用于治疗甲状旁腺功能亢进和高钙血症的聚阳离子钙调节肽的制作方法[0001]本申请是申请日为2007年11月16日、发明名称为“用于治疗甲状旁腺功能亢进和高钙血症的聚阳离子钙调节肽”的中国专利申请N0.200780050006.8的分案申请。[0002]对相关申请的交叉参考[0003]本申请要求于2006年11月16日提交的美国临时申请序列号60/859，597的优先权。该文件的内容通过引用完全结合于本文。[0005]钙的体内稳杰[0006]钙的体内稳态是机体通过其保持充足的钙水平的机制。该过程是高度调节性的，并且包括在钙吸收 、转运、在骨中存储、在其它组织中沉积、和排泄之间的复杂的相互作用。[0007]PTH是血清钙水平的最重要的调节剂，并且作用通过经由骨再吸收作用增加钙从骨的释放而提高血液中的钙浓度；提高钙从肾小管的再吸收；并且通过增加维生素D的活性形式1，25-(0H)2维生素D的产量而提高在小肠中的钙吸收。PTH还刺激磷从肾脏的排泄，并且增加从骨的释放。[0008]PTH分泌受钙感应受体(CaSR)调节，钙感应受体(CaSR)是表达在甲状旁腺细胞细胞表面上的一种G-蛋白偶联受体，其检测细胞外钙离子(Ca2+)浓度的小波动并且通过改变PTH的分泌而响应。Ca2+对CaSR的激活在数秒到数分钟内抑制PTH的分泌，并且该过程可以由该受体的蛋白激酶C(PKC)磷酸化调控。CaSR还表达在成骨细胞上和在肾脏中，在肾脏中它调节肾的Ca2+排泄。
[0009]另外，PTH调节磷的体内稳态。PTH刺激在顶端膜(刷状缘膜)和基底外侧膜二者上的甲状旁腺激素受体I (PTHRl)。由于通过在刷状缘膜上的肾Na+/磷酸盐(NaP1-1Ia)协同转运体的内在化而减少，PTHRl刺激导致磷酸盐(Pi)尿路排泄的增加。预计PKC激活类似地减少Pi排泄。
[0010]PTH还参与骨中的成骨细胞和破骨细胞的调节。PTH通过提高钙的骨再吸收和肾吸收而增加血清Ca2+。PTH刺激成骨细胞产生RANK配体(RANKL)，其与RANK受体结合并且激活破骨细胞，导致骨再吸收的增加和血清Ca2+的增加。护骨蛋白(OPG)是RANKL的诱杀型受体，其阻断骨再吸收。骨质疏松症由破骨细胞的骨再吸收和成骨细胞的骨形成过程之间的不平衡导致。
[0011]高钙血症和甲状旁腺功能亢进
[0012]人体含有约Ikg钙，其中99%沉积在骨中。在正常条件下，循环钙离子(Ca2+)严格保持在约8-10mg/dL(即，2.25-2.5mmol/L ；~600mg)的水平。约Ig元素钙(Ca2+)是日常摄取的。在该量中，吸收约200mg/天,并且排泄800mg/天。另外，约500mg/天通过骨再吸收释放，或沉积在骨中。每天约IOg Ca2+通过肾过滤，其中约200mg出现在尿中，并且其余的被重新吸收。
[0013]高钙血症是在血液中升高的钙水平。急性高钙血症可以导致胃肠症状(厌食、恶心、呕吐)；肾症状(尿频(polvuria)、多饮)，神经肌肉症状(抑郁、意识模糊、木僵、昏迷)和心脏症状(心搏徐缓、第一度房室(first degree atrio-ventricular))症状。慢性高钙血症也与胃肠症状(消化不良、便秘、胰腺炎)；肾症状(肾石病、肾钙质沉着)，神经肌肉症状(虚弱)和心脏(高血压阻滞、毛地黄敏感性)症状相关。异常心律可以导致，并且短QT时间间隔和加宽的T波的EKG发现表示高钙血症。高钙血症可以是无症状的，症状主要在高钙水平(12.0mg/dL或3mmol/l)发生。认为严重的高钙血症(在15_16mg/dL或
3.75-4mmol/l以上)是医学紧急事件:在这些水平，可以导致昏迷和心脏停博。
[0014]高钙血症通常由甲状旁腺功能亢进引起，甲状旁腺功能亢进导致过量的骨再吸收和升高的血清钙水平。在原发性偶发性甲状旁腺功能亢进中，PTH由单甲状旁腺腺瘤过量产生；较不常见地，多个腺瘤或弥散的甲状旁腺腺体增生可能是原因。增加的PTH分泌导致骨再吸收的净增加，释放Ca2+和磷酸盐(Pi)。PTH还提高Ca2+的肾再吸收，并且抑制磷酸盐(Pi)的再吸收，这导致血清钙的净增加和磷酸盐的减少。
[0015]当血浆Ca2+水平减少刺激PTH分泌时，发生继发性甲状旁腺功能亢进。继发性甲状旁腺功能亢进的最重要的起因是慢性肾不足，诸如在多囊肾病或慢性肾盂肾炎中的那些，或是慢性肾衰竭，诸如在血液透析患者中的那些。响应由低钙摄入、GI病症、肾不足、维生素D缺乏、和肾高钙尿症导致的低血钙症可能产生过量的PTH。在长期的继发性甲状旁腺功能亢进和高钙血症之后，可能发生三发性甲状旁腺功能亢进。
[0016]恶性病是非PTH介导的高钙血症的最常见的起因。恶性高钙血症是癌症的罕见但严重的并发症，影响10% -20%的癌症患者，并且可能与实体瘤和白血病一起发生。该病症具有突然的发作，并且具有非常低的预后，平均存活仅为6周。在肿瘤细胞中，生长因子(GF)调节甲状旁腺激素-相关蛋白(PTHrP)的生产。肿瘤细胞可能受自分泌GF的刺激而增加PTHrP的生成，导致提高的骨再吸收。转移到骨的肿瘤细胞也可以分泌PTHrP，其可以再吸收骨，并且释放额外的GF，其又以旁分泌方式作用进一步增加PTHrP生成。
[0017]韩模拟剂(Calcimimetic Agents)
[0018]钙模拟剂是模拟钙在各种组织上的作用的药物。已经描述了具有对甲状旁腺钙感应受体(CaSR)的活性的苯烷基胺钙模拟剂。参见Nemeth等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sc1.), 95:4040-4045 (1998)。一种这样的试剂，Cinacalcet,市售用于甲状旁腺功能亢进的治疗。另外，CaSR还可以感应和响应其它二价和多价阳离子，以及有机聚阳离子，诸如精胺、六环(hexacyclin)、聚赖氨酸、聚精氨酸、鱼精蛋白、淀粉状β-肽、新霉素、和庆大霉素，尽管报道这些阳离子缺乏针对CaSR的敏感性并且具有针对CaSR的相对低的功效。参见 Nagano 和 Nemeth,药学科学杂志(J.Pharmacol.Sc1.), 97:355-360 (2005);还参见 fcown 等，骨矿物质研究杂志(J.Bone Miner.Res.)，6:1217-1225 (1991)。
