急性高尿酸血症树鼩模型的构建方法[0002]近年来随着人民生活水平的提高，高尿酸血症发病率逐年升高，且常与高血压、高脂血症及糖尿病等伴随出现。国内外文献报道,高尿酸血症与冠心病、高血压、糖尿病、脑卒中等明显相关，为其独立危险因子和重要的预后预测因子，所以痛风及高尿酸血症的研究正成为医药界的热点。无论是药物的筛选，还是致病机制的研究，都迫切需要一种公认的科学、合理的动物模型。[0003]现用于高尿酸血症动物模型造模的动物主要是3类，灵长类、啮齿类和禽类，最佳动物无疑是灵长类动物，由于其无论尿酸代谢途径还是其他特点都与人类相似，但因价格昂贵，较少用于高尿酸血症研究。禽类与人类的嘌呤核苷酸代谢途径相似，缺乏尿酸酶，尿酸是其嘌呤代谢的最终产物。Fayoum i品系鸡在出生后两周左右给高蛋白饲料，4~5个月内即可在关节处出现痛风结节。 选用鹌鹑复制高尿酸血症模型也获成功，并且不造成动物肾脏损伤，较为安全，但禽类属于鸟类，种属上与人类差距较大。而对于现多数使用的大鼠、小鼠高尿酸血症模型来说，一方面，大小鼠对药物敏感性低；另一方面，尽管与人类同属于哺乳动物，但分类地位相差较远，属于低等的啮齿类动物，解剖和生理与人相差甚远，其动物模型得到的数据参考性有限，因此建立和开发与人体尿酸代谢异常相似的动物模型，深入开展痛风和高尿酸血症动物模型的研究，仍然是当前高尿酸血症及痛风研究中急需加强的工作。[0004]此外，由于人体尿酸代谢的复杂性与实验动物种族差异性、动物年龄的选择、给药方法、造模时间及模型判定尚缺乏统一标准，同一造模剂，不同的给药途径、给药剂量及动物来源对高尿酸血症影响较大，现有文献资料对不同诱导剂及相同给药途径的用量也有不同，若盲目参考文献报道的用量，剂量过大，死亡率增高，如果剂量不足，成模率较低。因此，应摸索出合适的剂量选择区间，不同公司生产的试剂、药品含结晶水多少、以及药品放置时间，对剂量的选择均有影响，因此使用标准化试剂，通过药物量效关系实验摸索最佳造模剂量尤为重要，同时利用与人类遗传关系更接近的实验动物建立高尿酸血症动物模型更能反映人类尿酸代谢的本质。[0005]树斷I (Tupaia belangeri, tree shrews)在分类学上属哺乳纲,有胎盘类,是一个独立的目，称为攀駒目(Scandentia)，介于灵长目与食虫目之间。树駒具有体型小，易饲养和操作，管理方便，廉价经济，且其进化程度高，新陈代谢和大体解剖比犬、大小鼠等动物与人更为接近，解剖结构也更近似于人，因此其作为较理想的实验动物，已经被广泛地应用于医学与生物学的研究中。[0006]在本申请提出之前，尚未见有利用树駒建立急性高尿酸血症模型的报道。
[0007]鉴于现在对高尿酸血症新型实验动物模型开发的需求，本发明利用新型实验动物一树駒，提供了一种急性高尿酸血症树駒模型的构建方法。[0008]本发明技术方案如下:
[0009]急性高尿酸血症树駒模型的构建方法，包括如下步骤:
[0010]步骤(1):选取 体重为110~150g，年龄为I~3岁成年健康树駒，雌雄均可；
[0011]步骤(2):分别测定步骤(1)所述的树駒中雄性与雌性的空腹血清尿酸值，这是由于树駒作为一种新型实验动物，健康树駒空腹血清尿酸值需进行测定以确定其范围；
[0012]步骤(3):对步骤(1)所述的树駒进行常规性饲养，饲养于安静及光照节律如常的环境中，并对其施以用手抓放的预处理，以去除树駒应激反应对血液各项生化值的影响；
[0013]步骤⑷:对步骤⑶处理后的树駒腹腔注射给予氧嗪酸钾混悬液，所述氧嗪酸钾混悬液的用量按树斷I体重为40mg/kg~100mg/kg,即得到急性高尿酸血症树斷I模型。
[0014]所述的步骤(3)中常规性饲养采用蒸糕饲料饲喂。
[0015]所述的氧嗪酸钾混悬液是以1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为溶剂。
