条为检测平台，从样品提取到给出结果，只需要2 3个小时。同时判读简单，又不需要任何特殊仪器，使得操作复杂性和检测成本大大降低，因此在一般的分子实验室和医院检验科完成检测。表I为本方法与基因芯片，基因测序等SNPs检测技术的比较表I


本发明涉及一种单核苷酸多态性(SNPs)检测方法，具体讲，涉及一种采用在同一反应体系中一步PCR反应和核酸检测试纸条对特异性扩增产物进行检测的方法；首先通过第一种PCR温度循环非特异性扩增含有SNPs位点的片段，然后通过AS-PCR特异性扩增含有单核酸多态性位点的碱基，最后通过核酸检测试纸条对特异性扩增产物进行检测。本方法也可用于检测单核苷酸突变。本方法敏感度高、特异性强、操作简单、时间短，成本低，使得检测结果更加快速、可靠，具有蛋白质与核酸诊断试剂各自的优点。本发明还涉及本试剂盒在病原体已知耐药基因的检测、器官移植中供体和受体间的配对选择、法医研究中罪犯身份的鉴别或亲子鉴定中的应用。