[0019]蛋白激酶C
[0020]蛋白激酶C(PKC)是参与各种细胞功能，包括细胞生长、基因表达调控和离子通道活性的信号转导中的关键酶。PKC家族的同工酶包括至少11种不同的蛋白激酶，基于它们的同源性和针对激活剂的敏感性，它们可以分成至少3个亚家族。经典或cPKC亚家族的成员，α，β (β?，β II),和Υ同工酶，包含由同工酶-特有的(可变或V)区域间隔的4个同源结构域(Cl，C2, C3和C4)，并且激活需要钙、磷脂酰丝氨酸(PS)、和二酰基甘油(DG)或佛波醇酯。新型或nPKC亚家族成员，δ , ε，η，和Θ同工酶，激活不需要钙。最后，非典型的或aPKC亚家族成员，ζ和λ/t同工酶，对DG、佛波醇酯和钙不敏感。
[0021]关于PKC同工酶亚细胞分布的研究表明PKC的激活导致其在细胞内的重新分布(也称为易位)，以致激活的PKC同工酶与质膜、细胞骨架元件、核、和其它亚细胞区室缔合。似乎不同PKC同工酶特有的细胞功能由它们的亚细胞定位决定。例如，发现激活的β? PKC在核内，而发现激活的βΙΙ PKC在心肌细胞的核周和细胞外周处。此外，在相同的细胞中，ε PKC结合交叉-条纹状结构(可能是收缩性的元件)，并且在激活后或在向固定细胞加入外源激活的ε PKC后，细胞-细胞接触。不同PKC同工酶在细胞不同区域的定位又似乎是由于激活的同工酶与称为关于激活的C-激酶的受体(RACKs)的特异性锚定分子的结合引起。
[0022]认为RACKs通过将激活的PKC同工酶选择性锚定至它们各自的亚细胞位点而行使功能。RACKs仅结合激活的PKC，并且不必需是该酶的底物。与RACKs的结合也不是通过该激酶的催化结构域介导。PKC的易位反映激活的酶与锚定在细胞特定部分的RACKs的结合，并且与RACKs的结合是PKC产生其细胞响应所必需的。抑制PKC与RACKs的体内结合抑制PKC易位和PKC-介导的功能。
[0023]已经鉴定了编码RACKl和RACK2的cDNA克隆。二者均是G蛋白β亚基的同源物，所述G蛋白β亚基是另一种易位蛋白激酶即β_肾上腺素能受体激酶β-ARK的受体。与G-蛋白相似，RACK1,和RACK2具有7个WD40重复。最近的数据表明RACKl是关于激活的β II PKC的选择性锚定蛋白。研究已经表明RACK2(也称为β ’ -C0P)是关于ε PKC的选择性结合蛋白。Csukai 等，生物化学杂志 CL Biol.Chem.) 1997:272:29200-29206。
[0024]PKC的易位是PKC同工酶正确功能所必需的。模拟RACKs上的PKC-结合位点或PKC上的RACK-结合位点的肽是PKC的同工酶-特异性易位抑制剂，其在体内选择性抑制该酶的功能。
[0025]发明概述
[0026]本发明涉及聚阳离子钙调节肽及其药物组合物，并且涉及所述肽和组合物在用于在需要所述治疗的受试者中减少甲状旁腺激素(PTH)和/或治疗高钙血症的方法中的应用。
[0027]在一方面中，本发明提供用于在受试者中降低甲状旁腺激素(PTH)水平的方法，所述方法包括给需要 其的受试者施用治疗有效量的钙调节肽，由此减少血清PTH。
[0028]在另一个方面中，本发明提供用于治疗高钙血症的方法，所述方法包括给需要其的受试者施用治疗有效量的钙调节肽，由此减少血清钙。
[0029]在另一个方面中，本发明提供用于治疗骨病的方法，所述方法包括给需要其的受试者施用治疗有效量的聚阳离子钙调节肽，由此减少骨转换。
[0030]在一些实施方案中，所述钙调节肽包含:
[0031]a)包含5-20个在生理pH下带正电荷的氨基酸、氨基端、羧基端、和第一含有巯基的残基的聚阳离子肽；[0032]其中所述聚阳离子肽在氨基端、羧基端或两端进行化学修饰；和
[0033]b)包含第二含有巯基的残基的货物肽；
[0034]其中所述第二含 有巯基的残基与所述第一含有巯基的残基以二硫键键合。
[0035]在其它实施方案中，所述钙调节肽包含:
[0036]a)第一聚阳离子肽，其包含至少3个在生理pH下带正电荷的氨基酸、第一氨基端、第一羧基端、和第一含有巯基的残基；
[0037]其中所述第一聚阳离子肽在第一氨基端、第一羧基端或两端进行化学修饰；和
[0038]b)第二聚阳离子肽，其包含至少3个在生理pH下带正电荷的氨基酸、第二氨基端、第二羧基端、和第二含有巯基的残基；
[0039]其中所述第二聚阳离子肽在第二氨基端、第二羧基端或两端进行化学修饰；
[0040]其中所述钙调节肽包含6-30个在生理pH下带正电荷的氨基酸。在其它实施方案中，所述钙调节肽包含:
[0041]聚阳离子肽，其包含5-20个在生理pH下带正电荷的氨基酸、氨基端、羧基端、和第一含有疏基的残基；
[0042]其中所述聚阳离子肽在氨基端、羧基端或两端进行化学修饰；和
[0043]其中所述第一含有巯基的残基包含可以作为游离巯基巯基或处于保护形式的巯
基基团。
[0044]在一些实施方案中，治疗有效量的钙调节肽足以将血清PTH减少至少20%，在施用所述钙调节肽后持续至少10小时。在某些实施方案中，确定PTH水平的减少为血清全部PTH的减少。在其它实施方案中，治疗有效量的钙调节肽足以将血清全部PTH减少低于治疗前基线水平的至少20%，在施用所述钙调节肽后持续至少10小时。
[0045]在其它实施方案中，治疗有效量的钙调节肽足以将血清PTH减少30% -70%，在施用所述钙调节肽后持续至少48小时。
[0046]在某些实施方案中，治疗有效量的钙调节肽足以将血清钙减少至少5%，在施用所述钙调节肽后持续至少10小时。
[0047]在其它实施方案中，治疗有效量的钙调节肽足以将血清钙减少5% -20%，在施用所述钙调节肽后持续至少48小时。
