专利名称：混合植物蛋白鱼饲料及其制备方法和应用的制作方法全球对水产品的消费逐年増加，膳食结构发生改变。而全球海洋捕捞受限，水产品的供给以养殖水产品为主。中国是全球最大的水产养殖大国，水产品总产量占全球的35%，其中养殖水产品产量约占全球的70%。在水产品消费需求快速增长的同吋，中国的养殖水资源却呈下降趋势。而要满足水产品需求的增长，必然以人工养殖为主，从而更有效地对现有养殖水资源加以利用。人工养殖依赖于饲料，则加大了对水产饲料的质与量的需求。 水产饲料原料主要有动物蛋白原料、植物蛋白原料、淀粉类原料、油脂类原料及矿物质类原料等六大模块。保障饲料质量的关键在饲料配方中这六大模块都能得到保障，尤其是动物蛋白原料模块得到保障，且各模块之间的比例协调，将饲料质量建立在优质饲料原料的组合上，而不单纯关注饲料中营养指标是否达到饲料标准的要求，更加关注优质饲料原料的组合效果。动物蛋白质原料氨基酸平衡性好、可消化利用率高，具有良好的养殖效果，是决定水产配合饲料内在质量的核心因素，所以在配合饲料中要保持一定种类和数量的动物蛋白质原料。在不同动物蛋白原料中，从动物蛋白原料自身的营养价值和对鱼类的养殖效果综合评价，鱼粉是最好的动物蛋白质原料。鱼粉作为优质蛋白原料的质量优势，主要表现在氨基酸平衡性好、消化利用率高、油脂中含有丰富的高不饱和脂肪酸、含有丰富的微量元素和常量元素、对养殖动物适ロ性好且有一定的诱食作用、对养殖动物的健康有良好的维护作用、含有未知促生长因子等。然而，鱼粉属于资源性产品，其价格受自然资源、市场供求关系及资本炒作等影响经常出现大幅度波动，因而鱼粉的使用原则是“在饲料成本可接受的范围内最大限度地使用鱼粉”。在水产动物营养与饲料的基础研究、应用技术研究中，鱼粉的替代问题是永恒的课题。在实际饲料配制时，从蛋白质原料内在质量需要方面考虑用什么原料对鱼粉进行替代(天然植物蛋白来源最丰富也最廉价，但由于营养不够均衡且存在ー些抗营养因子，所以目前研究也只是部分替代)？不同养殖动物对鱼粉的刚性需求是多少(这个种类差异太大)以及可以用不同的替代原料替代多少比例的鱼粉(不同种类有不同替代比例，实际上目前的饲料配方中已基本上最大额度上使用各种蛋白和油脂等来替代鱼粉，只是未经生物发酵处理的这些原料替代额度有效)？替代鱼粉后会出现哪些质量问题及其如何避免？从价值体系角度考虑，不同原料对鱼粉的性价比如何计算？如何利用性价比确认对鱼粉的替代实际和替代比例？鱼粉是综合养殖效果最好的动物蛋白质原料，単一原料、単一方面的替代难以达到理想的效果，需采用多角度、不同方面、系统性的综合替代方案，针对以上这些问题进行长期的、多角度的研究和分析。植物蛋白质原料是水产饲料的主要原料，其使用量占配合饲料总量的50%左右。所以，植物蛋白质原料的质量是决定饲料质量的主要因素。豆柏在植物蛋白质原料中是品质最好的，但近期的研究发现，在鱼类饲料中过量使用豆柏对鱼肠道粘膜具有损伤作用，包括对肠道粘膜的结构性和功能性损伤；由于肠道与肝胰脏之间有生理性“肠-肝轴”的存在，当肠道过度损伤后，肠道的生理性和结构性屏障破坏，肠道的通透性显著增加，肠道产生细胞因子和炎症介质(如肿瘤坏死因子、白细胞介素)等显著增加并进入血液，肠道细菌和内毒素易位导致鱼类肝胰脏及其他器官组织损伤，影响到养殖效果。所以，豆柏在水产饲料中的使用量需控制，在有效使用量下豆柏具有良好的生长和防止效果。在上世纪90年代，中国使用的是高鱼粉、高豆柏的饲料方案，豆柏虽然在植物蛋白原料中是营养水平、营养素平衡方面最好的，但也是价格最高的。在使用棉柏、菜柏组合实现营养素互补的情况下，降低豆柏的使用量，增加棉柏、菜柏的使用量，腾出饲料配方成本空间，使用一定量的鱼粉，采用鱼粉+高棉柏高菜柏的饲料配方方案。 小肽也称寡肽、微肽、短肽，一般由2 3个氨基酸组成。蛋白质在消化道中的最终消化产物大部分是小肽而非游离氨基酸，小肽能完整地被吸收并以ニ、三肽形式进人液循环，它们在蛋白质营养中有着重要的作用。