专利名称：具有多阶段生物活性剂递送的多糖凝胶制剂的制作方法具有多阶段生物活性剂递送的多糖凝胶制剂相关申请的交叉引用本申请要求2009年11月10日提交的美国专利申请序列第12/616，020号的权益和优先权，其为2008年11月21日提交的部分继续申请序列第12/276，167号，其要求2007年11月30日提交的美国临时专利申请第60/991，473号的权益，所述申请的公开内容以引用的方式并入本文。背景多糖是相对复杂的碳水化合物。它们是由通过糖苷键连接在一起的许多单糖构成的聚合物。因此多糖是大的、通常分支的大分子。多糖，尤其是透明质酸(HA)，已用于美容和医学应用中。这些聚合物已经用作例如软组织扩充(soft tissue augmentation)的填充物。多糖例如HA天然存在于身体的许多组织中，例如，但不限于，皮肤、软骨和玻璃体。因此，它非常适合于针对这些组织的生物医学应用。HA可用于眼外科手术(B卩，角膜移植、白内障外科手术、青光眼外科手术和修复视网膜脱离的外科手术)中。HA还用于治疗膝骨关节炎。将这些称为粘性补充法的治疗作为注射疗程向膝关节施用并且认为补充关节液的粘度，由此润滑关节、缓冲关节以及产生镇痛作用。还表明HA对软骨细胞具有积极的生化效应。最近建议口服使用HA，尽管它的效果还需证实。目前，一些初步的临床研究表明口服施用HA对骨关节炎具有积极效果。由于HA的高度生物相容性以及它通常存在于组织的胞外基质中，HA可在组织工程研究中用作生物材料支架。在一些癌症中，HA水平与恶性肿瘤和不良预后密切相关。因此HA经常用作前列腺癌和乳腺癌的肿瘤标记物。它还可用于检测疾病的进展。HA还可用于手术后诱导组织愈合，尤其是白内障外科手术后。目前伤口愈合的模式提出HA的较大聚合物出现于愈合的早期阶段为介导免疫反应的白细胞腾出物理空间。存在于胞外空间的HA发挥填充空间、稳定结构以及具有独特的物理延展性和良好生物相容性的细胞保护分子的作用。HA基质具有非常好的粘弹性同时保持高水平的水合。皮肤中的水含量和皮肤组织中的HA水平之间存在密切相关性。随着人皮肤老化，在HA含量和代谢作用中存在已知的改变。随着这些改变，皮肤的力学性能发生显著恶化。年轻的皮肤和细胞间基质中强HA网络的存在之间似乎有关联。非交联以及交联多糖链，例如HA，通过不同途径(例如酶、自由基)经受降解；因此限制聚合物在体内的寿命。因此，重要的是研发降低体内自然分解的速率和提高产物的持久性的方法和组合物。仍存在对通过抗降解而延长寿命的多糖制剂的需求，该需求未得到满足。此外，在本领域对多糖制剂很早就存在这样需求，在移植后延长的时期提供生物活性剂向外围组织的控释。这些生物学活性剂可用于治疗多糖制剂自身的一些副作用。本领域存在HA的许多公开，包括防止降解和递送HA制剂的方法，包括但不限于美国公开第 2009/0036403 号(cross-linked HAcompositions including polyethyleneglycol);美国公开第 2009/0030367 号(needle-free injection device for deliveringHA formulations);以及美国公开第 2009/0022808 号(coated HA particles for softtissue augmentation)。概述本文描述的是软组织扩充系统，一般地是具有延长的寿命、增加的降解时间和/或至少一种生物学活性剂在体内缓释的基于多糖的聚合物系统。一般地，所述系统包括在一个或多个阶段、水平、时间范围和/或侧面递送一种或多种生物学活性剂的能力。本文所述的软组织扩充系统包含多糖基质，所述多糖基质具有分散于其中的多糖粒子，其中所述基质和/或所述 粒子进一步包含至少一种生物学活性剂，并且其中所述基质和/或所述粒子控制至少一种生物学活性剂从所述基质和/或所述粒子中的释放并进入软组织。所述系统可以第一速率释放生物学活性剂，且所述粒子以第二速率释放生物学活性剂。在一个实施方案中，第一速率比第二速率快。在另一实施方案中，所述粒子包括不同粒子的群体，其中每个群体具有与其它粒子群体不同的释放速率。在又一实施方案中，所述基质和所述粒子释放相同的生物学活性剂或释放不同的生物学活性剂。在一些实施方案中，所述生物学活性剂选自酶抑制剂、麻醉剂、药用神经毒素、抗氧化剂、抗感染剂、抗炎剂、紫外(UV)光阻断剂、染料、激素、免疫抑制剂及其组合。在其它实施方案中，抑制剂为鞣酸或硫酸软骨素A (CSA)并且麻醉剂为利多卡因。在另一实施方案中，所述基质包含选自透明质酸(HA)、o-硫酸化HA、右旋糖酐、硫酸右旋糖酐、纤维素、硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素、藻酸盐、硫酸角蛋白、壳聚糖和纤维素的多糖。此外，所述基质可以是化学交联、物理交联或非交联的。在一个实施方案中，所述粒子包含与三聚磷酸酯物理交联并用藻酸盐包被的壳聚糖。在另一实施方案中，所述粒子包含与钙物理交联并用壳聚糖稳定的藻酸盐。在其它实施方案中，所述粒子的直径为约10 μ m至约100 μ m。