立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法_沈寅初专利（羟酸,脱氢酶,选择性）-早鸽网

立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法

专利名称

立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法
发明者

沈寅初, 王威, 薛亚平, 郑裕国
公开日

2012年9月12日
申请日期

2012年4月13日
优先权日

2012年4月13日
申请人

浙江工业大学
文档编号

C12Q1/32GK102660631SQ201210109290
关键字

羟酸脱氢酶选择性筛选立体
权利要求

1.ー种立体选择性α -羟酸脱氢酶的筛选方法，所述方法包括 (1)取待测含α-羟酸脱氢酶的样品溶于pH 6 9的缓冲液中，添加结构如式(I)所示的α -羟酸手性单体作为底物至底物终浓度为I IOOmM,于20 50°C水浴中进行转化反应;2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中呈现蓝绿色时，所述方法进ー步包括步骤⑶和⑷ (3)另取呈现蓝绿色的待测样品溶于pH为6 9的缓冲液中，添加立体构型与步骤(I)相反的手性単体作为底物至底物终浓度为I IOOmM,于20 50°C水浴中进行转化反应； (4)转化反应结束后，取转化液按照步骤(2)方法进行显色反应，显色反应结束后，若呈现颜色均一的蓝绿色，则表明待测样品中含有的α-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若呈现淡黄色，表明待测样品中含有与步骤(I)底物的立体构型一致的α-羟酸脱氢酶3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述α-羟酸为苯基乳酸或对羟基苯基乳酸4.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述pH6 9的缓冲液为pH7. 5 8. O的磷酸ニ氢钠-磷酸氢ニ钠缓冲液5.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述待测样品为微生物菌体，所述方法如下 (A)取微生物菌体均匀分散于pH6.O 9. O的磷酸盐缓冲液中，制成0D_值为5 10的菌悬液，添加结构如式(I)所示α-羟酸的外消旋体作为底物至底物终浓度为I IOOmM,于20 50°C水浴中进行反应，取转化液10 μ L添加200 300 μ L的FeC13显色剂溶液进行反应5 30min，反应结束后，呈现蓝緑色的为α -羟酸脱氢酶阳性样品，呈淡黄色的为α-羟酸脱氢酶阴性样品； (B)另取脱氢酶阳性样品两份，溶于ρΗ7.5 8. O的磷酸ニ氢钠-磷酸氢ニ钠缓冲液中，各自添加手性的结构如式(I)所示的R-或S-α-羟酸单体作为底物至底物终浓度为I lOOmM，于20 50°C水浴中进行转化反应，转化反应结束后，取转化液10 μ L添加200 300 μ L的FeCl3显色剂溶液进行反应5 30min，显色反应结束后，若仅有ー份呈现蓝绿色，则表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶的光学选择性与呈蓝绿色样品中添加的手性α-羟酸的立体构型一致，若两份转化液均呈现蓝绿色则表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶没有光学选择性；所述FeCl3显色剂溶液组成如下FeCl3*6H20 2mmol/L，ニ甲基亚砜400ml/L，冰醋酸 20ml/L，溶剂为水
技术领域

本发明涉及立体选择性a -羟酸脱氢酶的筛选方法
背景技术

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法律状态

专利名称：立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法立体选择性a -羟酸脱氢酶为一类特殊的氧化还原酶，能立体选择性催化外消旋a-羟羧酸类化合物中的一种异构体生成相应的a -酮酸，反应液中留下另外一种异构体(见下式)，由于产物中光学活性的a-羟酸与酮酸的性质差异较大，易于分离。利用该酶可以用于生产手性的a-羟酸和酮酸，具有良好的开发应用前景。本发明提供了一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法。所述方法包括(1)取待测含α-羟酸脱氢酶的样品溶于pH 6～9的缓冲液中，添加结构如式(I)所示的α-羟酸手性单体作为底物，于20～50℃水浴中进行转化反应；(2)转化反应结束后，取转化液添加FeCl3显色剂溶液进行显色反应5～30min，反应结束后，根据反应液呈现的颜色判断结果；本发明方法不需要对拟筛选的底物进行衍生化，能够利用简单的比色法快速鉴定所筛选的微生物的脱氢酶活性及光学选择性，具有筛选流程简单、速度快、设备要求低、通用性强等优点，为以外消旋的扁桃酸及其相关衍生物为底物来进行生物酶法拆分获得光学纯的产品带来了极大的便利。

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