[0048]本发明的方法有效用于治疗患有以升高的血清PTH水平、升高的血清钙水平、或二者为特征的病症或疾病的受试者。在一些实施方案中，本发明的方法还可以有效用于治疗患有以减少的血清磷酸盐水平为特征的病症或疾病的受试者。
[0049]在一些实施方案中，所述受试者是人。在其它实施方案中，所述受试者是人，并且减少血清PTH。在某些实施方案中，所述受试者是人，并且减少血清钙。在其它实施方案中，所述受试者是人，并且减少骨转换。
[0050]在一些实施方案中，所述受试者患有原发性甲状旁腺功能亢进、继发性甲状旁腺功能亢进、三发性甲状旁腺功能亢进、恶性高钙血症、转移性骨病(例如骨肉瘤)、佩吉特病、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨软化、软骨钙质沉着病、软骨发育不全、骨软骨炎、囊性成骨不全、先天性低磷酸酯酶症、纤维瘤性损伤、纤维性结构不良、多发性骨髓瘤、溶骨性骨病、假体周围(periprosthetic)骨质溶解、牙周病、骨质疏松症、异常骨转换、或高转换性骨病。[0051]在具体实施方案中，所述受试者患有原发性、继发性或三发性甲状旁腺功能亢进。在优选实施方案中，所述受试者患有继发性甲状旁腺功能亢进(有时称为SHPT)。预测在患有SHPT的受试者中的血清PTH的减少将降低骨转换。在其它实施方案中，所述受试者患有恶性高钙血症或转移性骨病(例如，骨肉瘤)。在其它实施方案中，所述受试者患有骨质疏松症。
[0052]在一个方面中，本发明提供钙调节肽，其包含:
[0053]a)包含5-20个在生理pH下带正电荷的氨基酸、氨基端、羧基端、和第一含有巯基的残基的聚阳离子肽；
[0054]其中所述聚阳离子肽在氨基端、羧基端或两端进行化学修饰；和
[0055]b)包含第二含有巯基的残基的货物肽；
[0056]其中所述第二含有巯基的残基与所述第一含有巯基的残基以二硫键键合。
[0057]在另一个方面中，本发明提供钙调节肽，其包含:
[0058]a)第一聚阳离子肽，其包含至少3个在生理pH下带正电荷的氨基酸、第一氨基端、第一羧基端、和第一含有巯基的残基； [0059]其中所述第一聚阳离子肽在第一氨基端、第一羧基端或两端进行化学修饰；和
[0060]b)第二聚阳离子肽，其包含至少3个在生理pH下带正电荷的氨基酸、第二氨基端、第二羧基端、和第二含有巯基的残基；
[0061]其中所述第二聚阳离子肽在第二氨基端、第二羧基端或两端进行化学修饰；
[0062]其中所述钙调节肽包含6-30个在生理pH下带正电荷的氨基酸。
[0063]在另一个方面中，本发明提供钙调节肽，其包含:
[0064]聚阳离子肽，其包含5-20个在生理pH下带正电荷的氨基酸、氨基端、羧基端、和第一含有疏基的残基；
[0065]其中所述聚阳离子肽在氨基端、羧基端或两端进行化学修饰；和
[0066]其中所述第一含有巯基的残基包含可以作为游离巯基或处于保护形式的巯基基团。
[0067]在一些这样的实施方案中，所述聚阳离子肽还包含第二含有巯基的残基，其与所述第一含有巯基的残基以二硫键键合。在这样的情形中，二硫键的形成构成环形聚阳离子钙调节肽。
[0068]在另一个方面中，本发明提供与聚乙二醇(PEG)缀合形成加入聚乙二醇的肽的本文所述的钙调节肽。在优选实施方案中，PEG具有约5kDa-约40kDa的平均分子量。
[0069]在另一个方面中，本发明提供包含本文进一步所述的钙调节肽和一种或多种药用赋形剂的药物组合物。
[0070]有效用于本发明方法的肽可以利用常规液相或固相技术进行化学合成，或可以重组产生。包含至少一种药用赋形剂和所述肽的药物组合物也考虑用于本文提供的方法。
[0071]本发明的方法可以有效用于治疗甲状旁腺功能亢进、骨病、和其它高钙血症。示例性的疾病包括但不限于:甲状旁腺功能亢进(原发性、继发性和三发性)、恶性高钙血症、转移性骨病、佩吉特病、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨软化、软骨钙质沉着病、软骨发育不全、骨软骨炎、囊性成骨不全、先天性低磷酸盐血症、纤维瘤性损伤、纤维性结构不良、多发性骨髓瘤、溶骨性骨病、假体周围骨质溶解、牙周病、骨质疏松症、异常骨转换、或其它形式的高转换骨病。
[0072]附图简述
[0073]图1显示在通过12-小时静脉内输注以12.5mg/kg给药KA1-1455的犬中PTH、血清钙和血清磷酸盐(iP)水平之间的关系。
[0074]图2显示通过12小时的静脉内输注以25mg/kg的剂量给药KA1-1455的犬中的血清钙水平，在12-小时输注过程中补充钙(2mg元素钙/kg/小时)，并且在EOI后3_6小时再次补充。
[0075]图3显示通过12小时的静脉内输注以25mg/kg的剂量给药KA1-1455的犬中的血清磷酸盐水平，在12-小时输注过程中补充钙(2mg元素钙/kg/小时)，并且在EOI后3_6小时再次补充。
[0076]图4显示通过12小时的静脉内输注以18，54，81和162mg/kg/小时的剂量施用KA1-1455的受试者中，KA1-1455在人血浆中的血浆药物代谢动力学。在给药前，给药过程中的I, 3，6，9，12小时时间点，以及在输注结束后的2，5，7，10，15，20，30和60分钟，确定KA1-1455 浓度(ng/mL)。
[0077]图5显示在通过12小时的静脉内输注以18，54，81和162mg/kg的剂量施用以1-1455的人中，在输注开始时、和在输注开始后3，6，9，12，15，18，21，24和48小时的离子化钙(mmol/L)。
[0078]图6显示在 通过12小时的静脉内输注以18，54，81和162mg/kg的剂量施用KA1-1455的人中，在输注开始时、和在输注开始后3，6，9，12，15，18，21，24和48小时的总钙(mg/dL)。
[0079]图7显示在通过12小时的静脉内输注以18，54，81和162mg/kg的剂量施用KA1-1455的人中，在输注开始时、和在输注开始后3，6，9，12，15，18，21，24和48小时的钙水
平的百分数变化。
