专利名称：一种nptⅱ基因检测用引物组、相应的试剂盒及其使用方法NPTII基因作为新霉素磷酸转移酶基因，广泛应用于转基因玉米、油菜等转基因农作物。为了加强对转基因产品的监督和管理，目前发展了多种转基因成分检测方法，从基于蛋白质的ELISA检测技术到基于核酸的聚合酶链式反应(PCR)技术以及快速发展的基因芯片技术。其中，PCR检测技术以其灵敏性、特异性、高效性而最为通用，这种技术通过检测基因产品中含有的外源核酸片段来鉴定，随着荧光实时定量聚合酶链式放映(real time PCR)的出现，不仅能够进行转基因产品的定性鉴定，而且可以对转基因成分进行定量。以PCR技术为代表的转基因产品检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通PCR技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作繁琐的缺点。而Real time PCR技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且，实时定量聚合酶链式反应PCR技术中，荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。基因芯片技术能够实现快速和高通量的检测， 然而价格昂贵，检测成本高。所以即使运用生物技术发展的最新成果对满足转基因产品检测要求的不断条具有重要意义。其中，等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是转基因产品检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)，具有很多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测转基因作物NPTII基因快速检测试剂盒。
本发明的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种可用于环介导等温扩增技术检测NPTII基因，且对所述NPTII基因具有较高特异性的检测用引物组。本发明的另一个目的在于提供一种检测成本低、检测速度快、使用方便，特异性高的基于环介导等温扩增技术的检测NPTII基因的试剂盒；同时，本发明还提供一种所述试剂盒的使用方法。本发明的目的可以通过以下技术措施实现一种NPTII基因检测用引物组所述引物组以NPTII基因为靶基因、基于环介导等温扩增技术设计，所述引物组由外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP组成，各引物的核苷酸序列分别为外引物F3(l)GCTGGATCGTTTCGCATGA外引物B3(l)GCAGTTCATTCAGGGCACC内引物FIP(I)GCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTTTTGAACAAGATGGATTGCACGC内引物BIP(I)GACAATCGGCTGCTCTGATGCCTTTTGGACAGGTCGGTCTTGACA或外引物F3Q)CTGTTCGCCAGGCTCAAG外引物B3Q)CGCCAAGCTCTTCAGCAATA内引物FIP (2)GAAAAGCGGCCATTTTCCACCATTTTGCGAGGATCTCGTCGTGA内引物BIP (2)GGATTCATCGACTGTGGCCGGTTTTGGTAGCCAACGCTATGTCC。本发明的NPTII基因检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的转基因农作物及其加工产品中NPTII基因序列，选取转基因农作物及其加工产品中NPTII 基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别转基因农作物及其加工产品中NPTII 基因的特异性引物组，通过LAMP来鉴定转基因农作物及其加工产品中的NPTII基因。本发明还提供一种检测NPTII基因的试剂盒，所述检测NPTII基因的试剂盒包括以NPTII基因为靶基因、基于环介导等温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物 F3/B3。作为本发明所述检测NPTII基因的试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物的核苷酸序列分别为外引物F3(l)GCTGGATCGTTTCGCATGA外引物B3(l)GCAGTTCATTCAGGGCACC内引物FIP(I)GCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTTTTGAACAAGATGGATTGCACGC内引物BIP(I)GACAATCGGCTGCTCTGATGCCTTTTGGACAGGTCGGTCTTGACA或外引物F3Q)CTGTTCGCCAGGCTCAAG外引物B3Q)CGCCAAGCTCTTCAGCAATA内引物FIP (2)GAAAAGCGGCCATTTTCCACCATTTTGCGAGGATCTCGTCGTGA内引物BIP (2)GGATTCATCGACTGTGGCCGGTTTTGGTAGCCAACGCTATGTCC。作为本发明所述检测NPTII基因的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括 BstDNA聚合酶、反应液、稳定液、显色液和阳性对照液。本发明所述检测NPTII基因的试剂盒的生产工艺为(1)将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；(2)将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；(3)将稳定液无菌分装，抽样质检；(4)将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；(5)组装试剂盒。作为本发明所述检测NPTII基因的试剂盒的更优选的实施方式，所述的反应液为每 IL 反应液含有 1. 6 2mmol dNTP、20 25mmol Tris-Cl、10 12. 5mmol 氯化钾、 10 12. 5mmol 硫酸铵、8 IOmmol 硫酸镁、1 1. 25ml TritonX-100,0. 