本文进一步描述的是软组织扩充系统，所述软组织扩充系统包含分散于交联HA基质中的含CSA、藻酸盐包被的壳聚糖粒子，其中CSA的终浓度是约lmg/mL至约10mg/mL。本文更进一步描述的是软组织扩充系统，所述软组织扩充系统包含分散于交联HA基质中的含CSA、藻酸盐包被的壳聚糖粒子，其中CSA的终浓度是约lmg/mL至约10mg/mL，且其中HA基质进一步含有约lmg/mL至约10mg/mL的鞋酸。本文还描述的是软组织扩充系统，所述软组织扩充系统包含分散于交联HA基质中的含鞣酸、藻酸盐包被的壳聚糖粒子，其中鞣酸的终浓度是约0. lmg/mL至约2mg/mL。在一些实施方案中，所述软组织扩充系统进一步包含HA基质中的利多卡因。附图简述图I绘示性说明了使用比色测定包括硫酸软骨素A (CSA)的多糖凝胶的酶促降解的程度。图2绘示性说明了使用比色测定包括鞣酸(TA)的多糖凝胶的酶促降解的程度。图3绘示性说明了使用可溶性HA测定具有和不具有CSA的多糖凝胶的酶促降解程度。图4绘示性说明了使用可溶性HA测定具有和不具有TA的多糖凝胶的酶促降解程度。图5绘示性说明了 CSA对多糖凝胶的挤压力的影响。图6说明了荷载CSA的壳聚糖/藻酸盐粒子(左)与没有荷载的壳聚糖/藻酸盐粒子(右)的对比。图7 绘示性说明了从JU ν .ΟΕΗΜ 30 和JU^DERM 24HV 体外释放 CSA。图8绘示性说明了从.Rjν ΟΕΚΛ,Ι 30体外释放TA。图9绘示性说明了从壳聚糖/藻酸盐粒子体外释放TA。图10绘示性说明了随着时间的过去补充以儿jVt.DERM 30的CSA或TA粒子中HA降解的抑制。术语的定义本文所使用的“约”是指大约或近似且在本文所列的数值或范围的上下文中是指列举或要求保护的数值或范围的+/-10%。本文所使用的“载体”、“惰性载体”和“可接受的载体”可互换使用并且是指可与本公开的系统组合以提供所需组合物的载体。本领域的技术人员应了解已知许多载体用于制备特定治疗性药物和/或美容组合物。本文所使用的“美容的”是形容词，是指改善表面的外观或覆盖缺陷。通常，美容组合物可用于改善表面的美感而不是功能性方面。最常见地，配制美容组合物应用于健康和美容治疗或影响个人身体的外观，例如，角质表面例如皮肤、毛发、指甲等。本文所使用的“美容上可接受的载体”是指适合应用于角质表面或身体的其它区域的材料。一经应用，美容上可接受的载体对皮肤和其它角质表面大致上没有有害反应。例如，美容载体可采用脂肪或非脂肪乳膏剂、乳状悬浮液或油包乳或水包油类型、洗液、凝胶或胶冻剂、胶体或非胶体的水性或油性溶液、膏剂、气溶胶、可溶片剂或贴片的形式。本文所使用的“制剂”和“组合物”可互换使用并且是指为了给定的目的而提供到一起的组分的组合。此类术语是本领域的技术人员所熟知的。本文所使用的“分子量(Mw) ”是指分子中原子的原子量的总和。例如，甲烷(CH4)的分子量是16. 043g/mol,碳的原子量=12. Ollg/mol,氢=1. 008g/mol。道尔顿(Da)为质量的单位，等于12O质量的1/12，且I, 000，OOODa可表示为IMDa0发明详述本文描述的是具有延长的寿命、增加的降解时间和/或至少一种生物学活性剂在体内缓释的软组织扩充系统和组合物。可通过并入作为降解抑制剂而发挥作用的分子提供这种降解时间的增加。系统自身一般是基于多糖的。一般而言，系统包括在一个或多个阶段、水平、时间范围和/或侧面递送一种或多种生物学活性剂的能力。本文所述的软组织扩充系统包含多糖基质，所述多糖基质具有分散于其中的多糖粒子，其中所述基质和/或所述粒子进一步包含至少一种生物学活性剂，且其中所述基质和/或所述粒子控制至少一种生物试剂从所述基质和/或所述粒子中的释放并进入软组织。本文所述的软组织扩充系统一般涉及新的多种作用的聚合物系统，所述聚合物系 统提供软组织扩充(例如面部提升和除皱等)、抗各种体内降解途径(例如酶、自由基等)以及提供受控的药物递送(例如减轻注射疼痛、挫伤和出血等)。本文所述的系统的这些特征与目前市售的填充物不同，目前市售的填充物通常被它们的低降解抗性、淋巴切除的高易感性和注射期间及注射后前几周一般患者的不适感所限制。本公开的一个方面涉及包含至少一种多糖或多糖基质的软组织扩充系统。本文所使用的“多糖”是指多于两个单糖分子的聚合物，其单糖可以是相同的或不同的。构成本文所述的基质的多糖是化学交联、物理交联或非交联的。本文使用的多糖可以是，但不限于，HA、纤维素、壳聚糖、a-硫酸化HA、右旋糖酐、硫酸右旋糖酐、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白、肝素、硫酸肝素和藻酸盐。所述系统进一步包括可物理或化学交联并且分散于和/或包埋在聚合物基质内的多糖粒子.本文所述的多糖可使用已知适合于通过它们的羟基交联多糖及其衍生物的交联剂来交联。合适的交联剂包括但不限于，例如，1，4-丁二醇二缩水甘油醚(或1，4_双(2，3-环氧丙氧基)丁烷或1，4-双缩水甘油基氧基丁烷，所有这些通常称为BDDE)、1，2-双(2，3-环氧丙氧基)乙烯及1-(2，3_环氧丙基)-2，3_环氧基环己烷。不将多于一种交联剂或不同交联剂的使用排除在本公开的范围外。在一个实施方案中，交联剂包含BDDE或由BDDE组成。 —般地设计聚合物系统以提供体积校正、生物学活性剂或生物活性剂的控释，并且能够使多糖粒子保持在基质内。设计多糖粒子以提供结构、软组织的更持久的校正及活性剂的缓控释。因此，所述的系统在一些情况下可提供至少两个水平的生物学活性剂释放。释放的第一水平可来自聚合物网络自身。此释放通常来自陷入聚合物网络内的生物学活性剂。释放的第二水平可来自与聚合物网络有关的聚合物粒子。具有来自本文所述的聚合物系统的多水平释放的一个优点是更好地控制生物活性剂的释放时间。例如，新移植的材料经受免疫系统初始攻击激增，这可通过降解抑制剂和抗氧化剂的快速释放机制而有效避免。随着时间的过去，然而，移植材料经受缓和但持久的免疫攻击时，可通过缓释机制来更好地对抗。因此本文所述的系统包括经设计以提供聚合物粒子的快速初始释放的聚合物基质，所述聚合物粒子提供更持久的第二缓释。后者通过聚合物粒子的高度稳定性和缓慢生物降解特征来实现。在一个实施方案中，生物学活性剂例如酶抑制剂或降解抑制剂(例如硫酸软骨素、鞣酸等)与聚合物网络混合并且同样并入聚合物粒子或包被到聚合物粒子上。粒子内部和/或外部抑制剂的存在建立了确保系统长保存期限的扩散平衡。那么，一经移植，来自聚合物网络的生物活性剂的快速释放可提供初始保护使免受例如炎性反应。这种快速释放通过沿着粒子表面创建浓度梯度而激活了来自聚合物粒子的第二阶段的释放。随着聚合物粒子在体内降解，释放进一步扩展。较慢的第二阶段释放为聚合物网络提供了更长久的生物活性剂的供应。如果生物活性剂是降解抑制剂，由此组合物将确保持久的降解保护。在另一实施方案中，用抗氧化剂(例如抗坏血酸等)或药物分子(例如利多卡因、肾上腺素等)补充或替代酶抑制剂。在另一实施方案中，聚合物粒子由连接壳聚糖与三聚磷酸酯(TPP)的物理交联方法制备且进一步用藻酸盐包被。在又一实施方案中，聚合物粒子由连接藻酸盐与钙的物理交联方法制备且进一步用壳聚糖稳定。所得的粒子具有使它们包括于皮肤填充物组合物中的理想性质。例如，粒子是生物相容的/生物可降解的、柔韧的(例如便于挤压通过细针)、无有毒交联剂、质感光滑(例如用于增强生物相容性)、尺寸可调节(例如用于处理淋巴切除和迁移)、小的和较大活性分子(例如鞣酸、利多卡因、硫酸软骨素、肾上腺素等)的有效载体、在体内非常稳定具有良好的保持特征并且活性分子保持时间可调节(例如通过调整壳聚糖TPP :藻酸盐比例)。粒子自身可以是适合于并入本文所述的聚合物基质的尺寸且在本文所述的系统中有用。例如,粒子的直径为约Iym至约ΙΟΟΟμ 。在其它实施方案中，粒子的直径为约IOym至约100 μ m或约25 μ m至约75 μ m。并入系统的生物活性剂可选自抑制剂、麻醉剂、药用神经毒素、抗氧化剂、抗感染齐[J、抗炎剂、紫外(UV)光阻断剂、染料、激素、免疫抑制剂及其组合。在一个实施方案中，所述粒子或聚合物基质进一步包含至少一种抑制剂，例如降解抑制剂。抑制剂是通过靶向及中和特定降解机制例如酶促降解和自由基降解而起作用的分子。表现出抑制活性的分子包括但不限于糖胺聚糖(GAG)(例如肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸软骨素A(CSA)、a-硫酸化HA、亚麻苦苷和苦杏仁苷)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、褪黑激素、维生素C和维生素E)、蛋白质(例如血清透明质酸酶抑制剂)和脂肪酸(例如饱和的C1至C22脂肪酸)。·通常抑制剂的分子数量级小于交联的多糖聚合物。由于它们的小尺寸和较高扩散性，它们倾向于快速体内吸收，这可能潜在地限制了它们的性能。一种增加此类分子的体内局部半衰期的方法是将它们化学接枝到多糖聚合物网络并且将它们同时递送。这种方法的一个缺点是结合的分子比未结合的分子可表现出活性显著降低。在一个实施方案中，粒子或聚合物基质进一步包含至少一种麻醉剂。至少一种局部麻醉剂可选自氨布卡因、阿莫拉酮、阿米卡因、奥布卡因、苯佐卡因、贝托卡因、苯柳胺酯、布比卡因、布他卡因、氨苯丁酯、布坦卡因、丁胺卡因、丁托西卡因、卡铁卡因、氯普鲁卡因、高古柯喊、可卡因、环美卡因、二丁卡因、dimethysoquin、二甲卡因、地哌冬、dycyclonine、去水芽子碱、芽子碱、氯乙烷、依替卡因、优卡因、尤普罗辛、非那可明、formocaine、海克卡因、羟基丁卡因、对氨基苯甲酸异丁酯、甲磺酸亮氨卡因、左旋二苯哌啶二恶烷、利多卡因、马比佛卡因、美普卡因、美布卡因、氯甲烷、麦替卡因、纳依卡因、奥他卡因、俄妥卡因、奥昔卡因、对乙氧卡因、非那卡因、苯酚、皮珀罗卡因、匹多卡因、聚多卡醇、普莫卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、丙泮卡因、丙美卡因、丙哌卡因、丙氧卡因、伪可卡因、批咯卡因、罗哌卡因、水杨醇、丁卡因、托利卡因、三甲卡因、佐拉敏及其盐。在一个实施方案中，至少一种麻醉剂是利多卡因，例如以盐酸利多卡因的形式。本文所述的系统和组合物可具有约0. 1%至约5%(按组合物重量计)利多卡因浓度，例如约0. 2%至约I. 0%(按组合物重量计)。