[0080]图8显示在通过12小时的静脉内输注以18，54，81和162mg/kg的剂量施用KA1-1455的人中，在输注开始时、和在输注开始后3,6, 12，15，18，24和48小时的血浆PTH水平(pg/mL)。
[0081]图9显示在通过12小时的静脉内输注以18，54，81和162mg/kg的剂量施用KA1-1455的人中，在输注开始时、和在输注开始后3,6, 12，15，18，24和48小时的血浆PTH
水平的百分数变化。
[0082]图10显示在通过4小时的静脉内输注以54和108mg/kg的剂量施用KA1-1455的人中，在输注开始时、和在输注开始后2，3，4，6，8，12，16和36小时的离子化钙(mmol/L)。
[0083]图11显示在通过4小时的静脉内输注以54和108mg/kg/小时的剂量施用KA1-1455的人中，在输注开始时、和在输注开始后2，3，4，6，8，12，16和36小时的总钙(mg/dL)。
[0084]图12显示在通过4小时的静脉内输注以54和108mg/kg/小时的剂量施用KA1-1455的人中，在输注开始时、和在输注开始后2，3，4，6，8，12，16和36小时的血浆PTH水平(Pg/mL)。
[0085]图13显示在通过3小时的静脉内输注以9mg/kg/小时的给药速率施用KP-1524(SEQ ID NO:9)的麻醉大鼠(η = 4)中，在输注前、和在1，2，3和4小时的时间点的总钙(mg/dL)和血衆PTH (pg/mL)。
[0086]图14显示在通过3小时的静脉内输注以9mg/kg/小时的给药速率施用KP-9706 (SEQ ID NO: 6)的麻醉大鼠(η = 4)中，在给药前、和在I，2，3，4和24小时的时间点的总钙(mg/dL)水平。
[0087]图 15 显示在大鼠 EDTA 血浆中关于 KA1-1455(SEQ ID NO: 7)，KP-9706 (SEQ IDNO:6)和KP-9803(SEQ ID NO:8)的体外血浆稳定性数据。
[0088]发明详述
[0089]本发明涉及使用聚阳离子肽预防、治疗或改善甲状旁腺功能亢进、骨病和/或其它高钙血症的方法。
[0090]当用于本文时，除非另外指明，术语“甲状旁腺功能亢进”是指原发性、继发性和三发性甲状旁腺功能亢进。在一个优选的实施方案中，使用本发明的钙调节肽治疗患有继发性甲状旁腺功能亢进的受试者以降低血浆PTH水平。未治疗的患有中度严重性的甲状旁腺功能亢进的SHPT患者通常具有>300pg/ml的基线循环完整PTH水平，并且水平超过600pg/mL。在一个优选的实施方案中，血清PTH的减少测量为低于治疗前基线水平的完整PTH的减少。
[0091]当用于本文时，“钙调节肽”是包含一个或多个聚阳离子肽和总共3-30个在生理PH下带正电荷的氨基酸的肽，其中所述带正电荷的氨基酸包含在所述聚阳离子肽内，并且其中所述钙调节肽能够在一个或多个靶组织中、或在受试者中降低血清PTH和/或钙水平。在某些实施方案中，当将治疗有效量的钙调节肽施用给需要所述治疗的受试者时，所述钙调节肽能够降低血清PTH和/或血清钙水平。在优选实施方案中，所述钙调节肽包含5-20个在生理pH下带正电荷的氨基酸。在特别优选的实施方案中，所述钙调节肽包含6 - 12个在生理pH下带正电荷的氨基酸。本发明的钙调节肽包含总共约4-35个氨基酸残基，包括带正电荷的氨基酸残基。
[0092]在某些实施方案中，本发明的钙调节肽包括聚阳离子肽和货物肽，每一个包括包含巯基的残基，其中所述包含巯基的残基通过二硫键连接。
[0093]在其它实施方案中，所述钙调节肽包括两个聚阳离子肽，每个包括包含巯基的残基，所述残基通过二硫键连接。在一些这样的实施方案中，所述第一聚阳离子肽和第二聚阳离子肽是相同的，以致二硫键的形成构成同型二聚体结构。在其它实施方案中，所述第一聚阳离子肽和第二聚阳离子肽是不同的，以致二硫键的形成构成异型二聚体结构。
[0094]在其它实施方案中，所述钙调节肽包含单一聚阳离子肽和至少一个包含巯基的残基，其中所述包含巯基的残基含有游离的巯基或所述巯基部分以被保护的形式存在。在一些这样的实施方案 中，所述钙调节肽包含单一聚阳离子肽和两个彼此以二硫键键合的包含巯基的残基，(即，所述巯基部分以二硫化物基团被内部“保护”)，其中二硫键的形成提供环形的钙调节肽。
[0095]当用于本文时，“聚阳离子肽”是指包含2-30个在生理pH下带正电荷的氨基酸、和至少一个包含巯基的残基的肽，其中所述聚阳离子肽在肽的氨基端、羧基端、或两端进行化学修饰(即，“加帽的”)。
[0096]聚阳离子肽可以在长度上总共3-25个氨基酸残基、优选地总共5-25个氨基酸残基变化，并且可以由单重复的带正电荷的氨基酸残基组成，或可以包含多个天然的或非天然的氨基酸残基。在优选实施方案中，所述聚阳离子肽包含5-20个带正电荷的氨基酸、优选5-15个带正电荷的氨基酸、更优选地包含6-12个带正电荷的氨基酸。
[0097]在一些实施方案中，所述钙调节肽仅包含一个聚阳离子肽。在其它实施方案中，所述钙调节肽包含两个聚阳离子肽，其中每一个优选地包含3-10个带正电荷的氨基酸。
[0098]优选的聚阳离子肽包括TAT-衍生的肽，例如具有SEQ ID N0:5的序列的加帽的Cys-TAT肽或具有SEQ ID NO: 29的序列的截短的肽。还优选包括3_7个精氨酸残基的聚阳离子肽。在一些实施方案中，所述精氨酸残基是连续的，诸如具有SEQ ID N0s:19-26的序列的加帽的聚精氨酸肽。在其它实施方案中，所述聚阳离子肽可以包含不连续的3-7个精氨酸残基，诸如具有SEQ ID N0:32的肽。
[0099]当用于本文时，术语“带正电荷的氨基酸”是指在生理pH下(在血浆中~7.4)带正电荷的氨基酸残基。
[0100]带正电荷的氨基酸独立地选自生理pH下带正电荷的天然的或非天然的具有L-或D-构型的氨基酸，或它们的外消旋物，或它们具有任何手性纯度程度的混合物。在一些实施方案中，所述带正电荷的氨基酸选自天然的氨基酸。在其它实施方案中，所述带正电荷的氨基酸选自天然的和/或非天然的氨基酸。在具体实施方案中，所述带正电荷的氨基酸独立地选自由下列各项组成的组:组氨酸、赖氨酸、精氨酸、2，3- 二氨基丙酸(Dap)、2，4- 二氨基丁酸(Dab)、鸟氨酸、和高精氨酸。