目前，已有部分小肽类化合物被应用于医药、化妆品、保健品、调味品、动物饲料添加剂等领域，而且其需求量也越来越大。为满足社会需求、降低产品成本，通过化学法生产小肽的研究日益增多目前，除了部分小肽本身有其医药、食品等功效外，其他小肽也可作为ー些药物的修饰结构，从而可以减小毒副作用，提高药物吸收和药效利用率虽然活性小肽具有多种生物活性，且高效、安全，但由于纯品功能性短肽的生产成本过高，无法广泛地应用到食品及医药领域。因此通过化学合成和生物转化等手段开发出新的、高效的产品路线已经势在必行。现有杂柏发酵技术所制备的植物蛋白饲料多采用单菌或两个菌种混合发酵处理杂柏，酶系比较单一，发酵速度慢，豆柏原料成本较高，发酵后受成本制約，并且，単一的菜柏和棉柏氨基酸不平衡，不利于推广应用。
本发明的目的之ー是提供一种由杂柏和多种微生物菌株混合发酵制成的植物蛋白鱼词料；本发明的目的之ニ是提供ー种制备所述植物蛋白鱼饲料的制备方法；本发明目的之三是将所述的植物蛋白鱼饲料应用于鱼类养殖。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的ー种混合植物蛋白鱼饲料，包括以下原料发酵制成菜柏和棉柏的混合物、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is)发酵液、粪肠球菌(E. faecal is)发酵液、黑曲霉(Aspergillus niger)发酵液、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵液和无机盐。为了达到更好的效果，按质量百分比计，各原料的用量优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵液 8% 12%、幾肠球菌(E. faecalis)发酵液 12% 18%、黑曲霉(Aspergillus niger)发酵液 8% 12%、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵液3% 7%、无机盐O. 1_1%，余量为菜柏和棉柏的混合物。更优选的，各原料的用量为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵液10%、粪肠球菌(E. faecalis)发酵液15%、黑曲霉(Aspergillus niger)发酵液10%、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵液5%、无机盐O. 2%,余量为菜柏和棉柏的混合物。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)能自身合成消化性酶类,如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等，在消化道中与内源酶共同发挥作用，提高饲料消化率；枯草芽孢杆菌能合成多种维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性；枯草芽孢杆菌能刺激动物免疫器官的生长发育，激活淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力。黑曲霉(Aspergillus niger)具有多种活性较强的酶系,如CX酶、淀粉酶、酸性蛋白酶等，可将原料中的纤维素等大分子化合物降解转化为动物易消化利用的养分，并为白地霉、酵母菌提供必需的糖、氨基酸等。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)含有丰富的蛋白质、B族维生素、氨基酸等物质，用作鱼类饲料的蛋白质补充物，它能促进鱼类的生长发育，缩短饲养期，井能增强鱼类的抗病能力。其中，所述的无机盐优选为磷酸ニ氢钾；所述菜柏和棉柏的混合物中菜柏和棉柏的质量比优选为4-6 4-6 ;更优选为5:5。