专利名称：小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法 痛风是嘌呤代谢紊乱或(和)尿酸排泄减少所引起的一组异质性疾病。临床上以高尿酸血症为主要特征，高尿酸血症是痛风的生化基础，而痛风必然伴有高尿酸血症。从本质上说，高尿酸血症与痛风之间并无严格界限。近年来研究痛风的发病机制及其药物治疗成为医学界的热点之一，目前国内外尚缺乏有关痛风的成熟动物模型，而构建高尿酸血症动物疾病模型则是痛风研究的前提。现存模型中还有很多不完善的地方，从而给痛风的研究带来了极大的不便。下面对一些有代表性的小鼠高尿酸血症动物模型做简要介绍。1.昆明种小鼠，雄性，体重20±2g。使用黄嘌呤600mg/kg和乙胺丁醇250mg/kg，次黄嘌呤600mg/kg和烟酸100mg/kg，ig给药连续5天，造成小鼠高尿酸血症模型。(金沈锐，郑军，刘绍唐.实验动物模型研究-小鼠高尿酸血症模型初探[J].成都中医药大学学报，1999，22(1)49～50.)2.昆明种小鼠，雌雄均可，体重20±2g，次黄嘌呤1000mg/kg，ip注射，造成小鼠高尿酸血症模型。(唐灿，杨奎.高尿酸血症动物模型初探[J].中药新药与临床药理，2000，11(5)292～294.)3.昆明种小鼠，雌雄各半，体重22±2g。使用尿酸150～1000mg/kg，ip注射，造成小鼠高尿酸血症模型。(陈光亮，孙秀霞，王钦茂等.小鼠高尿酸血症模型的研究[J].中国药理学通报，2001，17(3)350.)4.昆明种小鼠，雄性，体重28±2g。使用尿酸酶抑制剂氧嗪酸300mg/kg，ip注射，造成小鼠高尿酸血症模型。(Iris HH，Scoville JP，Davide J，etal.Substituted cyclic im ides as potencial anti-gout agents[J].LifeSciences，1990，46(26)1923～1927.)5.昆明种小鼠，雌雄各半。使用酵母膏以15～30g/kg/d灌胃，连续灌胃1～2wk，复制出小鼠高尿酸血症模型。(陈光亮，张清林，马晓芹等.酵母致小鼠高尿酸血症模型[J].中国药理学通报，2003，19(4)467.)6.通过采用首先破坏小鼠尿酸氧化酶基因，再用基因重组法，获得尿酸酶缺乏的突变小鼠，从而造成高尿酸血症模型小鼠。(Wu-X.Hyperuricemia and uratenephropahty in urate oxidase-deficient mice[J].Proc Natl Acad Sci U.S.A.1994，91(2)742.) 尿酸不能被人体利用或在体内分解，在正常人体液pH7.4的环境中呈尿酸钠形式，溶解度417μmol/L(7mg/dl)(尹潍.高尿酸血症和痛风[J].医师进修杂志，1998，21(11)573)，故尿酸浓度必须高于该值才能被沉淀于组织中。采用给予大剂量嘌呤物质，同时给予抑制尿酸排泄的药物，即通过增加体内尿酸的来路，并抑制尿酸排出体外，使血尿酸含量增加，造成小鼠的高尿酸血症模型。此种模型接近于人类高尿酸血症及痛风的产生机理，为研究痛风和高尿酸血症及评估治疗用药提供可行的研究方法。该模型必须结合嘌呤物质和抑制尿酸排泄的药物使用，如果单纯大剂量连续给予小鼠嘌呤物质，血尿酸以5天为高，且10天血尿酸反而下降。而且该模型所形成的高尿酸水平远低于结晶沉积的浓度。一次直接注射次黄嘌呤，也可以复制高尿酸血症动物模型，受试动物在1h血尿酸浓度达到631.5±72.99μmol/L(相当于10.5mg/dl)，2h即迅速下降到饱和浓度以下，维持时间短。而腹腔注射尿酸也仅有1000mg/kg的剂量在40min可使小鼠尿酸水平达到450μmol/L(相当于7.5mg/dl)左右，其余剂量在各点的尿酸值均不能达到尿酸沉积的饱和浓度，维持时间很短。这是由于哺乳动物体内存在尿酸酶，可以将体内尿酸进一步分解，排出体外，故选用尿酸酶抑制剂氧嗪酸抑制尿酸酶活性，从而抑制尿酸分解。氧嗪酸可极显著地提高小鼠血清尿酸水平，血尿酸值可达6.72±0.08mg/dl，造成小鼠高尿酸血症模型，其血清高尿酸水平能维持5h。(喻志峰，杨澄，仇熙.