[0101]当治疗肽进入受试者的血浆中时，它变得易受肽酶的攻击。外肽酶是典型的非特异性酶，其从肽或蛋白的 氨基或羧基末端裂解氨基酸残基。内肽酶，其在氨基酸序列内部裂解，也可以是非特异性的；然而，内肽酶通常识别特定的氨基酸序列(识别位点)并且在这些位点处或附近裂解肽。
[0102]一种保护肽组合物免于蛋白水解降解的方法包括“化学修饰”或“加帽”肽的氨基和/或羧基末端。当用于本文时，术语“化学修饰”或“加帽”可互换使用，指通过共价修饰向肽的末端引入保护基团。适当的保护基团在不减小肽的生物学活性的条件下起作用给肽的末端加帽。
[0103]不希望受到理论束缚，据信将所述聚阳离子肽的至少一端加帽对于获得充分的血浆稳定性和暴露以在体内获得治疗相关的PTH水平和/或钙减少是重要的。所述保护或“加帽”基团可以有效用来保护肽免于受到血清蛋白酶的蛋白水解降解。
[0104]将所述肽的氨基末端乙酰化是一种包含该肽免于蛋白水解降解的优选方法。将所述肽的羧基末端酰胺化也是一种保护所述肽免于蛋白水解降解的优选方法。然而，其它的加帽基团是可能的。例如，氨基端可以通过酰基化或磺酰化形成酰胺或磺酰胺而被加帽。类似地，羧基端可以被酯化、或转化成仲酰胺、和酰基磺酰胺等。在一些实施方案中，所述氨基端或羧基端可以包含PEG化位点，即，氨基或羧基端可以通过与适当官能化的PEG反应而化学修饰。
[0105]保护肽免受内肽酶作用典型地包括鉴定并消除肽的内肽酶识别位点。蛋白酶识别位点是本领域普通技术人员公知的。因此，可以鉴定潜在的内肽酶识别位点，并且然后通过改变所述识别位点内的氨基酸序列而消除所述位点。可以移动或去除在识别序列内的残基以破坏识别位点。优选地，对鉴定的蛋白酶识别位点包括的一个或多个氨基酸进行保守取代。[0106]在优选实施方案中，聚阳离子肽的氨基端通过乙酰化化学修饰以提供N-乙酰基肽。在更优选的实施方案中，聚阳离子肽的羧基端通过酰胺化化学修饰，以在C-端提供伯羧酰胺。在特别优选的实施方案中，氨基端和羧基端均分别通过乙酰化和酰胺化被加帽。
[0107]当用于本文时，术语“包含巯基的残基”是指包含巯基的氨基酸或包含巯基的化合物，其包括氨基基团和/或羧基基团，以致其可以结合到多肽中，其中所述巯基基团可以处于被保护的或未被保护的形式，并且当所述巯基基团处于其游离形式时，其能够形成二硫键。
[0108]包含巯基的残 基的代表性实例包括，例如，半胱氨酸、高半胱氨酸、和巯基丙酸。当所述包含巯基的残基包含手性中心时，它可以以L-或D-构型存在，或作为外消旋物，或以任何手性纯度程度存在。在常见的实施方案中，所述包含巯基的残基包括半胱氨酸或高半胱氨酸。
[0109]所述包含巯基的残基可以位于聚阳离子肽链的任何位置，包括氨基端、羧基端、或一些其它的位置。为了化学合成的便利，包含巯基的残基通常利用包含处于被保护形式的包含巯基部分的结构单元偶联到肽链上。
[0110]在一些实施方案中，在聚阳离子肽和货物肽之间、或在第一和第二聚阳离子肽之间形成二硫键的包含巯基的残基是相同的(即，半胱氨酸-半胱氨酸，或高半胱氨酸-高半胱氨酸)。在其它实施方案中，所述两个包含巯基的残基可以是不同的。
[0111]在某些实施方案中，所述包含巯基的氨基酸可以处于被保护的形式。用于巯基部分的适当的保护基团包括，例如，硫酯衍生物，特别是硫代乙酰或硫代苯甲酰基类似物；硫代碳酸酯；半硫缩醛，诸如1-乙氧基乙基，甲氧基甲基和聚甲醛硫醚；和二硫化物保护基团，诸如在包含巯基的残基的游离巯基和取代的或未取代的苯硫酚部分之间形成的二硫化物。
[0112]在一些实施方案中，所述巯基保护基团可以在体内裂解。所述被保护的包含巯基的残基可以作用为前体药物，掩蔽游离的巯基并且修饰包括这样的被保护的包含巯基的残基的钙调节肽的物理化学、药物代谢动力学和/或药效特征。
[0113]连接包含巯基的残基可以放置在所述聚阳离子肽和/或货物肽的序列中的任何位置。例如，在某些实施方案中，所述第一和第二包含巯基的残基可以位于两个聚阳离子肽的氨基端，或在其它实施方案中，位于聚阳离子肽和货物肽的氨基端。连接包含巯基的残基可以放置在所述肽的羧基端，或备选地在所述聚阳离子肽和货物肽中之一的氨基端，和在另一个肽的羧基端。备选地，连接包含巯基的残基可以放置在聚阳离子肽和/或货物肽中的任一个或二者的序列内的任何位置处。
[0114]在一些实施方案中，第一包含巯基的残基位于第一聚阳离子或聚阳离子肽的氨基端或羧基端。在其它实施方案中，所述第一含有巯基的残基位于除第一聚阳离子或聚阳离子肽的氨基端或羧基端之外的位置。在一些实施方案中，第二含有巯基的残基位于第二聚阳离子或货物肽的氨基端或羧基端。在其它实施方案中，第二含有巯基的残基位于除第二聚阳离子或货物肽的氨基端或羧基端之外的位置。
[0115]在一个优选的实施方案中，所述第一和第二含有巯基的残基都是半胱氨酸残基。在其它实施方案中，还可以使用高半胱氨酸类似物来在两个聚阳离子肽之间或在聚阳离子肽和货物肽之间形成二硫键。例如，高半胱氨酸的应用可以在货物肽、聚阳离子肽或在二者中使用，并且可以稳定该组合物并且减少二硫键交换。其它半胱氨酸同系物也有效用于二硫键形成。类似地，半胱氨酸和高半胱氨酸的立体异构体将抑制二硫键的交换。
[0116]在一些实施方案中，第二含有巯基的残基是所述聚阳离子肽中的另一个残基，以致在第一和第二含有巯基的残基之间形成二硫键构成环形的聚阳离子肽。
[0117]当用于本文时，术语“货物肽”是指5-25个氨基酸的肽，其包含第二含有巯基的残基。在常见的实施方案中，所述货物肽通过在第一和第二含有巯基的残基之间形成分子间二硫键而与所述聚阳离子肽共价连接。在一些情形中，所述货物肽可以包含带正电荷的氨基酸残基。然而，存在带正电荷的氨基酸残基不是货物肽的必需特征。在某些实施方案中，所述货物肽包含同工酶特异性PKC调节肽。
