专利名称：糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA及其应用的制作方法冠状动脉粥样硬化性心脏病目前仍然是西方社会位居首位的死亡原因。内皮损伤是动脉粥样硬化进程的首要步骤[1’2]。而机体损伤的内皮单层可以通过骨髓来源的内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)分化为内皮细胞而再生。EPC通过提高血管再内皮化形成，限制了动脉粥样硬化的发生发展[3]，因此EPC功能损伤是动脉粥样硬化的始发主要环节之一 M。众所周知糖尿病能促进冠状动脉粥样硬化的发生和发展，而心血管并发症是糖尿病患者死亡的主要原因b]。现阶段，相关研究已发现糖尿病机体EPC数量下降和功能降低是加快糖尿病患者动脉粥样硬化进程的原因之一 [6]。针对糖尿病EPC的研究发现，糖尿病EPC功能损伤与糖尿病EPC表达的相关基因和蛋白的上调和下调有关[7_9]。但是，一方面高糖刺激下的EPC的基因和蛋白变化涉及细胞代谢、细胞循环和氧压反应等多个方面[7]；另一方面，EPC内皮修复功能的实现需通过多个途径的合作，包括 EPC “归巢”至血管生长活跃位置，粘附至活化或损伤的内皮细胞或细胞外基质，参与局部活化内皮细胞和/或分化成为成熟的内皮细胞，并整合至损伤的血管[1°]。因此，若仅通过改变糖尿病EPC上一种基因或蛋白表达来抑制其功能损伤可能存在一定的局限性。随着近年来对miRNA呈爆发式增长的研究，我们知道一种miRNA在细胞内靶基因可有上百种，miRNA调控的靶基因包括转录因子、信号蛋白、脚手架蛋白、代谢酶等，而这些分子在生物网络中，如基因调控网、细胞信号转导网、蛋白质相互作用网以及代谢网中都具有核心作用，因此miRNA通过转录后水平调控这些分子广泛参与了细胞内各种生物功能 [11_13]。由此可见，糖尿病EPC上可能有大量的基因受miRNA的调控。新近研究发现了糖尿病患者的血清中存在相关miRNA表达水平的降低[14]，但是针对糖尿病EPC功能损伤相关 miRNA的研究，尚未见相关报道。参考文献如下。1、Lerman A and Zeiher AM. Endothelial function :cardiac events. Circulation,2005,111 :363_368。2、Libby P, Ridker PM and Maseri A. Inflammation and atheroslerosis. Circulation,2002,105 :1135_1143。3、Ishida A, Ohya Y, Sakuda H, et al. Autologous peripheral blood mononuclear cell implantation for patients with peripheral arterial disease improves limb ischemia. Circ J. 2005,69 :1260-1265。4、Kosuge M, Kimura K, Kojima S, et al. Effects of glucose abnormalities on in—hospital outcome after coronary intervention for acute myocardialinfarction. Circ J. 2005,69 :375_379。5>Sodha NR,Clements RT,Boodhwani Μ,et al. Endostatin and angiostatin are increased in diabetic patients with coronary artery disease and associated with impaired coronary collateral formation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009, 296 :H428-434o6>Sambuceti G,MorbelIi S,Vanella L, et al. Diabetes impairs the vascular recruitment of normal stem cells by oxidant damage ；reversed by increases in PAMPK, Heme Oxygenase-I and Adiponectin. Stem Cells, 2009，27 :399_407。7、Balestrieri ML, Rienzo M, Felice F, et al. High glucose downregulates endothelial progenitor cell number via SIRTLBiochim Biophys Acta. 2008,1784 936-945。8、Di Stefano V, Cencioni C, Zaccagnini G, et al. p66ShcA modulates oxidative stress and survival of endothelial progenitor cells in response to high glucose. Cardiovasc Res. 2009，82 :421_429。9、Kuki S, Imanishi T, Kobayash i K, e t al. Hyperglycemia acceleratedendotheIial progenitor cell senescence via the activation of p38mitogen-activated protein kinase. Circ J. 2006, 70 :1076-1081。10、Real C, Caiado F, Dias S. Endothelial progenitors in vascular repair and angiogenesis :how many are needed what to do ？ Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 2008,8 :185-193。IKAguda BD, Kim Y, Piper-Hunter MG, et al. MicroRNA regulation of a cancer network :consequences of the feedback loops involving miR-17—92, E2F, and Myc. Proc Natl AcadSci U S A. 2008，105 :19678-19683。12、Xiao C, Rajewsky K. MicroRNA control in the immune system :basic principles. Cell. 2009，136 :26_36。13、0’ Hara SP, Mott JL, Splinter PL, et al. MicroRNAs :key modulators of posttranscriptional gene expression. Gastroenterology. 2009,136 :17_25。14、Zampetaki A, Drozdov I, Willeit P, et al. Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR—126 and other microRNAs in type 2diabetes. Circ Res,2010,107 :810_817。