瑞香苷对高尿酸血症小鼠的影响[J].中国药科大学学报，2002，33(2)142～145)，该方法灵敏简便、重复性好，在国际上已普遍用此评价药物的抗高尿酸血症和痛风作用。(James J，Carroll，Holly Coburn，et al.Asimplified alkaline phosphotungstate assay for uric acid inserum[J].Clinical Chemistry，1997，17(3)158～160)，但氧嗪酸所致的高尿酸水平尚未超过7mg/dl，虽能维持5h，但是达不到尿酸盐沉积的水平，因此还不能形成痛风性关节炎。使用基因突变法复制动物模型，该方法使半数以上突变小鼠不能存活4周以上，且文献对此法也未有定论，更见此模型的难度。
1.发明目的本发明的目的在于提供一种更加符合临床的小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，并使该小鼠模型的高尿酸水平升高到饱和浓度并且能维持足够的时间。2.技术方案2.1动物小鼠。种属昆明种、ICR。体重16g以上。2.2造模药物名称嘌呤类次黄嘌呤、黄嘌呤。尿酸酶抑制剂Oxonic acid，potassium salt(OA)、allantoxanamide。给药途径灌胃、皮下注射、腹腔注射。
给药剂量嘌呤类100～1500mg·kg-1尿酸酶抑制剂10～1500mg·kg-1溶剂生理盐水、液体石蜡、CMC-Na、油、可溶性淀粉。
配制要求混悬剂的配制一定要浓度均匀，使用时要摇匀。
2.3小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，该方法是选取昆明种、ICR健康小鼠，雌性或雄性，体重18～35g，禁食、不禁食均可，于室温下，用灌胃、皮下注射或腹腔注射方式对小鼠同时给予嘌呤类和尿酸酶抑制剂，造模后可自由进食、饮水。
上述的嘌呤类为次黄嘌呤、黄嘌呤，其用量为100～1500mg·kg-1；上述的尿酸酶抑制剂为OA、allantoxanamide，其用量为10～1500mg·kg-1。
上述嘌呤类的最佳用量为500 mg·kg-1，尿酸酶抑制剂的最佳用量为50mg·kg-1。
3.有益效果在本实验中，我们使用尿酸酶抑制剂配合嘌呤类，1h即可获得稳定的小鼠高尿酸血症模型。动物的血尿酸水平可显著的提高，高于尿酸产生结晶的饱和浓度417μmol·L-1，该水平可维持7h以上。这与高尿酸血症的发生机制吻合，增加动物体内嘌呤类以增加生成尿酸的原料，同时使用尿酸酶抑制剂抑制对尿酸的分解，以此减少尿酸的去路，两者协同，从而明显提高血尿酸水平，且高尿酸水平维持时间明显延长。可见，嘌呤类和尿酸酶抑制剂配合使用，是复制出高尿酸血症模型的理想组合。为复制持续性高尿酸血症模型进而复制痛风模型提供了有价值的参考。

实施例1.小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选用昆明种小鼠，雄性，20g±2g，在室温下，用灌胃方式，灌次黄嘌呤1000mg·kg-1，用腹腔注射方式，注射OA 100mg·kg-1。
实施例2.小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选用昆明种小鼠，雄性，20g±2g，在室温下，用灌胃方式，灌次黄嘌呤1000mg·kg-1，用腹腔注射方式，注射OA 600mg·kg-1。
实施例3.小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下
选用昆明种小鼠，雄性，20g±2g，在室温下，用灌胃方式，灌次黄嘌呤1000mg·kg-1，用皮下注射方式，注射OA 100mg·kg-1。
实施例4.小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选用昆明种小鼠，雄性，20g±2g，在室温下，用灌胃方式，灌次黄嘌呤1000mg·kg-1，用皮下注射方式，注射OA 600mg·kg-1。
