专利名称：一种用于预防和治疗动脉粥样硬化的药物组合物的制作方法动脉粥样硬化(AtherosclerosisAs)是心血管疾病的常见类型，随着人们生活水 平的提高和生活方式的改变，心血管疾病尤其是As所致的冠心病的发病率逐年上升。目 前，由As所致的心、脑血管疾病已经成为威胁人类健康和生命的最主要疾病之一。大量的 研究结果表明，As不仅是脂质沉积性疾病，也是炎症和免疫性疾病。炎症反应在As斑块的 形成和发展中起着重要的作用。As斑块的形成、破裂及继发的血栓形成是引起临床上急性 心血管事件(不稳定性心绞痛、中风、突发性猝死等)的主要病理基础(2002，Nature)。然 而，减少并稳定斑块的药物尚缺。因此，开发新的As治疗药物以及药物组合对于As临床患 者有着极为重要的意义(2008，Nature Medicine)。他汀类药物的作用机制是抑制胆固醇的生物合成，可以有效减少内源性胆固醇来 源。由于血液中高胆固醇浓度及其在动脉血管壁内膜沉积是引起As的最主要病因，因此， 他汀类药物已成为目前临床上治疗As的主流药物。但是，临床上他汀类药物长期大剂量应 用会带来严重的不良反应，如肝毒性、肌毒性等，限制了他汀类药物的临床应用。此外，他汀 类药物并不能影响外源性胆固醇的摄入，且他汀类药物对血脂正常的冠心病患者无效，因 此单纯使用他汀类药物并不能获得理想的治疗效果。有研究结果表明，他汀类药物强化治 疗2年后，仍然有20 %的病人仍然可能发生急性的心血管事件(2005，New Engl J Med)。 有鉴于此，近年来他汀类药物与其他相关药物联合治疗(Combination Pharmacotherapy) 已经成为As治疗领域的一个新的热点。目前主要有以下几类药物与他汀类药物联合使用(1)与升高HDL-C药物合用，如 烟酸类药物；(2)与降低LDL-C药物合用，如胆固醇吸收抑制剂(Ezetimibe); (3)与抗炎药 合用，如阿司匹林；(4)与降压药联用，如氨氯地平等。Pfizer和Merck等国际大制药公司 根据这些联合治疗策略开发出了多个联合制剂上市，临床疗效良好，但是尚无他汀类药物 与中药活性单体的联合用药。丹参是唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，性苦、微 寒，归心、肝经。作为传统中药，在临床方药中广泛用于祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等。 丹参酮II-A为丹参中主要的脂溶性单体成分。我们的前期研究结果提示(Tang et al., 2007，Vasc Pharmacol. ； Tang et al. , 2011，Eur J Pharmacol.)丹参酮 II-A 可以通 过以下机制抑制As的发生和发展(1)清除自由基，抑制脂质过氧化；(2)抗LDL氧化，降 低血清中oxLDL水平；(3)抑制单核细胞-内皮细胞的黏附；(4)抑制巨噬细胞泡沫化和胆 固醇聚集；(5)抑制巨噬细胞炎症因子的释放；(6)与胆固醇竞争血管壁内膜的沉积位点， 减少和清除胆固醇的沉积等。丹参酮II-A可以预防和治疗As效果，在高脂饲料喂饲的大 鼠、家兔及ApoE基因缺陷小鼠等动物模型试验中得到证实。到目前为止，尚无关于丹参酮 II-A用于稳定As斑块的报道，亦无丹参酮II-A联合用药的研究。中国专利“丹参酮II-A用于制备预防和治疗动脉粥样硬化的药物”(专利号 01130086. 8，