8 Imol 甜菜碱、 内引物FIP/BIP各1. 6 2mol和外引物F3/B3各0. 2 0. 25mol ；所述的稳定液为石蜡油；所述的显色液为STOR Green I或Eva Green ；所述的阳性对照为NPTII基因DNA片段。作为本发明所述检测NPTII基因的试剂盒的最优选实施方式，所述的反应液为 每 IL 反应液中含有 2mmol dNTP、25mmol Tris-Cl、12. 5mmol 氯化钾、12. 5mmol 硫酸铵、 IOmmol 硫酸镁、1. 25ml TritonX-100、Imol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25moL·作为本发明所述检测NPTII基因的试剂盒的优选实施方式，所述检测NPTII基因的试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。作为本发明所述检测NPTII基因的试剂盒的更优选实施方式，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和BstDNA聚合酶的混合而成。环介导等温扩增技术(LAMP)是一种快速、灵敏、准确的核酸检测方式，其扩增效率较强，表现在两个方面(1)灵敏度比PCR高出的是数量级的差异；( 扩增产物的DNA数量，也比PCR产物高出太多，能够达到几个μ g，但过于灵敏和产物量的巨大，使得LAMP极易容易污染，尤其是在LAMP扩增反应后需要反应管开盖加入显色剂，容易出现气溶胶污染。 而气溶胶污染会使得检测结果假阳性率高，并且污染其他样品，污染检测区域，同时还难以去除。本发明的反应管通过隔板和稳定液的设计，有效地将显色液和工作液分隔开来，不仅能保证在储运过程中相对保持完整封闭性，而且无需打开管盖，就可以实现显色反应，大大降低气溶胶的污染。本发明还提供一种使用检测NPTII基因的试剂盒的方法，该方法包括以下步骤(1)制备待测样品DNA;(2)在反应管中加入反应液38 40体积％，BstDNA聚合酶0. 9 1. 8体积％，稳定液52 54. 5体积％，样品模板DNA4. 5 9体积％，恒温反应；(3)在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；所述步骤O)中的反应液含有以NPTII基因为靶基因、基于环介导等温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。作为本发明使用检测NPTII基因的试剂盒的方法的优选实施方式，所述步骤(2) 中，所述恒温反应的温度为63 65°C，反应时间为45 90min。本发明所述使用检测NPTII基因的试剂盒的方法中，所述步骤(1)制备待测样品 DNA为待测样品中DNA的提取和含量测定按国标GB/T 19495. 3-2004中的规定执行，对样品进行DNA提取时，要保证DNA的质量和浓度的稳定，以保证LAMP反应的可重复性，确保提取的DNA片段大于扩增片段；所述步骤O)中的体积％是指占四个组分总体积的体积百分比。本发明所述基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA,简称LAMP)快速检测NPTII基因的方法，是利用BstDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B;3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸酶乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 65°C )条件下45 90分钟内完成。 这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂盒仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简单、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。本发明与现有技术相比，具有以下有益效果1、本发明的检测NPTII基因的试剂盒，只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2、本发明所述检测NPTII基因的试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增既能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3、本发明的检测NPTII基因的试剂盒，扩增快速且高效，在不到一小时即可完成扩增，且产率高；4、本发明的检测NPTII基因的试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5、本发明的检测NPTII基因的试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定， 并且加入显色液后，阴阳性结构显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。外引物F3(l) :(SEQ ID NO 1)GCTGGATCGTTTCGCATGA外引物B3(l) :(SEQ ID NO 2)GCAGTTCATTCAGGGCACC内引物 FIP(I) (SEQ ID NO 3)GCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTTTTGAACAAGATGGATTGCACGC内引物 BIP(I) (SEQ ID NO 4)GACAATCGGCTGCTCTGATGCCTTTTGGACAGGTCGGTCTTGACA(2)购置DNA聚合酶=BstDNApolymerase (大片段)，置于容器；(3)配制反应液反应液的配方按照每IL溶液含有2mmoldNTP、25mmolTris-Cl、 12. 5mmol 氯化钾、12. 5mmol 硫酸铵、IOmmol 硫酸镁、1. 25ml TritonX-IOOUmol 甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0. 25mol配制，置于容器；(4)购置稳定液石蜡油，置于容器；(5)购置显色液Green I，置于容器；(6)提取阳性对照制备NPTII基因DNA片段，分别置于容器；(7)将上述5个容器装成试剂盒，封装。