专利名称：一种治疗猪呼吸道综合症的卵黄抗体注射液的制备方法猪呼吸道疾病综合征(PRDC)以生长速度降低、饲料利用率降低、食欲减退、咳嗽、呼吸困难为特征的疾病，虽然总体死亡率不高，但可严重影响猪场的经济效益。临床上引起猪呼吸道综合症的主要病原有猪肺炎支原体、繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、2型圆环病毒(PCV-2)和猪流感病毒，以及继发感染的其它细菌性病原，如巴氏杆菌、链球菌和胸膜肺炎放线杆菌等病原。断奶后各个阶段的猪均可发病，即从断奶后2周开始，一直到育肥期都可能发生呼吸道疾病综合症。 PRRSV是一种免疫抑制性病毒，感染后可以产生病毒血症，除引起繁殖障碍外，尚可以引起全身淋巴系统，特别是肺脏巨噬细胞的破坏，导致严重的免疫抑制，从而促进了包括肺炎支原体、链球菌、胸膜肺炎放线杆菌在内的等多种病原体感染。最近几年的PCV-2与PRRSV也有显著的协同作用。肺炎支原体一方面可以破坏呼吸道的局部清除病原体的能力，使得细菌性病原体严重继发感染；另一方面，通过研究发现，肺炎支原体可以调制肺脏局部的免疫应答，使肺泡巨噬细胞的的功能发生改变，从而促进了 PRRSV的感染，延长了 PRRSV感染的时间，加重了 PRRSV造成的损失。最近的研究表明，肺炎支原体还可以促进PCV-2的感染。美国学者研究发现，在呼吸道疾病综合症(PRDC)的临床病例中，经常发现肺炎支原体与PCV-2混合感染，而不一定有PRRSV或流感病毒的存在。PCV-2的抗原经常发现于有肺炎支原体感染诱导增生的支气管周围淋巴组织区域。PCV-2/肺炎支原体的混合感染模型本身表明，PCV-2或肺炎支原体单独感染只能引起轻微的一过性呼吸道疾病和病变，但如果二者混合感染，可导致严重的与PRDC和PMWS —致的呼吸道疾病症状和病变。因为PRDC的发生既有感染的因素，又有营养、饲养管理以及猪舍环境的因素，因此猪场通常采用综合性措施加以控制，如疫苗免疫，药物预防以及加强饲养管理等。通过综合性的预防措施虽然可以起到一定的效果，但是由于PRRSV、PCV2等疾病的免疫抑制作用，通常在带毒猪场免疫效果并不理想，并且PRRSV对不同来源的毒株的保护力较低，在带毒猪场免疫PRRSV可能导致PRRSV的爆发，给猪场造成巨大的损失。肺炎支原体免疫可以减轻PRRSV的感染，预防PRDC ;但PRRSV感染又可干扰肺炎支原体的免疫。如果在肺炎支原体免疫前感染了 PRRSV或PCV2，则肺炎支原体的免疫效果明显降低。另外由于PRDC的发生是病毒/细菌以及支原体混合感染的结果，通常可以使用广谱抗生素对细菌性病原进行清除，如使用金霉素、阿莫西林和氟苯尼考等抗生素，这些药物通常可以控制大多数呼吸道细菌性病原体的感染。但抗生素的大量运用一方面将导致更多耐药菌株的出现，增加疾病防控成本，另一方面也给食品安全带来了隐患。目前，卵黄抗体已经广泛运用于鸡、鸭、鹅、犊牛、仔猪和羔羊等动物疾病的紧急治疗和预防中，如鸡传染性法氏囊、鸡新城疫、鸡白痢、鸭病毒性肝炎、小鹅瘟、猪轮状病毒、犬瘟热、犬细小病毒病、羔羊轮状病毒腹泻、仔猪轮状病毒腹泻等。卵黄抗体是一种高产、优质的多克隆抗体，制备简单，容易提取，可以高效特异的对病毒性/细菌性疾病进行治疗；而且鸡大规模工业化饲养成本低，经济方便。同时使用卵黄抗体进行疾病治疗可以减少抗生素的使用，减少耐药株的出现，从而降低疫病控制成本。因此，卵黄抗体在生物制品的开发和疾病的防治方面具有广阔的前景。且迄今为止，运用卵黄抗体治疗猪呼吸道综合症的研究尚未有报到。