本发明中所用到的枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、黑曲霉和酿酒酵母都可通过商业途径购买得到。本领域技术人员可按照菌种供应商所提供的培养基和培养条件(也按照各种文献中所公开的制备方法)，制备得到枯草芽孢杆菌发酵液、粪肠球菌发酵液、黑曲霉发酵液和酿酒酵母发酵液；例如，采用三级培养方法，即种子培养、ニ级液体扩大培养和液体发酵培养，制备得到相应的发酵液；其中，在液体发酵培养时，可以采用发酵罐发酵或采用摇瓶培养的方式进行发酵培养。三级培养所用到的培养基及其培养条件均已在文献中公开，作为參考，其中，所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任ー种或多种；所述的氮源包括但不限于硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任ー种或多种。本发明的另ー个目的是提供ー种制备所述混合植物蛋白鱼饲料的方法，包括以下步骤各原料混合均匀得到发酵物料；将发酵物料堆积发酵，即得。为了获得更好的发酵效果，所述发酵方法中，发酵物料的堆高优选为40-60cm，更优选为50cm ;将4种发酵液接种菜柏和棉柏的混合物后每6小时翻动一次；所述的发酵时间优选为48-82小时，更优选为72小时。现有杂柏发酵技术多采用单菌或两个菌种混合发酵处理单ー的柏类，酶系比较单一，发酵速度慢，豆柏原料成本较高，发酵后受成本制约，推广较难，而单一的菜柏和棉柏氨基酸不平衡，不利于推广，本发明用枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、黑曲霉、酿酒酵母四种菌混合发酵，酶系全面，发酵效率和转化高，抗杂菌能力強。将菜柏与豆柏混合后进行发酵处理，物料氨基酸更为平衡，原料成本也低于豆柏成本。本发明混合植物蛋白鱼饲料的小肽和游离氨基酸得率分别可达到15. 5%和O.94%，植酸、单宁和棉酚去除率分别能达到87%，78. 2%和100%。鱼饲喂试验结果表明，用本发明混合植物蛋白鱼饲料部分替代饲料中鱼粉或菜柏后，能够明显促进鱼的生长。 本发明混合植物蛋白能够作为鱼饲料中的蛋白原料，部分或全部替换鱼饲料中的动物蛋白饲料或植物蛋白饲料。
图I本发明混合植物蛋白鱼饲料的制备エ艺流程图。

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2、枯草芽孢杆菌购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，商业编号为1. 2180。预备实施例I枯草芽孢杆菌发酵液的制备I、种子培养将枯草芽孢杆菌菌种活化后，进行摇瓶种子培养；摇瓶种子培养培养基的组成(按质量百分比计)20% 土豆+2%蔗糖PDA培养基；培养条件150r/min，37°C摇床培养18小时。2、ニ级液体扩大培养液体发酵培养基3%玉米粉，2%氨基酸粉、O. 5%磷酸ニ氢钾、1%氯化钙、1%蔗糖；将上述液体培养基发酵罐中在位灭菌；液体扩大培养条件发酵温度为37°C，其通氧量可以是100_300L/h，起始pH 7. 0-7.5 ;转速150-200r/min ;罐压0. 6-0. 8Mpa，发酵培养24小时，一般有效活菌数达109CFU/ML 即可。3、液体发酵培养液体发酵培养基3%玉米粉，2%氨基酸粉、O. 5%磷酸ニ氢钾、1%氯化钙、1%蔗糖；将上述液体培养基发酵罐中在位灭菌；液体发酵条件发酵温度为37°C，其通氧量可以是100_300L/h，起始pH :7. 0-7. 5 ；转速150-200r/min ;罐压0. 6-0. 8Mpa，发酵培养24小时，一般有效活菌数达109CFU/ML即可。预备实施例2粪肠球菌发酵液的制备I、种子培养将粪肠球菌菌种活化后，进行摇瓶种子培养；摇瓶种子培养培养基的组成(按质量百分比计)培养基组成葡萄糖2%，蛋白胨I %，酵母膏O. 5% ;培养条件150r/min，32°C摇床培养18小时。