[0118]当用于本文时，当化合物作用在参与骨重建和/或钙体内稳态的特定的PKC同工酶时，该化合物是“同工酶-特异性的”，其与不能区分PKC同工酶的非特异性肽或化合物相反。
[0119]当用于本文时，“PKC调节肽”定义为能够在一个或多个靶组织中完全或部分激活或抑制PKC同工酶活性的化合物。PKC调节肽可以在不同组织中表现出不同的同工酶特异性、激活剂或抑制剂活性和/或激活剂或抑制剂活性水平(完全或部分的)。
[0120]在一些实施方案中，所述货物肽是PKC调节肽，其中所述PKC调节肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括与选自由SEQ ID NOs:1和2组成的组的肽大于50%的序列同一性。在其它方法中，所述PKC调节肽包括包含选自由SEQ ID NOs:1和2组成的组的肽的5-9个连续残基的氨基酸序列。在某些方法中，所述PKC调节肽包括选自由SEQ ID NOsil和2组成的组的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述货物肽是PKC调节肽，其中所述PKC调节肽包括包含与已知具有PKC调节活性的肽的大于50%的序列同一性的氨基酸序列。
[0121]在其它实施方案中，本发明的钙调节肽包括包含与选自由SEQ ID NOs:6, 7,8,9, IO, 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，28，28，31，和 32 组成的组的肽的大于50 %的序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述钙调节肽包括包含选自由SEQID NOs: 6, 7，8，9，10，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，28，28，31，和 32组成的组肽的6-15个连续残基的氨基酸序列。在某些方法中，所述钙调节肽包括选自由SEQ ID NOs:7,9, 10，和12组成的组的氨基酸序列。
[0122]在具体实施方案中，所述钙调节肽包括与货物肽二硫键键合的聚阳离子肽，如本文进一步所述。在优选实施方案中，所述钙调节肽选自具有SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQID NO: 10，或 SEQ ID NO: 12 的序列的肽。
[0123]在其它实施方案中，所述钙调节肽包括与第二聚阳离子肽二硫键键合的第一聚阳离子肽，如本文进一步所述。在优选实施方案中，所述钙调节肽选自具有SEQ ID NO: 13, SEQID NO: 15，SEQ ID NO: 16，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO: 18 的序列的肽。
[0124]在其它实施方案中，所述钙调节肽包括包含第一含有巯基残基的单个聚阳离子肽，其中所述巯基基团以被保护的或未保护的形式存在，如本文进一步所述。在一些这样的实施方案中，所述钙调节肽还包括第二含有巯基的残基，以致二硫键的形成构成环形肽。在优选实施方案中，所述钙调节肽选自具有SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14, SEQ IDNOs:19-26, SEQ ID N O:29,或 SEQ ID N0:32 的序列的肽。
[0125]KA1-1455(SEQ ID NO: 7)包含同工酶-特异性PKC调节肽作为货物肽。包含其它货物肽的钙调节肽，例如，KP-1524(SEQ ID N0:9)，也在大鼠中以与KA1-1455相似的水平(实施例11和12)显著降低总钙和PTH水平。不希望受到理论束缚，与货物肽连接二硫化物作用为前体药物以在体内保护所述聚阳离子肽，延长其在血浆内作用的持续时间是可能的。不希望受到理论束缚，所述货物肽可以提供提高或稳定钙和PTH调节活性的前体药物形式是可能的。
[0126]本发明的钙调节肽包括至少一个包含巯基的残基，其中所述巯基基团可以作为游离巯基、被保护的巯基存在，或可以与作为第二含有巯基的残基二硫键键合。在常见的实施方案中，所述钙调节肽包括至少两个彼此二硫键键合的包含巯基的残基。
[0127]包含具有游离巯基基团的单个包含巯基的残基的钙调节肽表现出与KA1-1455所示的水平相当的水平的体外活性。例如，具有包含游离巯基的N-端半胱氨酸残基的加帽的TAT-衍生的肽(SEQ ID N0:5)，当在体外检测时，表现出与KA1-1455相当的活性。
[0128]包括具有游离的巯基基团的单一包含巯基的残基的钙调节肽本身可以有效用于本发明的方法，或所述巯基基团可以作为前体药物施用，其通过如本文进一步所述将所述游离的巯基基团保护在可在体内裂解的保护基团内。在对包含巯基的治疗剂的保护领域中，所述基团是已知的。
[0129]在另一个方面中，本发明提供包含聚阳离子肽(如本文进一步所述)和至少一种药用赋形剂的药物组合物。
[0130]在另一个方面中，本发明提供用于治疗甲状旁腺功能亢进、高钙血症和/或骨病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的钙调节肽，并且还包括用治疗有效量的选自由下列各项组成的组的试剂治疗受试者:抗再吸收的二膦酸盐试剂、整联蛋白阻断剂、激素替代治疗 剂、选择性雌激素受体调节剂、组织蛋白酶K抑制剂、维生素D治疗、消炎剂、低剂量PTH治疗、降钙素、RANK配体的抑制剂、针对RANK配体的抗体、护骨蛋白、adensosine拮抗剂和ATP质子泵抑制剂。
[0131]在本发明的另一个方面中，所述钙调节肽以有效减小血清PTH或PTH作用的量施用。