本发明的目的是提供一种治疗猪呼吸综合症的卵黄抗体注射液的制备方法，用于防治猪呼吸道综合症，克服已有技术中的缺点，在降低防疫成本和耐药性菌株产生的前提下，有效的提高动物的生产性能和疫病防治效果，且不会对人产生食源性污染和药物残留。本发明的目的是通过以下技术方案来实现·一种治疗猪呼吸综合症的卵黄抗体注射液的制备方法，包括以下步骤I)分离当前流行的PRRSV、PCV-2和猪肺炎支原体，分别用MARC-145细胞培养PRRSV,用PK15细胞培养PCV-2和支原体培养基培养猪肺炎支原体，测定病毒和支原体滴度后制备成三联灭活疫苗。制备的疫苗中PRRSV的TCID5tl不低于108/ml，PCV-2的TCID5tl不低于10%1，猪肺炎支原体数量不低于IOltVml ；2)利用制备的PRRSV/PCV2/猪肺炎支原体三联灭活疫苗免疫非免疫产蛋母鸡，免疫程序如下与产蛋前30天首次免疫,免疫剂量为2ml/羽，首次免疫后2、4分别进行两次加强免疫，免疫剂量为3ml/羽。此后每隔2月全群免疫一次，免疫剂量为2ml/羽，以诱导母鸡持续性的产生抗PRRSV、PCV-2和猪肺炎支原体的抗体；3)第三次免疫后14天收集鸡蛋，运用75%乙醇消毒蛋壳，在无菌条件下收集卵黄，运用等量磷酸盐缓冲液(O. IM PBS,PH7. 2)后置组织匀浆器中，5000转/分匀浆I分钟，加入乳酸至PH为4. 0，2 8°C搅拌过夜，置-80°C冷冻后解冻，并重复冷冻一次，然后8000转/分离心10分钟，收集上清，按照I : I的比例加入饱和硫酸铵，2 8°C搅拌2消失，后2 8°C静置过夜，8000转/分离心10分钟收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸铵；4)运用微量中和实验测定PRRSV、PCV_2的中和抗体效价，运用ELISA测定猪肺炎支原体抗体效价；5)将效价测定好的卵黄抗体进行无菌检验，合格后无菌分装，使PRRSV、PCV-2和猪肺炎支原体抗体效价不低于I : 64。本发明的有益效果为本发明中制备的卵黄抗体注射液为免疫球蛋白制剂，能够特异性的中和PRRSV、PCV2，同时对猪肺炎支原体亦具有作用，可用于临床上由PRRSV、PCV-2和猪肺炎支原体混合感染导致的猪呼吸道综合症；使用本发明中制备的注射液不仅可以治愈易感染上述病原的猪，同时对同群未感染上述病原的猪使用可以使其获得被动免疫；临床实验表明，使用本发明制备的产品后可以显著提高猪群生产性能；本发明制备成本低，见效快，本制品无毒副作用，使用后无药物残留，生产使用过程中对人畜无危害，同时使用本发明中制备的产品不会导致耐药菌毒株的出现，对食品安全无潜在的危害，适宜大规模推广。O.2%的甲醛37°C灭活24小时。灭活检验合格后备用。2、灭活疫苗制备油相制备由注射用白油94体积份，加司本_80°C 6体积份，混合后，然后加硬脂酸铝(每100毫升混合液加入2克硬脂酸铝)，逐渐搅拌至透明为止，高压灭菌备用。水相制备取灭菌吐温-80°C 4体积份，加入灭活病毒液96体积份，充分振摇，使吐温-80°C完全溶解。乳化取油相I体积份放于乳化缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入水相I体积份，加完后再以10000r/min搅拌2 5分钟，在终止搅拌前加入I %硫柳汞水溶液，使其终浓度为O. 01%，得到制备卵黄抗体用灭活疫苗。3、疫苗免疫非免疫母鸡产蛋前30天首次免疫,免疫剂量为2ml/羽，首次免疫后2、4分别进行两次加强免疫，免疫剂量为3ml/羽。