本发明的目的在于根据上述现有技术中的不足，提供一种用于预防和治疗动脉粥 样硬化的药物组合物。本发明通过以下技术方案实现上述目的一种用于预防和治疗动脉粥样硬化的药物组合物，包括丹参酮II-A与阿托伐他汀，其 中丹参酮II-A的结构式如式I，阿托伐他汀的结构式如式II 所述丹参酮II-A与阿托伐他汀的重量份数比为10:2 10。所述丹参酮II-A为从天然中药丹参中分离纯化得到的活性单体，阿托伐他汀为 商品来源化合物。其中丹参酮II-A的分离纯化的方法为取干燥丹参，用95%乙醇抽提3次，每次24 小时，抽提液减压浓缩后加入水，用三氯甲烷分4次萃取，萃取液减压浓缩，柱层析分离，娃 胶为100-200目，洗脱液为含1 %_10 %乙酸乙酯的石油醚/乙酸乙酯混合溶液，进行梯度 洗脱，得到丹参酮II-A活性单体。上述药物组合物除包括丹参酮II-A、阿托伐他汀外，还包括药学上可接受的辅助 剂，其中辅助剂为乳化剂、增溶剂、赋形剂或稳定剂中的一种或几种。所述药物组合物的剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂或乳剂。上述药物组合物的给药途径为口服，经皮、静脉或肌肉注射，剂量为10 20 mg/ kg/day。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果通过分析比较丹参酮II-A和他汀类药物治疗As作用机制，我们发现两者之间具有很
好的互补性，体现在(1)丹参酮II-A可以有效降低低密度脂蛋白(LDL)氧化，降低血清氧
化低密度脂蛋白(oxLDL)水平，他汀类药物对此没有影响；(2)他汀类药物降低血浆LDL-C，
升高HDL-C，丹参酮II-A对血脂无明显影响，但其作为新型植物固醇类药物，因结构与胆固
醇相似，可以竞争性抑制胆固醇在血管壁的沉积；(3)大量的体内和体外研究报道丹参酮II-A可以抑制炎症转录因子NF-K B进而发挥其强效抗炎作用，而他汀类的抗炎效应较弱； (4)他汀类药物长期大量应用会产生严重不良反应，尤其是肝肾毒性和肌肉毒性，而丹参酮 II-A被报道具有很好的肝肾功能保护作用；(5)丹参酮II-A在肾性高血压大鼠和自发性高 血压大鼠模型中有轻度降压作用，他汀类不具降压作用。鉴于以上分析，我们将丹参酮II-A 和他汀类药物阿托伐他汀联合使用，可以有效抑制As病症的发生和发展，并有望开发出具 有传统中医药特色和临床疗效良好的联合制剂药物。该种联合给药方式是基于As发病机 制和药物作用机理研究建立的合理联合给药方案，有助于降低单独使用高剂量的他汀引起 的临床风险。我们的实验结果表明，丹参酮II-A和他汀类药物阿托伐他汀联合使用，可以在低 剂量下达到高剂量的丹参酮II-A及阿托伐他汀单独给药的疗效，而且联用后协同促进作 用明显，显著降低脂质核心和斑块面积大小、降低巨噬细胞浸润、增加斑块内胶原含量、降 低NF- κ B活化情况，抑制动脉活性氧产生等。


图1.实施例3各组药物对ApoE基因敲除小鼠主动脉窦斑块面积的影响结果 分析图，其中，001 VS正常组，$ /X0. 05 VS模型组，$$ /XO. 01 vs模型组，$$$ /XO. 001 vs 模型组；
图2.实施例4各组药物对ApoE基因敲除小鼠全血管斑块面积的影响结果分析图，其 中 ***/χο. 001 vs 正常组；
图3.实施例5各组药物对ApoE基因敲除小鼠无名动脉斑块面积的影响结果分析图， 其中001 vs 正常组，$ Κ0. 05 vs 模型组，$$ P<Q. 01 vs 模型组，$$$ K0. 001
vs模型组；
图4.实施例6各组药物对ApoE基因敲除小鼠动脉斑块的巨噬细胞含量实验结果 分析图，其中### /XO. 001 vs正常组，* /X0. 05 vs模型组，# /XO. 01 vs模型组，*** /XO. 001 vs 模型组；
图5.实施例6各组药物对ApoE基因敲除小鼠动脉斑块内部胶原含量的影响结果分析 图，其中，# P<SL 01 vs模型组，Ρ<Λ. 001 vs模型组；