[0016]所述的氧嗪酸钾混悬液按照给药容积/树駒体重为10mL/kg配制，以达到每次每只树駒腹腔注射体积为l_2ml，便于动物较好地吸收混悬剂的配制，浓度要均匀，现配现，使用时要摇匀。给药2小时后树駒血清尿酸值均大大高于尿酸产生结晶的饱和浓度417 μ mo I/L以上，升高至601.45 ±77.80 μ mol/L,与给药前的动物血清尿酸值有显著性差异，且血清尿素氮和血清肌酐值与给予按体重计算10mL/kg体积的1% CMC-Na的阴性对照组无显著性差异，显示该模型的建立剂量区间40mg/kg~100mg/kg较为安全，不造成肝肾影响，易于获得稳定、可重复的急性高尿酸血症树駒模型。
[0017]本发明具有以下优点和应用前景:
[0018]本发明首次利用亲源关系更为接近人类的新型实验动物一树駒建立了急性高尿酸血症动物模型，该模型具有典型的疾病表征，数量指标具有统计学意义，同时血清尿素氮、血清肌酐值及组织病理学证实该造模剂量区间较为安全，不造成肝肾影响，是一种简单易行、可靠实用的技术，并且提供了一种更为反映人类高尿酸血症本质的模型。本发明对于开展相关疾病的研究意义重大。
[0019]首先，本发明树駒高尿酸血症的建立方法安全可靠，操作简单，有效、灵敏，简便、重复性好。40mg/kg剂量就能有效升高树關血清尿酸值,相对于较大鼠400mg/kg和小鼠250mg/kg的用药剂量，剂量相对较低，较为安全，对肝肾功能无影响，说明树駒的药物敏感性较大小鼠高，具有良好的应用前景；其次，通过建立树駒高尿酸血症，可用于筛选和研制抗痛风药物，对评价相关抗高尿酸药物对该病的药效及作用机理具有十分重要意义。



[0020]图1及图2为不同剂量的氧嗪酸钾+别嘌醇对树駒肝组织中XDH/X0 mRNA表达水平的影响电泳图，其中1-正常组；2-CMC-Na组；3_0A组；4_ALL0组；5_0A+ALL01组；6-0A+ALL02组；与正常组比较，OA组P < 0.05 ；
[0021]图3为氧嗪酸钾混悬液1000mg/kg剂量组动物肾脏病理切片图，图中出现肾淤血，肾曲管浊肿。
[0022]下面结合实施方式及附图对本发明作进一步的详细描述。
[0023]下述实施方式中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0024]下述实施方式中所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均为商业途径得到。
[0025]1、实验动物
[0026]中緬树駒滇西亚种，200只，本所设施内常规性饲养，体重为122.69 土 14.4g,1-3岁龄，其中雌性114只，雄性86只。实验前空腹血清尿酸值为雌性动物平均值为168.98±53.31umol/L，雄性动物平均值为185.81 ±50.44umol/L,以上空腹血清尿酸值数值的获得见实施例1正常树駒血清尿酸值测定所述方法得到。实验前树駒一直饲养于安静及光照节律如常的环境中，在实验前对树駒施以用手抓放的预处理，以去除树駒应激反应对血液各项生化值的影响。常规统一的蒸糕饲料饲喂。
[0027]2、各种溶液配制
[0028]I % CMC-Na的配制:称取3g CMC-Na (昆明诚悦科技公司生产)放入500mL的锥形瓶中，缓慢加入IOOmL煮沸的灭菌蒸馏水膨胀，再缓慢加IOOmL灭菌蒸馏水于电炉上煮沸溶解，最后加煮沸的灭菌蒸馏水至300mL溶解定容即可，常温保存，现配现用。
[0029]不同浓度氧嗪酸钾溶液、不同浓度的别嘌醇(缩写为ALL0)的配制，按10mL/kg体积，以达到每次每只动物腹腔注射体积控制在l_2mL左右，便于动物较好地吸收。 [0030]按照100mg/mL、10mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、0.5mg/mL 不同浓度分别进行氧嗪酸钾(Oxonic acid potassium salt, Sigma-Aldrich 公司产品，Lot#STBC64180,纯度^ 97% )配制，配制方法:电子天平准确称取氧嗪酸钾1500mg、150mg、120mg、60mg、30mg、
7.25mg于单独的15mL离心管内，均加入15mLl%羧甲基纤维素钠溶液溶液，用玻璃棒搅拌，配成100mg/mL、10mg/mL、8mg/mL、4mg/mL的氧嗪酸钾混悬溶液即可,现配现用。使用时分别按动物的公斤体重计算选择相应浓度混悬液计算所需浓度体积，如树駒重量为100g，注射剂量为100mg/kg，则选择相应浓度lOmg/mL混悬液ImL腹腔注射。