此后每隔2月全群免疫一次，免疫剂量为2ml/羽，以诱导母鸡持续性的产生抗PRRSV，PCV-2和猪肺炎支原体的抗体。实施例3卵黄抗体的制备和效价测定I、卵黄抗体的制备第三次免疫后14天收集鸡蛋，运用75%乙醇消毒蛋壳，在无菌条件下收集卵黄，运用等量磷酸盐缓冲液(O. IM PBS, PH7. 2)后置组织匀浆器中，5000转/分匀浆I分钟，力口入乳酸至PH为4. O, 2 8°C搅拌过夜，置-80°C冷冻后解冻，并重复冷冻一次，然后8000转/分离心10分钟，收集上清，按照I : I的比例加入饱和硫酸铵,2 8°C搅拌2消失，后2 8°C静置过夜，8000转/分离心10分钟收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸铵。2、PRRSV抗体的效价测定I)细胞制备取生长良好的MARK-145细胞，运用胰酶消化后按照I : 4的比例传代至96孔板中，每孔O. 1ml，加入至96孔板后轻微前后左右摇晃，混匀细胞使其能够均匀贴壁。2)体外中和实验将PRRSV病毒液进行稀释，稀释至2000TCID5Q/ml。取制备的卵黄抗体进行2倍倍比稀释，取21 21°等10个稀释度。每个稀释度取O. 4ml卵黄抗体稀释液加入等量的稀释病毒液，37°C水浴I小时使卵黄抗体与PRRSV病毒进行中和反应。 3)细胞接种以及中和效价测定中和反应完毕后，将96孔板中细胞培养液去除，力口入中和反应后的混合液，每孔O. lml，37°C吸附I小时，然后去除吸附混合液，加入细胞维持液继续培养。培养4天后观察细胞病变孔数并记录,然后按照Reed-Muench氏法计算中和抗体效价。3、将效价测定好的卵黄抗体进行无菌检验，合格后无菌分装，使PRRSV，PCV-2和猪肺炎支原体抗体效价不低于I : 64。实施例42010年11月河北某猪场40日龄断奶仔猪982头，出现呼吸道症状，主要表现为食欲减退、咳嗽、呼吸困难，喘气，呈腹氏呼吸，喜堆卧在一起，生长缓慢，消瘦，死亡率升高。少数猪出现拉稀，皮肤发红等症状，且该猪场常规检测发现有PRRSV和PCV-2的感染。此次出现呼吸道症状后使用本发明制备的卵黄抗体进行治疗(卵黄抗体治疗组493头猪)，同时设计对照组(395头)。对照组在饮水中加入复合维生素和黄芪多糖粉剂，同时在饲料中加入枝原净lOOppm、金霉素300ppm、阿莫西林400ppm进行饲料投药。对照组和卵黄抗体治疗组均加强饲养管理和消毒。经上述处理后两组猪群效果均有好转，呼吸症状逐渐消失，动物食欲逐渐增加。至育肥期时，卵黄抗体组淘汰率为I. 8%，对照组淘汰率为2. 6%，卵黄抗体治疗组效果优于对照组。本实验结果表明，本发明制备的卵黄抗体具有较好的疗效，能够提高仔猪存活率。
本发明涉及一种治疗猪呼吸综合症的卵黄抗体注射液的制备方法，包括以下步骤1)分离当前流行的PRRSV、PCV-2和猪肺炎支原体，分别用MARC-145细胞培养PRRSV，用PK15细胞培养PCV-2和支原体培养基培养猪肺炎支原体，测定病毒和支原体滴度后制备成三联灭活疫苗；2)利用制备的PRRSV/PCV2/猪肺炎支原体三联灭活疫苗免疫非免疫产蛋母鸡；3)在无菌条件下收集卵黄；4)运用微量中和实验测定PRRSV、PCV-2的中和抗体效价，运用ELISA测定猪肺炎支原体抗体效价；5)将效价测定好的卵黄抗体进行无菌检验，合格后无菌分装。本发明的有益效果卵黄抗体注射液能有针对性的对PRRSV、PCV2和猪肺炎支原体单独感染或混合感染病猪进行有效的治疗。