2、ニ级液体扩大培养液体发酵培养基3%豆柏粉、3%氨基酸粉、O. 5%磷酸氢ニ钾、2%氧化钙；将上述液体培养基发酵罐中在位灭菌；液体扩大培养条件发酵温度为32°C，其通氧量可以是50_100L/h，起始pH: 7.5-8. O ;转速150-200r/min ;罐压0. 1-0. 3Mpa，发酵培养24小时，一般有效活菌数达109CFU/ML 即可。3、液体发酵培养液体发酵培养基3%豆柏粉、3%氨基酸粉、O. 5%磷酸氢ニ钾、2%氧化钙；将上述液体培养基发酵罐中在位灭菌；液体发酵条件发酵温度为32°C，其通氧量可以是50_100L/h，起始pH :7. 5-8. O ；转速150-200r/min ;罐压0. 1-0. 3Mpa，发酵培养24小时，一般有效活菌数达109CFU/ML即可。预备实施例3黑曲霉发酵液的制备I、种子培养将黑曲霉菌种活化后，进行摇瓶种子培养；摇瓶种子培养培养基的组成(按质量百分比计)20% 土豆+2%蔗糖PDA培养基；培养条件150r/min，28°C摇床培养18小时。2、ニ级液体扩大培养液体发酵培养基10%马铃薯、O. 5%柠檬酸ニ铵、O. 2%氯化镁、2%蔗糖；将上述液体培养基发酵罐中在位灭菌；ニ级液体扩大条件发酵温度为28°C，其通氧量可以是100_300L/h，起始pH 7. 0-7. 5 ;转速150-200r/min ;罐压0. 6-0. 8Mpa，发酵培养 36 小时，一般镜检孢子浓度达到IO6个/ml以上即可。3、液体发酵培养液体发酵培养基10%马铃薯、O. 5%柠檬酸ニ铵、O. 2%氯化镁、2%蔗糖；将上述液体培养基发酵罐中在位灭菌；液体发酵条件发酵温度为28°C，其通氧量可以是100_300L/h，起始pH :7. 0-7. 5 ；转速150-200r/min ;罐压0. 6-0. 8Mpa，发酵培养36小时，一般镜检孢子浓度达到IO6个/ml以上即可。预备实施例4酿酒酵母发酵液的制备I、种子培养将酿酒酵母菌种活化后，进行摇瓶种子培养；摇瓶种子培养培养基的组成(按质量百分比计)20% 土豆+2%蔗糖PDA培养基；培养条件150r/min，32°C摇床培养18小时。2、ニ级液体扩大培养液体发酵培养基10%马铃薯、2%氨基酸粉、2%葡萄糖；将上述液体培养基发酵罐中在位灭菌；
ニ级液体扩大条件发酵温度为32°C，其通氧量可以是100_300L/h，起始pH
6.5-7. O ;转速150-200r/min ;罐压0. 6-0. 8Mpa，发酵培养36小时，一般有效活菌数达2X108CFU/ML 即可。3、液体发酵培养 液体发酵培养基10%马铃薯、2%氨基酸粉、2%葡萄糖；将上述液体培养基发酵罐中在位灭囷；液体发酵条件发酵温度为32°C，其通氧量可以是100_300L/h，起始pH :6. 5-7. O ；转速150-200r/min ;罐压0· 6-0. 8Mpa，发酵培养36小时，一般有效活菌数达2 X IO8CFU/ML即可。。实施例I混合植物蛋白鱼饲料的制备及检测(I)按以下重量称取各原料(単位Kg):枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵液100、粪肠球菌(E. faecalis)发酵液150、黑曲霉(Aspergillus niger)发酵液100、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵液50、无机盐2,菜柏和棉柏的混合物598 (菜柏棉柏=5 5)；( 2 )将4种发酵液接种菜柏和棉柏的混合物后，各原料混合均匀，将发酵物料堆积发酵，堆高为50cm ;接种后每6小时翻动一次；发酵72小时，将发酵产物干燥，即得。经检测，本实施例所制备混合植物蛋白鱼饲料产物的小肽得率为15. 5%，游离氨基酸得率为O. 94% ;植酸、单宁和棉酚的去除率分别为87%，78. 2%和100%。