[0132]在一些实施方案中，血清PTH的减少为低于基线治疗前水平至少1%，2%，3%，4%, 5%, 6%, 7%,8%,9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%或30%，在施用所述钙调节肽后持续至少10小时。在具体实施方案中，血清PTH的减少在施用后10小时是至少20%。在优选实施方案中，血清PTH的减少是低于基线治疗前水平15-40%，优选地20-50%，更优选地30-70%，在施用所述钙调节肽后持续至少48小时。
[0133]在本发明的另一个方面中，所述钙调节肽以有效减少血清钙或钙作用的量施用。
[0134]在一些实施方案中，所述血清钙的减少低于基线治疗前水平至少1% ,2%,3%,4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ,20%或25%，在施用所述钙调节肽后持续至少10小时。在优选实施方案中，血清钙的减少在施用后10小时为至少5%。在优选实施方案中，血清钙的减少是低于基线治疗前水平5-10%，优选地5-20%，在施用所述钙调节肽后持续至少48小时。
[0135]在另一个方面中，本发明提供用于在需要其的受试者中治疗甲状旁腺功能亢进和/或高钙血症的方法，所述方法包括:施用治疗有效量的聚阳离子肽，所述聚阳离子肽包括与选自由 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10,或 SEQ ID NO: 12 组成的组的肽有大于50%的序列同一性的氨基酸序列，由此减少血清PTH和/或钙。
[0136]在本申请内，除非另外阐明，术语的定义和本申请技术的举例说明可以在一些公知的参考文献中的任一种中找到，诸如:Sambix)0k，J.，等，分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press) (1989) ；Goeddel, D.,编，基因表达技术(Gene ExpressionTechnology),酶学方法(Methods in Enzymology), 185,学院出版社(Academic Press),圣地亚哥,CA(1991);“蛋白纯化指南” (“Guide to Protein Purification”)在Deutshcer, Μ.P.,编，酶学方法(Methods in Enzymology)中，学院出版社(AcademicPress),圣地亚哥，CA(1989) ；Innis,等，PCR 方法:方法和应用指南(PCR ProtocolsiAGuide to Methods and Applications),学院出版社(Academic Press),圣地亚If, CA (1990) ；Freshney, R.1.，动物细胞培养:基础技术手册(Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique),第 2 版，Alan Liss,公司.纽约，纽约(1987) ；Murray, Ε.J.，编，基因转运和表达方法(Gene Transfer and Expression Protocols),第 109-128页，The Humana Press 公司.，Clifton, NJ 和 Lewin, B.，基因 VI (Genes VI),牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约(1997)。
[0137]通过参考下述本发明优选实施方案以及其中包括的实施例的详细描述可以更容易地理解本发明。 然而，在公开和描述本方法之前，应该理解，本发明不限于特定的核酸、特定的多肽、特定的细胞类型、特定的宿主细胞、特定的条件、或特定的方法等等，当然其可以变化，并且对于本领域技术人员来说，其中的各种改进和变化是显而易见的。还应该理解，本文所用的术语仅是出于描述具体实施方案的目的，并不意欲限制。还应该理解，除非在本文中专门限定，本文所用的术语给出相关领域已知的常规意思。
[0138]当用于本文时，单数形式“一种(a) ”，“一种(an) ”，和“所述(the) ”包括复数引用，除非另外指明。例如，“一种”调节肽包括一种或多种调节肽。
[0139]当用于本文时，〃治疗有效量〃是产生理想的治疗效果所需要的量。例如，在高钙血症的受试者中减少血清钙的方法中，治疗有效量是将血清钙水平减少至少1%，2%,3%,4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11% , 12% , 13% , 14% , 15% , 16% , 17% , 18% , 19% , 20%或25%所需要的量。
[0140]当用于本文时，“受试者”是指患有高钙血症和/或骨病的人或动物受试者。
[0141]当用于本文时，〃肽〃和〃多肽〃可互换使用，并且是指由肽键连接的氨基酸残基链组成的化合物。除非另外指明，肽的序列以从氨基端到羧基端的顺序提供。
[0142]为了确定两个氨基酸序列的百分数同源性，为了最佳比较目的(例如，为了与另一个多肽最佳比对，可以在一个多肽序列中引入缺口)，比对所述序列。然后比较在相对应的氨基酸位置处的氨基酸残基。当在一个序列中的位置被与另一个序列相对应位置处相同的氨基酸残基占有时，那么所述分子在该位置处是相同的。当用于本文时，氨基酸或核酸“同源性”等价于氨基酸或核酸“同一性”。因此，在两种序列之间的序列同一性百分数是由所述序列共有的相同位置的数目的函数(即，序列同一性百分数=相同位置的数目/位置总数xlOO)。
[0143]为了本发明的目的，使用载体NTI6.0(PC)软件包(InforMax.7600WisconsinAve.，Bethesda, MD20814)确定在两种多肽序列之间的序列同一11"生百分数。使用缺口开口罚分10和缺口延长罚分0.1而确定两种多肽之间的同一性百分数。所有其它的参数设置为默认的设置。
[0144]如果它具有与亲本肽或多肽的至少5个氨基酸残基的连续序列相同或相似的氨基酸序列，那么肽或肽片段“衍生于”亲本肽或多肽。