在一个实施方案中，组合物具有约0.3%的利多卡因浓度，按组合物的重量计(w/w%)。本文所述的组合物中利多卡因的浓度可以是治疗有效的，意指所述浓度足以提供治疗益处而没有对患者造成伤害。生物学活性剂的其它实例包括但不限于，止痒剂、消脂剂、抗疤痕形成剂和消炎齐U。止痒剂可包括甲基磺酰甲烷、碳酸氢钠、炉甘石、尿囊素、高岭土、薄荷、茶树油及其组合。消脂剂可包括毛喉素、黄嘌呤化合物，例如但不限于，咖啡因、茶碱、可可碱及氨茶碱及其组合。抗疤痕形成剂可包括IFN-y、氟尿嘧啶、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、甲基化的聚乙二醇、聚乳酸、聚乙二醇及其组合。抗炎剂可包括地塞米松、泼尼松龙、皮质酮、布地奈德、雌激素、柳氮磺吡啶、美沙拉秦及其组合。在一个实施方案中，系统包括鞣酸酶抑制剂或硫酸软骨素A(CSA)酶抑制剂和利多卡因。利多卡因或替代性麻醉剂可用于给定的制剂以缓解一些或大致上所有与粘性皮肤填充物的注射有关的疼痛。麻醉剂的缓慢释放可用于使来自注射的制剂的残留疼痛得到缓解。生物学活性剂可存在于粒子或基质或两者中，以约O. 0001%至约99%(按重量计)、约O. 001%至约75%(按重量计)、约O. 01%至约60%(按重量计)、约1%至约50%(按重量计)、约1%至约40% (按重量计)、约1%至约30% (按重量计)、约1%至约20% (按重量计)、约10%至约20% (按重量计)、约20%至约30% (按重量计)、0· 0001%至约O. 01%(按重量计)、约O. 0001%至约O. 1%(按重量计)、约O. 0001%至约1%(按重量计)、约O. 001%至约1%(按重量计)、约O. 01%至约1%(按重量计)或约1%至约10%(按重量计)浓度范围。在其它实施方案中，存在于粒子或基质或两者中的生物学活性剂的浓度范围是约O. 001mg/mL 至约 100mg/mL、约 O. 01mg/mL 至约 10mg/mL、约 lmg/mL 至约 10mg/mL、约 2mg/mL至约 5mg/mL 或约 O. lmg/mL 至约 2mg/mL。 在一个实施方案中，所述系统以不同的速率释放一种或多种生物活性剂。例如，所述基质以第一速率释放生物学活性剂且粒子以第二速率释放生物学活性剂。在一个实例性实施方案中，第一速率比第二速率快。在另一实施方案中，所述粒子包含不同粒子的群体，其中每个群体具有与其它粒子群体不同的释放速率。例如，不同尺寸或形状的粒子可具有不同的释放速率。在一些实施方案中，聚合物基质和相关的粒子释放相同的生物学活性剂。在其它实施方案中，基质和粒子中的生物学活性剂不同。本公开的另一方面涉及制备多糖制剂的方法，所述多糖制剂具有提供递送至少一种水平的生物活性剂的能力。这些方法提供多糖且使生物活性剂与多糖相关。非交联以及交联多糖链通过不同的途径(例如酶、自由基)经受降解，这经常限制聚合物在体内的寿命。因此，重要的是开发降低这种自然分解过程的速率和增加产品在组织中的持久性的方法。用于实现聚合物(例如多糖)持久性增加的一种方法是将生物学活性剂(例如抑制剂分子)封装到多糖聚合物基质自身内或进入基质内相关的粒子，这可以使抑制剂能够局部释放(注射部位)、缓释及控释。这还可允许避免自然降解机制。本封装方法为多糖聚合物基质在数周期间内提供了生物学活性剂(例如降解抑制剂)的恒定供应。在其它实施方案中，在数月期间内提供生物活性剂的恒定供应。一种封装方法是通过吸附或通过封装过程将生物活性剂合并到多糖聚合物基质内。在后一种情况下，允许生物活性剂在高度水合状态下与多糖基质混合，接着是基质脱水以控制释放动力学(例如聚合物的终溶胀比)。高度水合状态对应于少于约20mg/mL的HA浓度。本公开的另一方面涉及多糖制剂，所述多糖制剂包含多糖基质和分散于基质内的多糖粒子以及至少一种生物活性剂，且进一步包含生物相容的或生物可降解的载体(vessel)，其中所述抑制剂在载体内或为载体的一部分。此类载体可由非共价或共价连接的自组装分子例如脂质体、胶束和聚合的囊泡构成。脂质体是由一种或多种双层膜构成的囊泡，所述双层膜由具有混合脂链的天然衍生的磷脂(例如卵磷脂酰乙醇胺)或纯的表面活性组分如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。脂质体，通常但并非定义，含有水溶液的核心；不含有水性材料的脂质结构称为胶束。胶束是分散于液体胶质中的表面活性剂分子的聚集物。水溶液中典型的胶束形成聚集物，其具有与周围溶剂接触的亲水性的“头部”区域，在胶束中心封存着疏水性的巢穴区域。这种类型的胶束称为正常相胶束(水包油型胶束)。反胶束在中心具有头基，而尾部伸出(油包水型胶束)。胶束的形状通常为近似球形，然而，其它形式包括的形状例如椭圆体、圆柱体，且双层形状也是可能的。胶束的形状和尺寸是其表面活性剂分子的分子几何形状以及溶液条件(例如表面活性剂浓度、温度、PH和离子强度)的函数。形成胶束的过程称为胶粒形成并且根据它们多形性形成许多 脂质的相态特征的一部分。本公开的另一方面涉及用于制备具有降低的降解和生物活性剂释放的多糖制剂的方法，所述方法包括以下步骤1)提供多糖，2)将抑制剂和至少一种生物活性剂并入生物相容的或生物可降解的粒子或载体中以及3)将所述多糖和粒子与制剂组合。