实施例5.小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取昆明小鼠，雄性，20g±2g，在室温下，用腹腔注射方式，注射次黄嘌呤1000mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 1000mg·kg-1。
实施例6.小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取昆明小鼠，雄性，20g±2g，在室温下，用腹腔注射方式，注射次黄嘌呤1000mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 400mg·kg-1。
实施例7.小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取昆明小鼠，雄性，20g±2g，在室温下，用腹腔注射方式，注射次黄嘌呤500mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 400mg·kg-1。
实施例8.小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取昆明小鼠，雄性，20g±2g，在室温下，用腹腔注射方式，注射次黄嘌呤500mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 100mg·kg-1。
实施例9.小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取昆明小鼠，雄性，20g±2g，在室温下，用腹腔注射方式，注射次黄嘌呤500mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 50mg·kg-1。
实施例10.小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取昆明小鼠，雄性，20g±2g，在室温下，用腹腔注射方式，注射次黄嘌呤250mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 50mg·kg-1。
实施例11.小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，其方法如下选取昆明种小鼠，雌雄各半，20g±2g，在室温下，用腹腔注射方式，注射次黄嘌呤500mg·kg-1；用皮下注射方式，注射OA 50mg·kg-1。
实施例12.小鼠急性高尿酸血症模型在抗痛风药研究中的运用。
1.实验材料1.1动物昆明种小鼠，雄性，20g±2g。由南京中医药大学实验动物中心提供，实验动物饲养许可证号SYXK(苏)2002-0002。
1.2药物Oxonic acid，potassium salt(OA)，sigma-Aldrich公司；次黄嘌呤(Hypoxanthine，HX)，天津市北洋化工厂；均用油作为溶剂，配制时先加少许油，放入研钵研匀后，在将剩余油加入。加味四妙方(简称全方)，4g生药/ml；加味四妙方有效部位群(简称A方)4g生药/ml；由南京中医药大学中药化学教研室提供。别嘌醇片100mg/片，配成2.75mg/ml的浓度，上海延安万象药业股份有限公司。尿酸试剂盒，为Sysmex公司产品。
1.3仪器日立7020全自动生化分析仪。
2.方法与结果2.1不同途径、不同剂量(OA)对小鼠血尿酸水平的影响 将40只小鼠随机分为5组，正常对照组、模型I组、模型II组、模型III组、模型IV组，每组8只。模型I组灌胃HX 1000 mg·kg-1+腹腔注射OA 100mg·kg-1，模型II组灌胃HX 1000mg·kg-1+腹腔注射OA 600mg·kg-1，模型III组灌胃HX 1000mg·kg-1+皮下注射OA100mg·kg-1，模型IV组灌胃HX 1000mg·kg-1+皮下注射OA 600mg·kg-1，分别于造模后2h、5h取血，离心取血清，测血尿酸值。结果见表1。
表1不同途径、不同剂量OA对小鼠血尿酸水平的影响(X±S)(n＝8)