图6.实施例6各组药物对ApoE基因敲除小鼠动脉斑块内NF- κ B活化情况实验结果 分析图，其中* K0. 05 vs模型组，# K0. 01 vs模型组，Ρ<Λ. 001 vs模型组；
图7.实施例7各组药物对ApoE基因敲除小鼠动脉活性氧产生的协同抑制作用实验结 果分析图，其中### /XO. 001 vs正常组，* K0. 05 vs模型组，# K0. 01 vs模型组，*** /XO. 001 vs 模型组。

干燥丹参1 kg，用95%乙醇抽提3次(每次1000 ml)，每次M小时，抽提液减压浓缩至 500 ml，然后加入500 ml水，用1000 ml三氯甲烷分四次萃取，萃取液减压浓缩，柱层析分 离，硅胶为100-200目，洗脱液为含1 %-10 %乙酸乙酯的石油醚/乙酸乙酯混合溶液，进行 梯度洗脱。可得到纯度为98%的丹参酮II-A约1.8 g。
实施例2丹参酮II-A与阿托伐他汀联合用药对ApoE基因敲除小鼠血脂的影响 5周龄雄性ApoE敲除小鼠(ApoE+)购自北京大学医学部实验动物部(引种自美国
Jackson实验室，动物合格证号SCXK (京)2006-0008)。同品系同周龄C57BL/6J雄性小鼠 购自南方医科大学实验动物中心(5周龄，SPF级，动物合格证号SCXK (粤)2006-0015)。 实验动物购回后饲养于中山大学公共卫生学院实验中心SPF环境(温度25士0. 5度，湿度 60%-70%，光照12h/黑暗1池)，先适应性饲养1周，次周(6周)开始喂饲高脂饲料(基础饲 料+10%猪油+1.25%胆固醇)。实验分组如下(A)C57BL/6J组即正常对照组，给予等体 积0. 5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na) ； (B) ApoE+组即模型组(ApoE KO)，给予等体积0. 5% CMC-Na; (C)丹参酮II-A低剂量组(Tan 10)，灌胃给予10 mg/kg/day的丹参酮II-A，容量 为0. lml/10g ;(D)丹参酮II-A高剂量组(Tan 30)，灌胃给予30 mg/kg/day的丹参酮II-A， 容量为0. 1 ml/10g ； (E)阿托伐他汀钙低剂量组(Ato 3)，灌胃给予3 mg/kg/day的药物， 容量为0.1 ml/10g;(F)阿托伐他汀钙高剂量组(Ato 10)，灌胃给予10 mg/kg/day的药 物，容量为0.1 ml/10g;(G)联合给药I组(T/A 3)，灌胃给药丹参酮II-A 10 mg/kg/day+ 阿托伐他汀钙3 mg/kg/day。(H)联合给药II组(Τ/Α 10)，灌胃给药丹参酮II-A 10 mg/ kg/day+阿托伐他汀钙10 mg/kg/day。每日下午14 00按照上表分组和剂量连续灌胃16 周。血脂测定所用的试剂盒购买自北京中生北控生物技术有限公司，检测内容包括总胆固 醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)，实验结果见下表1。表

本发明公开了一种用于预防和治疗动脉粥样硬化的药物组合物，包括丹参酮II-A与阿托伐他汀。其中丹参酮II-A与阿托伐他汀的重量份数比优选为10:2~10。丹参酮II-A和他汀类药物阿托伐他汀联合使用，可以在较低剂量下达到高剂量的丹参酮II-A及阿托伐他汀单独给药的疗效，而且联合用药后协同作用明显，可以显著减少脂质核心和斑块面积、降低巨噬细胞浸润、增加斑块内胶原含量、降低NF-κB活化情况，抑制动脉斑块内活性氧产生等。本发明所公开的用于预防和治疗动脉粥样硬化的药物组合物具有广阔的应用前景。

公开日2011年7月20日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日