因此这种封装方法将抑制剂和生物活性剂并入可与多糖同时递送的生物相容的和生物可降解的粒子。当粒子是载体的情况下，它们可由非共价或共价连接的自组装分子(例如胶束、脂质体和聚合囊泡)构成。自组装是本文用于描述过程的术语，其中由于组分自身特异性、局部性相互作用的结果先存组分的混乱系统形成组织化的结构或模式。提出的制剂的其它优点是增强终产品的流变性能的调节能力。交联多糖制剂通常具有高粘度并且需要相当大的力来挤压它通过细针。非交联多糖通常用作润滑剂以促进这个挤压过程。然而，特别是在HA皮肤填充物中，非交联HA对终产品在体内的持久性没有贡献。事实上，越多的交联HA被非交联HA所替代以调节皮肤填充物的流变性能(对于固定的总HA浓度)，产品的降解抗性将越低。因此，非交联GAG也是降解抑制剂(例如硫酸软骨素、ο-硫酸化透明质酸)，可用于延长寿命和改善终产品的流变性能。在一个实施方案中，本文所述的系统是皮肤填充物，其可用于治疗中度和重度面部皱纹及皱褶例如鼻唇褶(这些纹从鼻子延伸到嘴角)。皮肤填充物可以是凝胶移植物，包括HA，一种支撑皮肤弹性、提供光滑和柔顺外观的天然复合糖。它是生物相容的并且可补充可随着老化而耗尽的身体天然HA。皮肤填充物(dermal filler)或皮肤填充物(dermafiller)可用注射器注射到面部的中层或深层真皮中。真皮是表面下的皮肤层，含有结缔组织、神经末梢、汗腺和脂腺以及血管。皮肤填充物可通过提升和增加治疗区域中的皱纹和皱褶的体积而改善皮肤外观。本公开的另一方面涉及包含本系统、美容载体和另外的活性成分的美容组合物。美容活性成分可包括但不限于抗氧化剂、维生素和湿润剂。本发明所述的系统可配制为药物组合物的一部分，任选地包括一种或多种试剂，例如不限于，乳化剂、湿润剂、甜味剂或调味剂、渗涨度调节剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂和类黄酮。用于本公开的药物组合物的渗涨度调节剂包括但不限于盐，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、甘露醇或甘油及其它药学上可接受的渗涨度调节剂。用于本文所述的药物组合物的防腐剂包括但不限于氯化苯甲烃铵、氯丁醇、硫柳汞、苯乙酸汞和苯基硝酸汞。各种用于调整PH的缓冲液和方法可用于制备药物组合物，包括但不限于醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液。类似地，用于药物组合物的抗氧化剂是本领域所熟知的且包括例如焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、乙酰半胱氨酸、丁基羟基苯甲醚和丁基羟基甲苯。类黄酮是植物中发现的化合物，已知其具有多种有益的生化和抗氧化剂作用。类黄酮的亚类包括黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮类(flavanonse)和二氢黄酮醇类。类黄酮的实例包括木犀草素、芹菜素、柑桔黄酮、槲皮素、山奈酚、杨梅黄酮、非瑟酮、异鼠李亭、藿香黄酮醇、鼠李金、橙皮素、柚皮素、圣草素、高圣草素、黄杉素、二氢槲皮素、二氢山萘酚、鞣酸、鞣质、浓缩鞣质、和可水解鞣质。应了解这些及药理学领域已知的其它物质可包括于本发明的药物组合物中。本系统的一些优点在以下阐述，使用根据本文所述的方法制备HA皮肤填充物制齐U、根据现有技术及其比较方法制备HA皮肤填充物制剂的实施例。实施例I根据本公开制备HA填充凝胶将I至5g多糖填充物与1000 μ L磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(ρΗ 7)混合，所述多糖填充物的HA浓度为24mg/mL、交联程度为约6%以及G’为约180 (υΥ θΕΙΙΜ 24HV，(Allergan Inc. , Irvine, California)),所述磷酸盐缓冲盐水溶液补充有10_200mg硫酸软骨素A (CSA-Mw = 5，000-120, OOODa)。将混合物机械均化。 实施例2通过现有技术的方法制备HA填充凝胶 将I至5g多糖填充物与1000 μ L PBS混合使得终HA浓度与实施例I的相同，所述多糖填充物的HA浓度为24mg/mL、交联程度为约6%以及G’为约180Pa (JU VEDERM 24HV)。将混合物机械均化。 实施例3_3] 根据本公开替代性制备透明质酸填充凝胶将I至5g基于HA的多糖填充物与50 μ L PBS溶液(ρΗ 7)混合，所述多糖填充物的HA浓度为24mg/mL、交联程度为约6%以及G’为约170Pa (JUY^DERM 30)，所述PBS溶液补充有l_20mg鞣酸(TA-Mw=800-4，OOODa)。将混合物机械均化。实施例4通过现有技术的方法替代性制备透明质酸填充凝胶将I至5g基于HA的多糖填充物与50yL PBS混合使得终HA浓度与实施例3的相同，所述多糖填充物的HA浓度为24mg/mL、交联程度为约6%以及G’为约170Pa(儿!V$DE.RM 30)。