专利名称：一种治疗高致病性禽流感病毒h5n1引发疾病的多肽疫苗的制作方法禽流行性感冒(Avian influenza)简称禽流感，是由A型流感病毒(AIV)引起的 禽类广泛发生的传染病。据不完全统计，全球禽流感疫情已波及47个国家和地区，人发 禽流感病例已达195起以上，其中死亡至少110人，死亡率高达56.4%。1997年在香港 发生的禽流感引起了人的发病和死亡，从而引起了全世界的高度重视。AIV依据其血凝素 (Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)抗原性的差异目前可分为16个H 亚型(Hl H16)和 10 个 N 亚型(Ni N10) [AlexanderDJ. A review of avian influenza in different bird species. VetMicrobiol, 2000, 74 (1-2) :3-13]。根据禽流感病毒毒力 和致病性的不同，可以将其分为高致病性、低致病性和无致病性三类。H7、H5亚型所致禽 类疾病具有传播快、危害大、病情凶险等特征，除急性呼吸道炎症外，常伴有全身出血性改 变，心、肺、肾等多脏器衰竭，死亡率达100%，故称为高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza),目前将H5m归为高致病性禽流感病毒。对于人类而言，最大的威胁在于，如果同时感染人类流感病毒和禽流感病毒，就有 可能在体内重组成可以在人类之间互相传播的新型病毒，而人们对此几乎没有免疫力，那 势必将导致又一次的流感大流行。由于水禽和飞禽是AIV的天然宿主，这种病毒的长期存 在，将为其与感染人或其他哺乳动物的流感病毒混合、产生新毒株提供条件。目前针对AIV的疫苗或者药物主要有以下几种1、质粒疫苗Lalor PA等对比了分别构建的HA、NP (核蛋白)、M2基因的质粒疫苗 的免疫效果。三种疫苗都对实验鼠和雪貂有明显的保护效果，而同时构建了 NP和M2基因 的疫苗效果最佳Lalor PA, Webby RJ, Morrow J. Plasmid DNA-based vaccines protect mice and ferrets againstlethal challenge with A/Vietnam/1203/04(H5N1)influenza virus. J InfectDis. 2008 ；197 (12) :1643_1652。Li C 等构建了优化后的质粒疫苗H5N1/ PR8-5B19。该疫苗包括H5m病毒的HA和NA基因。并对HA和NA基因做了修饰-修改了 HA切割位点使其和低致病性情流感相似、将NA的茎区用鼠肝炎病毒的S2糖蛋白的5B19表 位代替，以降低其致病性和增强其免疫原性。最后该疫苗表现出较强的体液免疫应答，对实 验鸡产生了较好的免疫保护Li C, Ping J, Jing B. H5N1 influenzamarker vaccine for serological differentiation between vaccinated andinfected chickens. Biochem Biophys Res Commun. 2008 ；372 (2) :293-297.。2、重组体疫苗Wei CJ等系统分析了几种不同形式的重组体HA蛋白应用为疫苗的潜力。单体、 三聚体和低聚体的H5W HA蛋白从细胞分理处分离出，采用中和抗体反应对其免疫原性 进行评估。结果高分子量的低聚体HA蛋白疫苗引发的抗体反应最强烈，三聚体次之，单体最i看Wei CJ, Xu L, KongffP. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited byrecombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. JVirol. 2008 Jul ；82(13) :6200-6208 。Watanabe 等研究发现，将 H5m 病毒 M2 羟基端切除 11个氨基酸后，该病毒与野生型相比有相似的生长能力，但在小鼠体内的复制效率大大降 低。作者构建了重组体病毒-VN1203M2del 11，该重组病毒HA的切割位点由切除11个氨基酸 后的突变体代替。结果该疫苗对小鼠产生了较好的保护性。M2胞质尾部突变体有发展成 为 H5N1 病毒减毒活疫苗的潜力Watanabe Τ, Watanabe S, Kim JH. Novel approach to the development of effective H5N1 infIuenzaA virus vaccines :use of M2 cytoplasmic tail mutants. J Virol. 2008Mar ；82 (5) :2486_92。3、病毒载体疫苗Rmer等利用新城疫病毒作载体，表达HA免疫原作为疫苗。结果 显示这种疫苗(NDVNDVH5m)在一次免疫后就对鸡有了较好的效果。由新城疫病毒做载体 的减毒疫苗对感染H5禽流感的保护水平由该疫苗与感染H5W病毒的H5序列的同源性大 小决定Rmer-Oberd, rfer A, Veits J. Level of protection of chickens againsthighly pathogenic H5 avian influenza virus with Newcastle disease virusbased live attenuated vector vaccine depends on homology of H5sequence between vaccine and challenge virus. Vaccine. 2008 ；26 (19) :2307_13。Mar 等用 HIV 病毒颗粒作载体， 包被H5m的ΗΑ、ΝΑ、M2基因，构建成为H5m HaNaM-pseudotyped HIV载体系统。该载 体系统可以较精确的模拟禽流感病毒在体内的反应，可代替禽流感病毒，用来评估疫苗、 药物。特别在是安全性较低的实验室应用该系统有实用意义Mar Ao Ζ, Patel A, Tran K. Characterization of atrypsin-dependent avian influenza H5Nl-pseudotyped HIV vector systemfor high throughput screening of inhibitory molecules. Antiviral Res. 2008Jul ；79(1) :12_8。Singh等将牛腺病毒AD的一个亚型(BAdiB)作为载体表达H5m 的HA基因，构建成BAd-H5NA疫苗，有较好的免疫效果SinghN，Pandey A, Jayashankar L. Bovine adenoviral vector-based H5Nlinfluenza vaccine overcomes exceptionally high levels of pre-existingimmunity against human adenovirus. Singh Mol Ther. 2008 ； 16 (5) :965-71。