实施例2混合植物蛋白鱼饲料的制备及检测(I)按以下重量称取各原料(単位Kg):枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵液80、粪肠球菌(E. faecalis)发酵液120、黑曲霉(Aspergillus niger)发酵液80、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵液30、无机盐I,菜柏和棉柏的混合物689 (菜柏棉柏=4 6)；( 2 )将4种发酵液接种菜柏和棉柏的混合物后，各原料混合均匀，将发酵物料堆积发酵，堆高为40cm ;接种后每5小时翻动一次；发酵78小时，将发酵产物干燥，即得。经检测，本实施例所制备混合植物蛋白鱼饲料产物的小肽得率为14. 6%，游离氨基酸得率为O. 91% ;植酸、单宁和棉酚的去除率分别为86%，77. 8%和98%。实施例3混合植物蛋白鱼饲料的制备及检测(I)按以下重量称取各原料(単位Kg):枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵液120、粪肠球菌(E. faecalis)发酵液180、黑曲霉(Aspergillus niger)发酵液120、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵液70、无机盐5,菜柏和棉柏的混合物505 (菜柏棉柏=6 4)； ( 2 )将4种发酵液接种菜柏和棉柏的混合物后，各原料混合均匀，将发酵物料堆积发酵，堆高为60cm ;接种后每7小时翻动一次；发酵68小时，将发酵产物干燥，即得。经检测，本实施例所制备混合植物蛋白鱼饲料产物的小肽得率为14. 9%，游离氨基酸得率为O. 92% ;植酸、单宁和棉酚的去除率分别为86%，77. 5%和98%。实施例4混合植物蛋白鱼饲料的制备及检测(I)按以下重量称取各原料(単位Kg):枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵液80、粪肠球菌(E. faecalis)发酵液180、黑曲霉(Aspergillus niger)发酵液120、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵液30、无机盐2,菜柏和棉柏的混合物588 (菜柏棉柏=5 5)；( 2 )将4种发酵液接种菜柏和棉柏的混合物后，各原料混合均匀，将发酵物料堆积发酵，堆高为60cm ;接种后每8小时翻动一次；发酵80小时，将发酵产物干燥，即得。经检测，本实施例所制备混合植物蛋白鱼饲料产物的小肽得率为14. 1%，游离氨基酸得率为O. 86% ;植酸、单宁和棉酚的去除率分别为86. 3%，77. 1%和98. 3%。试验例I本发明混合植物蛋白鱼饲料饲喂草鱼试验I、供试饲料实施例1-4所制备的混合植物蛋白鱼饲料；2、试验方法以饲喂全菜柏组作为对照组；另设三组试验组试验I组以供试饲料30%代替菜柏，试验2组以供试饲料50%代替菜柏，试验3组以供试饲料80%代替菜柏；各组饲料配方见表I。饲料原料粉碎至80目后经双螺杆制粒机制成2. Omm颗粒饲料，密封保存。表I草鱼饲养日粮配方


本发明公开了混合植物蛋白鱼饲料及其制备方法和应用，包括以下原料发酵制成菜粕和棉粕的混合物、枯草芽孢杆菌发酵液、粪肠球菌发酵液、黑曲霉发酵液、酿酒酵母发酵液和无机盐。本发明用枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、黑曲霉、酿酒酵母四种菌混合发酵，酶系全面，发酵效率和转化高，抗杂菌能力强。将菜粕与豆粕混合后进行发酵处理，物料氨基酸更为平衡，原料成本也低于豆粕成本。本发明混合植物蛋白鱼饲料的小肽和游离氨基酸得率分别可达到15.5%和0.94%，植酸、单宁和棉酚去除率分别能达到87%，78.2%和100%。鱼饲喂试验结果表明，用本发明混合植物蛋白鱼饲料部分替代饲料中鱼粉或菜粕后，能够明显促进鱼的生长。