[0031]按照16mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL 和 0.4mg/mL 不同浓度分别进行别嘌醇(南京都莱生物有限公司产品，纯度> 98% )的配制，配制方法:电子天平准确称取别嘌醇240mg、120mg、60mg、45mg、30mg和6mg分别于单独的15mL离心管内，均加入
羧甲基纤维素钠溶液，用玻璃棒搅拌，配成16mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL和0.4mg/mL的别嘌醇混悬溶液即可，现配现用。使用时分别按动物的公斤体重计算选择相应浓度混悬液计算所需浓度体积，如树駒重量为100g，注射剂量为30mg/kg，则选择相应浓度3mg/mL混悬液ImL腹腔注射。
[0032]3、试剂盒及病理切片诊断
[0033]血清尿酸检测试剂盒:南京建成物工程研究所尿酸(UA)测定试剂盒。
[0034]血清尿素氮检测试剂盒:南京建成物工程研究所尿素氮检测试剂盒。
[0035]血清肌酐值检测试剂盒:南京建成物工程研究所尿素氮检测试剂盒。
[0036]肾脏病理切片取材:将动物一侧肾脏沿矢状面切开，经4%甲醛溶液固定，交由昆明金域医学检验所公司进行病理切片，出具病理诊断报告书。
[0037]树駒饲养笼具:苏州市冯氏实验动物设备有限公司生产。[0038]4、仪器设备
[0039]美国Bio-tck连续波长多功能酶标仪MQX200R，Sigma高速冷冻离心机，Sartoyius公司精密电子天平ME235S ;日本Tomy公司SS-325高压蒸气灭菌箱；德国葛莱娜Greiner70507196 孔酶标板。
[0040]下列实施例中的实验数据下采用均数土标准误(Mean土SD)表示，组间两两比较选用t-test等方法，应用SPSS13.0软件进行统计分析。P〈0.01时为极显著性差异，P〈0.05时为显著性差异，P>0.05为无显著性差异。
[0041]实施例1:正常树駒血清尿酸值测定
[0042]选取健康树駒200只，中緬 树駒滇西亚种，SCXK (滇)K2013-0001，SYXK (滇)K2013-0001，体重为122.69±14.4g，年龄2~3岁，其中雌性114只，雄性平均值86只。采空腹血，在2h之内分离血清(4000rpm，4°C，15min)，使用南京建成生物工程研究所尿酸(UA)检测试剂盒进行检测，检测方法按照试剂盒说明书进行。
[0043]结果表明，测得200只成年树駒血尿酸的给药前正常值平均值为175.76±53.14umol/L，其中雌性动物平均值为168.98±53.31umol/L，雄性动物平均值为185.81 ±50.44umol/L。
[0044]实施例2:0A致树駒急性高尿酸血症的有效性实验
[0045]挑选18只健康树駒，其中早10只，? 8只，体重120.6 ± 11.2g,随机分为3组，每组动物6只(η = 6)，3组分别为1000mg/kg剂量组、100mg/kg剂量组、I % CMC-Na对照组，腹腔给药，给药后Oh，2h、4h、12h、24h、36h静脉采血，于采血后2h内血液样本经过4000rpm，4°C,15min离心分离得到血清，随后按照试剂盒说明书的方法检测血清尿酸值、血清尿素氮和血清肌酐值。
[0046]结果表明，腹腔注射0A1000mg/kg及100mg/kg均可在2h明显升高树鼠句血尿酸血值，其中1000mg/kg剂量组血尿酸值由133.54±26.39 μ mol/L升高到453.01 ±96.94 μ mol/L,高尿酸浓度可持续升高到 4h 的 480.57 ±60.76 μ mol/L。100mg/kg剂量组在2h血尿酸值可由141.89±39ymol/L升高到431.24±18.36 μ mol/L，均高于尿酸产生结晶的饱和浓度417 μ mol/L以上，给药组与对照组相比差异有显著性差异，见表1。
[0047]表1:腹腔注射氧嗪酸钾不同时间点血清尿酸值，浓度单位:μ mol/L
[0048]