将混合物机械均化。实施例5根据本公开制备透明质酸填充凝胶将Ig透明质酸钠纤维(NaHA，Mw = O. 3_3MDa)与5_10g 1%氢氧化钠溶液混合，并且使混合物水合1-5小时。 将50至200mg I, 4_ 丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)添加到NaHA凝胶，并且将混合物机械均化。然后将混合物置于40_70°C烘箱中1-4小时。所得的交联水凝胶用等摩尔量的盐酸(HCI)中和并且在PBS(p!T7)中溶胀。加入10至200mg CSA(MW=5, 000-120，OOODa)并且将水凝胶机械均化。实施例6通过现有技术的方法制备透明质酸(HA)填充凝胶将Ig NaHA (Mw=0. 3_3MDa)与5_10g 1%氢氧化钠溶液混合，并且使混合物水合1_5小时。将50至200mg BDDE (与实施例5具有相同的HA/交联剂摩尔比)添加到NaHA凝胶,将混合物机械均化。然后将混合物置于40_70°C烘箱中1-4小时。所得的交联水凝胶用等摩尔量的盐酸(HCI)中和并且在PBS(p!T7)中溶胀使得终HA浓度与实施例5的相同。将获得的水凝胶机械均化。实施例7酶促降解研究(比色试验) 使用Morgan-Elson比色测定评估在实施例I和2中制备的HA填充凝胶对酶促降解的抗性。应用该测定通过测量HA链的分子量的改变来评价酶促降解的程度。将透明质酸酶(O. I-IOmg)添加到每种HA制剂，在37°C孵育10-250分钟，接着加Λ O. ImL O. 8Μ四硼酸钾溶液并且在100°C加热10分钟。给样品补充3mL醋酸中的10%(wt)对二甲氨基苯甲醛溶液并且在37°C孵育10-120分钟。对每种HA制剂重复该方法，省略酶添加步骤以制备对照样品。酶促降解样品和对照样品在585nm光密度(OD)的改变用于对每种制剂的降解程度定量。对根据本公开的方法和根据现有技术(图I)制备的填充凝胶测量的结果表明通过本公开的方法(实施例I :0. 774-25. 184mg/mL CSA)制备的凝胶的OD值比通过现有技术的方法制备的凝胶的低(实施例2:0mg/ml CSA)。因为OD值表示降解程度，结果表明根据本方法制备的凝胶表现出对酶促降解的抗性比根据现有技术制备的凝胶高3-75%。而且，发现酶促降解的抗性取决于CSA的浓度。与补充CSA的凝胶的情况类似，通过本公开的方法制备的补充TA的凝胶的OD值，如图2所示(实施例3 :0. 063-1. 000mg/mL TA)，比通过现有技术的方法制备的凝胶(实施例4:0mg/mL TA)的低。因为OD值表示降解程度，结果表明根据本发明制备的凝胶表现出对酶促降解的抗性比根据现有技术制备的凝胶高15-90%。而且，发现酶促降解的抗性取决于TA的浓度。可进一步观察到TA比CSA具有更高的抑制活性，因为它通常采用比TA小的数量级以获得与CSA相同的抑制性。实施例8酶促降解研究(可溶件HA测定)通过使用基于SEC-MALS (尺寸排阻多角度光散射)的可溶性HA测定进一步评价实施例I和2中制备的HA填充凝胶对酶促降解的抗性。应用该测定通过评价每种样品的可溶性HA含量(定义为可通过O. 2-1. O μ m过滤器的凝胶的一部分)来定量降解。酶促降解样品和对照样品之间可溶性HA含量的差异可用于定量每种HA制剂的降解程度。使用配备有Wyatt光散射和折射率装置的Agilent尺寸排阻色谱系统进行SEC-MALS试验。向每种HA制剂中添加透明质酸酶(O. I-IOmg)，并在37°C孵育10-250分钟，接着加入O. Iml O. 8M四硼酸钾溶液并在100°C加热10分钟。将样品在PBS中稀释，过滤通过O. 2-1. O μ m过滤器并注入SEC-MALS系统。对每种HA制剂重复该方法，省略酶添加步骤以制备对照样品。酶促降解的样品、对照样品的可溶性HA含量以及两者之间的差异概括于图3中。图3中所示的结果(酶促降解试验结果表明在不存在CSA的情况下酶促降解后可溶性HA含量的增加更加显著。这与使用比色降解测定获得的结果一致(图I)并且表明根据本公开的方法制备的凝胶显示出比根据现有技术制备的凝胶对酶促降解更高的抗性。与补充CSA的凝胶类似，通过本发明的方法(实施例3 0. 063-1. 000mg/mL TA)制备的补充TA的凝胶的可溶性HA含量的增加比通过现有技术的方法(实施例4 :0mg/mL TA)制备的凝胶的低。这些结果与使用比色降解测定获得的结果一致(图4)。而且，这再次确认了 TA的抑制活性比CSA的显著的高。实施例9持续挤压力试验 使用持续挤压力试验评价实施例5和6中制备的透明质酸填充凝胶的流变性能。挤压力试验用于确定HA制剂中添加的CSA是否可通过作为润滑剂起作用而促进挤压过程。使用具有30G针的5mL注射器在Instron装置上进行挤压力试验。以50mm/min的恒定速率挤压O. 5mL每种样品。记录的峰值力定量挤压的容易程度。压缩力作为两种样品的压缩扩展的函数，示于图5。图5中的结果表明对通过本文所述的方法制备的凝胶记录的挤压力比通过现有技术的方法制备的凝胶的低。