[0145]当用于本文时，“保守氨基酸取代”是不引起所选择的多肽或蛋白质的活性或三级结构的显著变化的取代。这样的取代典型地包括将所选择的氨基酸残基用具有相似的物理化学性质的不同的残基替换。通过物理化学性质对氨基酸分组是本领域的技术人员已知的。例如，在本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，并且其包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β -支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
[0146]本发明的另一个方面涉及分离的多肽、及其生物活性部分的应用。当用于本文时，当通过重组DNA技术产生时，“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分不含一些细胞物质，或者当化学合成时，其不含化学前体或其它化学品。表述“基本上不含细胞物质”包括这样的多肽的制备物，其中所述多肽与它在其中天然或重组产生的细胞的一些细胞成分分离。
[0147]当所述多肽或其生物活性部分重组产生时，它还优选地基本上不含培养基，即，培养基具有小于约20%， 更优选地小于约10%，并且最优选地小于约5%的所述多肽制备物的体积。表述“基本上不含化学前体或其它化学品”包括这样的多肽的制备物，其中所述多肽与参与所述多肽合成的的化学前体或其它化学品分离。在一个实施方案中，表述“基本上不含化学前体或其它化学品”包括具有小于约30% (干重)的化学前体或其它化学品，更优选地小于约20%的化学前体或其它化学品，还更优选地小于约10%的化学前体或其它化学品，并且最优选地小于约5%的化学前体或其它化学品的多肽的制备物。在优选的实施方案中，分离的多肽、或其生物活性部分不含来自domain多肽来源的同一生物体的污染多肽。
[0148]用于使所述聚阳离子肽与所述货物肽缀合的非限制性方法包括通过二硫键缀合，和作为单链或线性多肽合成。所述聚阳离子肽还可以通过接头与货物肽缀合。在一些实施方案中，所述接头是1-5个氨基酸的肽，2-4个氨基酸的肽，或2-3个氨基酸的肽。
[0149]PKC同工酶的肽调节剂
[0150]先前已经描述了 PKC同工酶的多种肽调节剂。例如，美国专利号5，783，405描述了多种调节PKC同工酶，包括β、θ、δ、ε、和Y同工酶的活性的肽。待审美国专利申请号10/843,271描述了 SPKC调节肽及其衍生物。美国专利号6，165，977描述了 ε PKC调节肽及其衍生物。美国专利号6，855，693描述了来自α，β I，β II，Υ，δ，ε，η，μ，O，和ζ同工酶的多种调节肽以及修饰的片段。每一专利和专利申请通过引用完全结合于此。
[0151]PKC同工酶-特异性抑制肽可以衍生自位于特定的同工酶的C2/V1结构域中的特异性RACK-结合位点。同工酶-特异性肽调节剂可以衍生自在每种PKC同工酶中与相对应的RACK序列相似的假RACK ( ΨRACK)序列。据信UrRACK序列与PKC的RACK结合位点形成分子内相互作用，稳定无活性或“闭合的”构象。干扰该分子内相互作用的肽可以使所述无活性形式不稳定，增强PKC的易位和RACK结合。Chen等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sc1.)2001 ;98:11114-11119。
[0152]同工酶-特异性肽调节剂可以缀合到有效促进肽穿过细胞膜转运的载体部分上。所述载体部分的实例包括，但不限于，TAT-衍生的肽、触角载体肽、和聚精氨酸肽。已经报道TAT-缀合的肽通过循环有效递送至器官中，并且与基因靶向递送相比，该递送形式可以提供优点，原因在于递送是即时的，并且因此较不易受由信号转导调节剂诱导的适应性的影响。
[0153]ψ ε RACK，其包括氨基酸序列HDAPIGYD(SEQ ID NO:1)，是一种同工酶-选择性肽，设计结合并且‘稳定’ ε PKC成为暴露RACK结合位点的构象，由此使得ε PKC能够与其RACK结合。Ψ eRACK在几种重要的方式上不同于PKC的小分子激活剂(诸如二酰基甘油(DAG)或佛波醇酯)。第一，与DAG或佛波醇酯相比较，Ψ eRACK结合ε PKC上不同的位点。第二，VeRACK仅结合在ε PKC同种型中为该同种型特有的位点，而DAG和佛波醇酯结合所有PKC共有的位点。Ψ eRACK的这种特异性赋予与非选择性分子相比显著的优点。最后，Ψ ε RACK处理导致ε PKC易位中的适度生理改变，即使在施用延长的时间期间时。这些数据表明，Ψ ε RACK加强ε PKC的活性，但是没有直接激活PKC，该方式中PKC由DAG激活。
[0154]已经报道ε PKC的易位在局部缺血的预先调节中起重要作用。VeRACK(SEQ IDNO:1)在体内和离体表现出针对局部缺血-再灌注损伤的心脏保护作用，并且在没有引起ε PKC脱敏或下调的条件下，减少在局部缺血-再灌注过程中致死性心律不齐的发生。
[0155]还已经报道ε PKC在调节神经、内分泌、外分泌、炎症、和免疫系统的活化中起作用。控制的ε PKC激活可能在阿尔茨海默病的发展中起保护作用，而其不受控制的慢性激活可能导致严重的疾病，如恶性肿瘤和糖尿病。
[0156]为了促进穿过生物膜转运，可以将包括氨基酸序列CHDAPIGYD(SEQ ID NO:2)的包含N-端半胱氨酸的Ψ eRACK肽与聚阳离子肽共价连接。
[0157]制备了 ε-PKC调节肽(SEQ ID NO: 6)，其包括通过二硫键与TAT (SEQ ID NO: 4)缀合的肽SEQ ID NO: 2，并且制备了钙调节肽(SEQ ID NO: 7)，其包括通过二硫键与N-酰基化C-酰胺化的TAT (SEQ ID NO: 5)缀合的肽SEQ ID NO: 2。包括SEQ ID NO: 7的肽，本文也称为ΚΑΙ-1455 (或ΚΡ-1455)，具有下文所示的结构。
[0158]