本发明的目的在于提供一组糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA。本发明的第二个目的是提供糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA在改变内皮祖细胞血管生成能力中的应用。本发明的第三个目的是提供糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA在制备防治糖尿病动脉粥样硬化疾病药物中的应用。为实现以上目的，本发明公开以下技术方案一组糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的 microRNA，所述 microRNA 为 hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-U6 和4hsa_miR-130ao上述糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA在改变内皮祖细胞血管生成能力中的应用，所述改变是指下调内皮祖细胞上所述microRNA表达将导致内皮祖细胞克隆形成能力降低，内皮祖细胞凋亡水平增加，从而降低内皮祖细胞的血管生成能力；恢复内皮祖细胞上所述microRNA的表达将促进内皮祖细胞上血管生成能力。上述糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA在制备防治糖尿病动脉粥样硬化疾病药物中的应用。糖尿病动脉粥样硬化疾病主要指糖尿病引起的大动脉粥样硬化病，主要包括冠状动脉粥样硬化性心脏病。按照如下方法筛选出满足本发明目的的microRNA (1)体外收集年龄、性别匹配的糖尿病患者和非糖尿病患者外周血，磁珠分选EPC ； (2)应用microarray analysis技术， 体外检测糖尿病EPC miRNAs表达的差异，筛选出参与糖尿病EPC功能损伤的miRNAs ； (3) 用tagman探针荧光定量PCR验证，然后用数据库及计算机软件分析并筛选出miRNAs所对应的靶mRNA。(4)体外检测所筛选出的miRNAs对EPC功能的影响。hsa-miR-21、hsa_miR-27a、hsa_miR-27b、hsa-miR-126 和 hsa_miR-130a 在糖尿病患者的EPC中表达明显下调，EPC中该组microRNA表达不足将导致EPC克隆形成能力降低，EPC凋亡水平增加，从而降低EPC的血管生成能力。因此hsa-miR-21、hsa-miR-27a、 hsa-miR-27b,hsa-miR-126 和 hsa_miR-130a 是糖尿病 EPC 功能损伤相关的 microRNA，恢复糖尿病患者 EPC 上 hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-U6 和 hsa_miR-130a 的表达将促进其血管生成能力，从而预防和治疗糖尿病动脉粥样硬化的发生、发展。基于以上研究，本发明提出将 hsa-miR-21、hsa_miR-27a、hsa_miR-27b、hsa-miR-126 和 hSa-miR-130a用于制备预防、治疗糖尿病动脉粥样硬化疾病药物中的应用。本发明的优点在于通过体外收集年龄、性别匹配的糖尿病患者和非糖尿病患者外周血，经磁珠分选EPC，结合microarray analysis技术，体外检测EPCmiRNAs表达的差异，筛选出可能参与糖尿病EPC功能损伤的miRNAs，然后用tagman探针荧光定量PCR验证， 用数据库及计算机软件分析并预测筛选出miRNAs所对应的可能靶mRNA，并体外检测所筛选出的miRNAs对EPC功能的影响，最大程度筛选出糖尿病EPC功能损伤的miRNA，进一步完善糖尿病动脉粥样硬化的形成机制，并为糖尿病动脉粥样硬化的防治开辟新的治疗靶点和方法。图1为miRNA质控结果电泳图，其中，图1_1为1 % agrose胶电泳总RNA，图1_2 为Agilent 2100分析得到的完整的总RNA。图2为年龄、性别匹配的糖尿病患者和非糖尿病患者EPC基因芯片筛选Cy3/Cy5 信号图，其中图2-1为糖尿病患者Cy3，图2-2为糖尿病患者Cy5。图3为芯片分析结果，非糖尿病组(Value2)相比糖尿病组(valuel)变化超过10 倍以上，且值均大于5的miRNA，浅色部分为Q-PCR的进一步验证microrna。图4为taqman探针荧光定量PCR验证芯片结果图，与糖尿病组相比*卞< 0.01， *P < 0. 05。图 5 为 EPC 转染 anti-miR-21、anti_miR-27a、anti_miR-27b、anti-miR-126, anti-miR-130a 后，miR-21、miR_27a、miR_27b、miR-126、miR_130a 表达显著下调。图 6 为 EPC 转染 anti-miR-21、anti_miR-27a、anti_miR-27b、anti-miR-126, anti-miR-130a后对其克隆形成功能的影响。图 7 为 EPC 转染 anti-miR-21、anti_miR-27a、anti_miR-27b、anti-miR-126, anti-miR-130a后对其凋亡功能的影响。



本发明公开一组糖尿病内皮祖细胞功能损伤相关的microRNA及其在改变内皮祖细胞血管生成能力中的应用和在制备防治糖尿病动脉粥样硬化疾病药物中的应用，所述microRNA为hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、hsa-miR-126和hsa-miR-130a。本发明完善了糖尿病动脉粥样硬化的形成机制，并为糖尿病动脉粥样硬化的防治开辟了新的治疗靶点。