制备工艺简述如下1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；3、将稳定液分装，抽样质检；4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；5、组装试剂盒。实施例2检测NPTII基因的试剂盒的制备反应液按每IL 中含有 1. 6mmoldNTP、20mmol Tris-ClUOmmol 氯化钾、IOmmol 硫酸铵、8mmol硫酸镁、Iml TritonX-IOO,0. 8mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1. 6mol和外引物 F3/B3各0. 2mol配制，置于容器·显色液为 Eva Green。其他同实施例1。实施例3检测NPTII基因的试剂盒的制备其他条件与实施例1相同，其不同仅在于步骤(1)中的引物为外引物F3(2) (SEQ ID NO 5)CTGTTCGCCAGGCTCAAG外引物B3(2) (SEQ ID NO 6)CGCCAAGCTCTTCAGCAATA内引物 FIP O) (SEQ ID NO 7)GAAAAGCGGCCATTTTCCACCATTTTGCGAGGATCTCGTCGTGA内引物 BIP O) (SEQ ID NO 8)GGATTCATCGACTGTGGCCGGTTTTGGTAGCCAACGCTATGTCC。
实施例4检测NPTII基因的试剂盒的应用本实施例采用实施例1制备的检测NPTII基因试剂盒进行待测样品中NPTII基因的检测。1、样品处理(模板DNA提取)(1)将IOOmg经预处理的试样，在液氮中充分研磨成粉末后加入700 μ LCTAB提取缓冲液I中(不需研磨的试样直接加入)，振荡后混勻，65°C保温30min，其间不时轻缓颠倒混勻2-3次；(2)加入700 μ L三氯甲烷-异戊醇，轻缓颠倒混勻溶液2-3次，12000g离心5min 至分相；(3)将上清液转移至干净的离心管中，加入0.6倍体积的4°C预冷的异丙醇， 于 _20°C静置 5min，12000g 离心 5min ；(4)弃上清液，加入1000 μ L70%乙醇，轻轻转动离心管，4°C下8000g离心lmin，弃上清液后，再加入 20 μ L Rnase A 酶(10 μ g/ μ L)，37°C温浴 30min ；(5)加入600 μ L氯化钠溶液，65°C温浴lOmin，加入600 μ L三氯甲烷-Tris饱和酚，颠倒混勻后，12000g离心5min，转移上清液至1. 5ml离心管中；(6)加人0. 6倍体积的4°C预冷的异丙醇，于4°C静置30min，12000g离心lOmin， 弃去上清液；(7)加入1000 μ L 4°C预冷70%乙醇，轻轻转动离心管，4°C下12000g离心lOmin，
弃上清液；重复一次操作，室温下挥发液体；(8)沉淀干燥后，加入50yL TE缓冲液充分溶解DNA，-20°C保存备用。2、环介导等温扩增技术的反应过程(1)在200 μ L反应管配制反应体系反应液22 μ L，Bst DNA聚合酶0. 5 μ L (4U)， 模板 DNA2. 5 μ L ；(2)将配制好的反应管于64°C恒温反应lh。3、反应后处理向上述PCR反应产物中加入2 μ L SYBR Green I混勻，若反应管与对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管显现橙色则为阴性。实施例5采用反应管的检测NPTII基因试剂盒本实施例的检测NPTII基因试剂盒，采用的试剂盒引物与实施例3相同，试剂盒还包括反应管，反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板，其中空腔A内装有22. O μ L的LAMP反应液和0. 5 μ L的BstDNA 聚合酶，液体上层由石蜡封存；空腔B内装有2. Ομ L的LAMP反应显色液，液体上层也由石蜡封存，将该反应管-20°C保存。本实施例采用反应管作为容器，对NPTII基因进行LAMP检测，同时设有阳性对照组和阴性对照组，具体包括如下步骤取上述制备的反应管三支，采用移液枪分别加入阴性对照样品、待检测样品和阳性对照样品各2. 5 μ L，加样时枪头穿透保护液层，样品加至反应管A腔内，盖紧管盖并做好标记,移至反应区。将上述反应管均于65°C恒温反应Ih。
反应结束，将反应管倒置甩动1次，再正置甩动1次，使工作液与显色液充分混合均勻后观察。若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。在LAMP反应过程中，显色液与工作液密封状态好，没有发生互相泄露的情况，后期显色反应时，倒置甩动操作使得显色液和工作液混合，显色结果清晰。实施例6检测NPTII基因试剂盒的特异性验证本实施例采用实施例1和实施例3制备的检测NPTII基因的试剂盒进行试剂盒的特异性验证。采用实施例1和实施例3制备的检测NPTII基因的试剂盒，分别对大豆非转基因样品W794、大米非转基因样品W818、油菜非转基因样品W2194、油菜转基因样品W375、油菜籽转基因样品W574、玉米转基因样品W968及ddH20进行扩增，每个样品设置2个重复。反应体系为反应液22 μ L、BstDNA聚合酶0. 5yL、稳定液30yL和DNA模板 2. 5 μ L0反应程序金属浴中65°C，1小时。反应完毕后加入显色液2. 0 μ L，观察结果，如表1所示。表1试剂盒特异性检测结果


本发明公开一种NPTII基因检测用引物组，所述引物组由外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP组成，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO1～4或SEQ ID NO5～9所示。本发明所述引物组根据是否扩增就能判断靶标物质存在与否，具有高度特异性。本发明还公开一种检测NPTII基因的试剂盒，所述试剂盒包括以NPTII基因为靶基因、基于环介导等温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。所述试剂盒可以快速检测NPTII基因，只需一个恒定温度就能扩增，不需要特殊试剂或设备，检测成本低，而且灵敏度和特异性高。同时，本发明还公开了所述试剂盒的使用方法。