这种挤压力的差异是流动下凝胶硬度差异的特征并且表明通过本文所述的方法制备的凝胶中含有的CSA作为促进流动的润滑剂起作用。实施例10根据本公开制备荷载CSA的粒子通过以下方法制备尺寸一致的荷载CSA的粒子通过将10_900mg壳聚糖、I-IOmLIN HCI和l-800mg CSA与20mL MilliQ H2O混合来制备壳聚糖/CSA溶液(溶液A)。通过将O. 1-10%三聚磷酸酯(TPP)与O. 1-10%藻酸盐混合来制备滴液(溶液B)。将溶液A荷载到一次性3-5mL注射器中并以O. 1-lOmL/min流速挤压通过27G x1//’针，气流以l_50mL/min的速率通过针尖。在搅拌下将I-IOmL溶液A喷射到5_100mL溶液B中。所得的粒子在溶液B中孵育1-3天，用MilliQ H2O洗涤3次并且贮存于PBS (pH=7. 4)中直至使用。实施例11根据本发明制备荷载CSA粒子的HA填充凝胶使用通过内螺旋-内螺旋洛克锁(female-to-female luer-lock)连接的两个注射器将根据实施例10制备的荷载CSA的粒子和.RjVtDERM 30充分混合至5mg/mL CSA的终浓度。实施例12根据现有技术制备荷载CSA的HA填充凝胶使用通过内螺旋-内螺旋洛克锁连接的两个注射器将CSA和JUVEDERM 24HV充分混合至10mg/mL CSA的终浓度。实施例13根据现有技术替代性制备荷载CSA的HA填充凝胶使用通过内螺旋-内螺旋洛克锁连接的两个注射器将CSA和JU4DERVi 30充分混合至10mg/mL CSA的终浓度。实施例14
根据本公开制备荷载鞣酸(TA)的粒子通过以下方法制备尺寸一致的荷载CSA的粒子通过将10_900mg壳聚糖、I-IOmLIN HCI和l-800mg鞣酸与20mL MilliQ H2O混合来制备壳聚糖/TA溶液(溶液C)。通过将0.1-10%三聚磷酸酯(TPP)与O. 1-10%藻酸盐混合来制备滴液(溶液D)。将溶液C荷载到一次性3-5mL注射器中并以O. 1-lOmL/min流速挤压通过27G xV2”针，气流以l_50mL/min的速率通过针尖。在搅拌下将I-IOmL溶液C喷射到5-100mL溶液D中。所得的粒子在溶液D中孵育1-3天，用MilliQH2O洗涤3次并且贮存于PBS (pH=7. 4)中直至使用。实施例15、
根据本发明制备荷载TA粒子的HA填充凝胶使用通过内螺旋-内螺旋洛克锁连接的两个注射器将根据实施例14制备的荷载TA的粒子和儿j.$DERM 30充分混合至lmg/mL TA的终浓度。实施例16根据现有技术制备荷载鞣酸(TA)的HA填充凝胶使用通过内螺旋-内螺旋洛克锁连接的两个注射器将TA和几丨VfDERM 30充分混合至10mg/mL TA的终浓度。实施例17在存在和不存在CSA的情况下进行粒子的视觉比较根据实施例10制备荷载CSA的粒子。为比较，也根据相同的一般程序制备没有CSA的对照粒子并且使用Nikon倒置显微镜成像(图6)。由CSA和壳聚糖之间的静电相互作用引起的荷载CSA的粒子(图6，左)的较高不透明性提供了与对照粒子(图6，右)的视觉对比。而且，通过控制气流和泵速改变粒子的尺寸分布。使用该技术成功地制备出直径范围为10至1000 μ m之间的粒子。实施例18由HA填充凝胶体外释放CSA/TACSA是已知的透明质酸酶抑制剂，可显著降低透明质酸的降解速率。一种利用这种抑制潜力的方法是将CSA和HA混合。为此目的，根据实施例12制备样品并进行体外CSA释放测定。将CSA/.mvf,DERM 30 和CSA/.KJ#DERM 24HV 样品置于 50k 渗析袋
中，每个渗析袋均浸入搅拌的PBS溶液(pH=7.4)中。偶尔从PBS溶液中取出小样品并且使用SEC-MALS分析以测定释放的CSA的量。结果概括于图7中。CSA/.ilJ4DERM 30 和CSA/.m4DERM 24HV 样品在一周内释放大约
50%CSA。这种快速释放归因于许多原因CSA的小尺寸C20kDa)，CSA和HA之间的静电排斥以及轻微交联的HA网络，所有均导致弱保留强度。CSA与HA的简单混合不能提供持续保护使之免受酶促降解所需的CSA的控释。鞣酸(TA)是替代性的和非常有潜力的透明质酸酶抑制剂。一种利用这种抑制潜力的简单的方法是将TA与HA混合。为此目的，根据实施例16将TA与JU.4DERM 30混合，置于IOOk渗析袋中并浸入PBS缓冲液。偶尔从PBS溶液中取出小样品并且使用吸光度测量来定量TA含量。结果概括于图8中。如在CSA/JUYiDERM 30 的情况，观察到 TA 从TA/JUV^DERM 30 混合物中的快速释放，再次确认小分子和透明质酸填充物凝胶之间简单混合不能提供控释和缓释特征。实施例19由壳聚糖粒子体外释放CSA/TA根据实施例10制备荷载CSA的壳聚糖/藻酸盐粒子，使得封装的CSA的浓度为5mg/mL。在试验期间将样品置于定轨振荡器上。定期取出样品，通过O. 45 μ m过滤器过滤并注入SEC-MALS系统。2个月后检测到无CSA释放。在此期间粒子保持它们的形状、尺寸和不透明性以及缓冲液的澄清度。类似地根据实施例14制备荷载TA的壳聚糖/藻酸盐粒子，使得封装的TA的浓度为lmg/mL。在试验期间将样品置于定轨振荡器上。定期从PBS溶液中取出样品，并用吸光度测量来分析。发现314nm时的吸光度与TA的量成比例地相关。结果概括于图9中。
