专利名称：一种碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列及其高效表达方法碱性高温果胶酶在生物脱胶中有着无与伦比的作用。随着社会的发展，国家对企业要求越来越高，节能减排成为企业的热门话题。苎麻生物脱胶和织物的生物煮练是ー种绿色环保的脱胶方法，相比化学脱胶法，生物脱胶具有提高精干麻质量，不损伤纤维，无污染等优点。生物脱胶技术成为国内外苎麻研究者的研究热点，也是未来苎麻脱胶的主要发展方向。但是，在苎麻脱胶过程中所需要的高温碱性果胶酶，一般来源于芽孢杆菌和大肠杆菌，它们在原核细胞中可以大量表达，可若想得到大量较纯净的果胶酶，就必须进行一系列复杂的纯化过程。为了便于纯化，人们开始采用以毕赤酵母为表达菌株，毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上毕赤酵母最小生长培养基中只有少量的蛋白，这意味着分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要成份，然而由于来源基因密码子偏好的问题，使碱性果胶酶的产量偏低。因此，如何运用全基因重组合成法寻找新的碱性果胶酶基因序列，使其序列的5’ 端为EcoR I酶切位点、3’端为Not I酶切位点，整个序列不含有SalI、PmeI等限制性酶切位点；选择合适的表达载体，使表达的蛋白更易于纯化且具有更高的活性，极大的降低碱性果胶酶的生产成本，増加企业对其的利用率成为了我们的研究主題。
本发明的目的是I、本发明提供并公开了ー种序列的5’端为EcoRI酶切位点、3’端为NotI酶切位点，整个序列不含有Sail、PmeI等限制性酶切位点编码碱性果胶酶pell68s的优化基因序列及其基因制备优化方法2、本发明还提出了上述pell68s核苷酸优化序列的高表达方法。本发明目的之一的步骤为(I)采用常规的PCR重叠引物延伸法。将pell68基因序列(Bacillus subtilis 168,GenBank登录号AL009126)输入DNAworks软件,在密码子频率表中(Codon Frequency Table)选择P. pastoris,并在屏蔽限制性酶切位点选项中选择Sail、PmeI等酶切位点,得到相关的pell68在毕赤酵母中表达的一系列优化基因序列及引物序列。(2)为了便于表达质粒的构建，在引物I的前端添加了 EcoRI限制性酶切位点，引物42的5’端引入了 NotI限制性酶切位点。(3)以上述引物序列互为模板，采用从两端引物向中间引物浓度递减的方法进行全长的扩增，即引物I、引物42浓度为80nmol/L，依次递减，但中间引物21、引物22浓度最低为 0. 625nmol/L。具体反应条件是 94°C预变性 5min，然后 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 90s， 30个循环，再72°C延伸IOmin。(4)PCR产物用0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化，和T载体连接转化，挑选转化子经过测序验证后得到和设计结果一致的pel 168s优化序列。(5)优化后的pell68s序列与原始序列pell68相比，序列中的15% -25%的碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换，为了避免DNA序列中形成的ニ级结构对表达的影响，pell68s基因序列除去了编码产物自身的21个氨基酸的信号肽序列。其中优化后的pell68s序列与原始序列pell68相比，效果最好的是序列中的 294个碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换。本发明目的之ニ的步骤为(I)用本发明目的I中的PCR合成的基因序列经过限制性内切酶EcoRI和NotI处理后，与同样经过EcoRI和NotI处理的表达载体pPIC9K连接，构建重组质粒pell68s-9k。(2)重组质粒pell68s-9k经Sail线性化后转入毕赤酵母GS115中，得到阳性重组菌株 GS115/pell68s-9k。所述的表达载体是商用载体pPIC9k。也可用其他的毕赤酵母表达载体(如 pPIC3. 5k、pPICZa等)构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。(3)发酵培养阳性重组菌株GS115/pell68s-9k，制备得到所述耐热碱性果胶酶蛋白质。(4)同上的方法构建未优化序列的重组质粒pell68_9k，Sail线性化后转入毕赤酵母GS115中，筛选到阳性重组菌株GS115/pell68-9k，并在相同的条件下进行诱导表达。(5)步骤(3)和步骤(4)表达上清液中碱性果胶酶活性的比较。本发明采用了以毕赤酵母GS115为表达菌株，运用全基因合成法合成新的基因 (pel 168s)。并根据毕赤酵母密码子的偏爱性,利用DNAworks软件优化从GenBank中检索到的pell68基因序列,全部选用偏好性大于10%的密码子,设计合成了优化的pell68s基因。为了便于蛋白的表达，在合成的序列两端分别引入了 EcoRI和NotI的酶切位点，且优化的pel 168s序列中不含有Sail、PmeI等限制性酶切位点。同时为了便于蛋白分泌表达, 在表达载体的选择上，采用了含有酿酒酵母a因子信号肽序列的pPIC9k表达载体，引导蛋白进行胞外分泌表达，上清液中目的蛋白的含量达到95%以上。使表达的蛋白更易于纯化且具有更高的活性。极大的降低了碱性果胶酶的生产成本，増加了企业对其的利用率。图I为合成Pell68s基因产物的0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测图片。图2为优化前pel 168基因和优化后pel 168s基因所产酶活性比较图。

本发明提出并公开了一种碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列及其高效表达方法，它是使用DNAworks软件，将pel168基因序列(Bacillus subtilis 168，GenBank登录号AL009126)进行优化，屏蔽了限制性酶切位点SalI、PmeI，在其引物3’端添加了EcoRI限制性酶切位点，引物5’端引入了NotI限制性酶切位点。经PCR扩增，连接转化，测序验证，得到碱性果胶酶pel168s的优化基因序列。用该序列构建重组质粒pel168s-9k，并转入毕赤酵母GS115中，得阳性重组菌株GS115/pel168s-9k。发酵培养阳性重组菌株，可制备得到所述耐热碱性果胶酶蛋白质。使用本发明碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列利用毕赤酵母生产碱性果胶酶，目的蛋白表达量高，纯化过程简单，极大的降低了碱性果胶酶的生产成本，增加了企业对其的利用率。