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型I组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
结果显示，在造模后2h，模型IV组血尿酸值与正常对照组有显著性差异(P＜0.01)。模型I组、模型II组、模型III组与正常对照组血尿酸水平均无差异。说明在不改变次黄嘌呤用量和给药途径的前提下，通过皮下注射途径给予一定剂量OA，可升高小鼠血清尿酸水平，但维持时间较短。
2.2 HX与OA合用对小鼠血尿酸水平的影响 将64只小鼠随机分为8组，正常对照组、模型I组、模型II组、模型III组、模型IV组、模型V组、模型VI组、模型VIII组，每组6只。HX采用腹腔注射，0A采用皮下注射。剂量见表2。分别于造模后1h、3h取血，离心取血清，测血尿酸值。结果见表2。
表2 HX与OA合用对小鼠血尿酸的影响(X±S)(n＝6)

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型I组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
结果表明，在采用不同剂量造模1h、3h后，各组血尿酸水平均高于正常对照组，模型VII组在造模后1h、模型I组在造模后3h与对照组有一定的差异(P＜0.05)，其余各组在各点均与对照组有显著性差异(P＜0.01)；除了模型VII组，各组在造模后3h均与模型I组有显著性差异(P＜0.01)。上述结果表明只给予HX虽可升高小鼠血清尿酸水平，但维持时间较短，给药3h后血清尿酸水平已明显降低，因此不利于进行抗高尿酸血症药物的研究。而如果将HX和OA配合使用，则不仅可以升高小鼠的血尿酸水平，还可以维持3h以上。从表2来看，采用HX250mg·kg-1和OA 50mg·kg-1的剂量组即可获得较为稳定的小鼠高尿酸血症模型。但如维持OA剂量不变，将HX剂量增加一倍，则可使小鼠尿酸值显著提高，达到600μmol·L-1以上。因此，我们认为采用HX500mg·kg-1和OA 50mg·kg-1的剂量组是复制稳定的小鼠急性高尿酸血症模型的最佳剂量组合。
2.3观察加味四妙方有效部位群的降尿酸作用 将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性组、全方组、A方组等5组，每组8只，分别灌胃给药，空白组和模型组给予等体积生理盐水。连续三天。第三天给药后1h，除空白组外，给各组小鼠腹腔注射HX5mg/10g(0.2ml/10g)+皮下注射OA 0.5mg/10g(0.1ml/10g)。空白组腹腔和皮下给予等体积油。于造模后1h、3h，给小鼠取血0.3ml，离心，取血清，测血尿酸值。结果见表3。
表3加味四妙方有效部位群对小鼠血尿酸的影响(X±S)(n＝8)

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明，在造模后1h、3h后，模型组血尿酸水平显著高于正常对照组(P＜0.01)，造模1h尿酸值达到最高点，3h时血尿酸值仍远高于尿酸产生结晶的饱和浓度。阳性组及加味四妙方有效部位群组在两测试点处均有显著的降尿酸作用(P＜0.01)。提示虽然在造模后，动物血尿酸值可达到1000μmol·L-1以上，但该模型的血尿酸高度并非不可逆转，从实验结果来看，给予受试药物后，能明显看出药物对模型动物具有降尿酸的作用。表明该模型在药理实验过程中的可行性。
综上所述，选择适宜的造模药物，制定出恰当的给药剂量、给药时间、给药方式，复制出更接近于人类嘌呤代谢障碍所形成的小鼠高尿酸血症模型，将会使我们深入观察受试药物对模型动物肾脏尿酸排出的影响、对嘌呤代谢的作用环节以及对尿酸盐沉积于关节腔过程的影响成为可能，从而为抗痛风药物的筛选和作用机理的研究提供必要和可靠的动物模型。


本发明公开一种小鼠急性高尿酸血症模型的复制方法，该方法是选取昆明种、ICR健康小鼠，雌性或雄性，体重16g－35g，禁食或不禁食，于室温下，用罐胃，皮下注射或腹腔注射方式，对小鼠同时给予嘌呤类，即次黄嘌呤或黄嘌呤100～1500mg·kg