本发明的目的就是提供一种治疗高致病性禽流感病毒H5m引发疾病的多肽疫 苗，它可以专门针对高致病性禽流感病毒H5m型感染的细胞进行有效地破坏，而且对人体 无毒副作用。本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，它的氨基酸序列为氨基 端-QIGNISIWV-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。正常人体的外周血单核细胞(简称PBMC) —般不具有特异性溶破受到高致病性禽 流感病毒H5m感染的细胞的功能，本发明提供的多肽在体外与HLA-A*0201阳性人体的外 周血单核细胞共同孵育，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称 CTL)的数量45% _80%，还可以诱导激活CTL溶破受高致病性禽流感病毒H5W感染的阳性 细胞，溶破率为60% -88%。本发明的基本的氨基酸序列来源于GENBANK报道的高致病性禽流感病毒H5m的m蛋白的氨基酸序列，采用蛋白质表位分子设计的原理和方法，高致病性禽流感病毒H5m 的m蛋白序列进行CTL表位分析，主要是基于量化基序法确定m蛋白的CTL表位，具体做 法是从m蛋白第ι位氨基酸残基开始，逐个截取九肽段或十肽段，共获得6条九肽段。对 于每一条肽段，在结合矩阵中查找各位点氨基酸残基的结合系数，这九肽结合系数相乘后 再乘以标准系数，即为该九肽或十肽与HLA-A*0201的结合系数。最后，选取结合系数最高 的几条肽段作为候选CTL表位。以此方法找到了具有功能的本发明所述的氨基酸序列，即 氨基端-QIGNISIWV-羧基端。合成本发明所述的氨基酸序列方法均是现有的成熟技术，它是按照如下的方法制 成的采用标准Fmoc方案，起始选用0. 0125mmol, PSC树脂(ABI公司生产，批号 A5F013)，分别按照权利要求1、2、3或4所述的序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各 氨基酸原料(美国ABI公司生产)的用量为0. Immol0各种氨基酸保护基团是各氨基酸 的 alpha 氨基为 Pmoc 保护，其余侧链保护基团，Arg (Mtr)、tyr (tBu)、Thr (tBu)、Tyr (tBu)、 Asp(OtBu)0每步缩合都加入HoBt/Dcc活化保护氨基酸的羧基。每步缩合用含有20%六 氢吡啶的NMP溶液去除Fmoc保护基，肽链合成后，按照ABI公司推荐的步骤，将含树脂的 肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液的成分结晶苯酸0. 75g、酒石酸乙二胺 (EDT)0. 25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole)O. 5ml、去离子水0. 5ml、三氟乙酸10ml。在室温条 件下持续搅拌，反应时间为4. 5小时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将 混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和 滤器，将滤液在常温下低压蒸发至1 anl，加乙醚50ml使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后， 冷冻干燥，所得便是肽产品。以上过程都是在ABI-431A固相自动肽合成仪(美国生产)上 完成。本发明涉及的合成多肽药物或疫苗可以室温保存、运输，也可以自动化批量生产。 使用现有的成熟技术，制备表达高致病性禽流感病毒H5m之m转染的靶细胞，叫HEK293 细胞；按照本领域公知的方法获得HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞(简称PBMC)； 培养上述PBMC细胞M小时后，取悬液OX106/ml)4瓶。加入本发明所述的氨基酸序列多 肽(20yg/ml)，加入等量完全培养基作为对照组，37°C，5%C02环境下孵育。7天后重复该 刺激过程，共反复刺激3次。最末一次刺激后第3天收集悬浮细胞，这些细胞具有针对高致 病性禽流感病毒H5W之m蛋白的靶细胞的细胞毒性CTL细胞，计数检测发现使用本发明 涉及的合成多肽药物或疫苗可以使CTL细胞数量较对照组增加45 % -88 %。将转染了高致病性禽流感病毒H5m之m基因的HEK293细胞与上述CTL细胞共 同孵育，发现该CTL细胞可以溶破转染了高致病性禽流感病毒H5m之m基因的HEK293细 胞，溶破率得到60% -88%。由于采用了上述技术方案，本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点， 它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破具 有高致病性禽流感病毒H5m之m基因的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。本发明的氨基酸序列为氨基端-QIGOTSIWV-羧基端；利用赖氨酸具有两个氨基、 一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，将多个氨基酸序列连接的特殊方式。该多肽可以体外刺激HLA_A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外 周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高50%-80%，还可以激活 CTL溶破高致病性禽流感病毒H5m之m基因的细胞，溶破率为60% -88%。实施例1 它的氨基酸序列可以为该多肽可以体外刺激HLA_A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以增加这些外 周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量提高60%，还可以激活CTL溶 破对高致病性禽流感病毒H5m之m基因的细胞，溶破率为83. 10%。实施例2 它的氨基酸序列也可以为一种治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽疫苗，涉及一种生物医学领域，特别是一种关于高致病性禽流感病毒引发疾病的多肽疫苗。其特征在于它的氨基酸序列为氨基-QIGNISIWV-羧基；利用赖氨酸具有两个氨基、一个羧基的特点，以赖氨酸为接头，所形成的特殊连接方式。本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破具有高致病性禽流感病毒H5N1之N1蛋白的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。