与荷载CSA的壳聚糖/藻酸盐粒子的情况类似，TA从壳聚糖/藻酸盐粒子中的释放非常缓慢。这再次确认本文所述的封装系统可提供小分子的慢释和缓释特征。此系统可用于体内递送抑制剂、抗氧化剂及其它活性小分子，同时保持良好的稳定的保质期。实施例20由与HA填充凝胶混合的壳聚糖粒子体外释放CSA/TA根据实施例11将荷载CSA的壳聚糖/藻酸盐粒子与几jVfDERM 30混合。使用通过内螺旋-内螺旋洛克锁连接的两个注射器每天充分混合制剂并且使用酶促降解测定定期地测试。简言之，将透明质酸酶(O. I-IOmg)添加到制剂，在37°C孵育10-250分钟，接着添加O. ImL O. 8M四硼酸钾溶液并在100°C加热10分钟。给样品补充以3mL醋酸中的10%(wt)对二甲氨基苯甲醛溶液，并在37°C孵育10-120分钟。重复该方法，省略酶添加步骤以制备对照样品。酶促降解的样品和对照样品之间在585nm处的光密度(OD)改变可用于定量降解程度。将结果进一步与无抑制剂的制剂(JJUV&.DERM 30)的酶性能进行归一化并且概括于图10中。根据实施例15将荷载TA的壳聚糖/藻酸盐粒子与几j$DERM 30混合。使用通过内螺旋-内螺旋洛克锁连接的两个注射器每天充分混合样品并且使用上述的酶促降解测定定期地测试。结果概括于图10中。上述制剂的抑制活性与从JU Vt.DERM 30粒子系统中释放的CSA/TA的量直接相关，并且可用于估计制剂的保质期。得出贮存I个月后抑制的增加可忽略不计的结论，表明从壳聚糖/藻酸盐粒子30系统中微量释放CSA/TA。这与实施例19中的结果一致并且进一步表明提议的封装系统具有优异的保质期稳定性。除非另外说明，在说明书和权利要求中用于表示成分的数量、性质(例如分子量)、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修改。因此，除非显示相反，说明书和所附的权利要求中所列的数值参数为近似值，可根据本发明试图获得的期望特征而改变。至少且并不企图限制与权利要求的范围等价的教义的应用，每个数值参数应至少根据报道的有效数字的数字和通过应用通常的四舍五入技术来解释。尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和数值参数为近似值，但是尽可能精确地报道特定实例中所列的数值。然而，任何数值固有地包含由发现于它们各自的测试测量中的标准偏差必然导致的某些误差。
描述本发明上下文(尤其是以下权利要求的上下文)中使用的术语“一个”、“一种”、“所述”及类似对象解释为涵盖单数和复数，除非本文另外说明或上下文中明显矛盾。本文数值的范围的列举仅旨在用作分别提及属于范围内的每个单独数值的速记方法。除非本文另外说明，否则将每个单独的数值并入说明书如同其在本文单独列举。可按任何合适的顺序进行本文所述的所有方法，除非本文另外说明或除非上下文中明显矛盾。任何和所有实例的使用或本文所提供的示例性语言(例如，“例如”)仅旨在更好地阐明本发明而并不是对本发明的范围构成限制，除非声明。不应将本说明书中的语言解释为表明任何未要求保护的组分对实施本发明是必要的。不应将本文公开的发明的替代性组分或实施方案的分组解释为限制。每个组的成员可以单独提及和要求保护或者与本文发现的组的其它成员或其它组分组合提及和要求保护。为方便性和/或专利性原因，组的一个或多个成员可预期包括于组中或从组中删除。当发生任何这种包括或删除时，说明书被视为包含改变的组，因而符合所附权利要求中使用的马什库组的书面描述。此发明的某些实施方案在本文中描述，包括发明人已知的实施该发明的最佳模式。当然，对本领域的技术人员来说阅读上述说明后这些所述的实施方案中的改变应该是显而易见的。发明人期望熟练的技术人员酌情利用这些改变，并且发明人旨在以不同于本文具体描述的方式实施该发明。因此，此发明包括如适用法律所许可的所附的权利要求所列举的对象的所有修改和等价物。此外，在其所有可能的改变中上述组分的任何组合涵盖于本发明中，除非本文另外说明或上下文中明显矛盾。而且，贯穿本说明书参考了大量的专利和印刷的出版物。每个上述引用的参考文献和印刷的出版物各自以引用的方式整体并入本文。最后，应了解本文公开的本发明的实施方案阐明了本发明的原则。可利用的其它实施方案在本发明的范围内。因此，例如但不限于，可根据本文的教导使用本发明的替代性构造。因此，本发明不限于本文所精确显示和描述的。在权利要求中使用语言“由组成”或和“大致上由组成”可进一步限定本文公开的特定实施方案。当在权利要求中使用时，当提交或每次修正添加时，过渡性术语“由组成”不包括权利要求中没有具体说明的任何组分、步骤或成分。过渡性术语“大致上由组成”将权 利要求的范围限制为特定材料或步骤以及没有实质性影响基本特征和新特征的那些。要求保护的本发明的实施方案是本文固有的或清楚描述的和能够实现的。


本文描述了包括至少一种多糖降解抑制剂的多糖凝胶制剂及其制备方法。本文所述的方法包括提供至少一种多糖和将至少一种降解抑制剂并入多糖的步骤。