大分子活性胶原蛋白的制备方法[0002]胶原蛋白是具有独特结构的一族蛋白质，广泛存在于哺乳动物组织中，约占总蛋白质的30%以上。胶原蛋白为骨、皮肤、肌腱和韧带提供生物力学性能、控制发育中的细胞基因表型。胶原蛋白的结构呈三股螺旋结构，由三条多肽链组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型，三条左手螺旋α-链又互相缠成右手螺旋结构一即超螺旋结构。单个α-链含有至少一个Gly-X-Y序列。每三个氨基酸就有一个甘氨酸残基。胶原蛋白的特有结构和化学组成使其具有许多独特性质和功能。这些性质和功能使其在各个领域得到了广泛应用，如生物医学材料、药物输送载体、组织工程、化妆品和食品等领域。[0003]目前，国内活性胶原蛋白虽有科研单位进行了研究和开发，并有一些活性胶原蛋白提取工艺方面的专利与报道，但目前离产业化水平仍有一定差距，只限于少数几家公司能够进行中试或小规模试生产。由于活性胶原蛋白产业化水平较低，限制了它的下游产品开发与应用。目前，活性胶原蛋白在保健食品、化妆品领域中的应用有大量报道和销售，但对于医用级大分子量活性胶原蛋白的提取技术仅处于小规模水平。
[0004]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种大分子活性胶原蛋白的制备方法。[0005]本发明采用的技术方案为:一种大分子活性胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤: 一、鱼皮的预处理 选取新鲜鱼皮，100重量份，水洗去肉后，加入20-30% NaCI (0.05Μ Tris-HCI,ρΗ7.5)溶液中(1:20-40，w/v)均质5-lOmin，用转速为10000-15000rpm高速冷冻离心机离心10-25min，取沉淀，重复上述操作，直到没有浮游脂肪和气泡产生，然后用去离子水清洗；
二、活性胶原蛋白的提取
将预处理后的鱼皮加入预冷的去离子水中(1:5 O -10 O，w/ V )，冰浴，加入乙酸至0.5-1.0M超声10-25min,超声波功率300-600W,加入0.1-0.5重量份胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一种或数种，酶解5-8h，离心，取上清，所得沉淀加去离子水(1:50-100)，调pH值至中性，加入0.1-0.5重量份中性蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或两种，酶解3-6h，离心，取上清，合并两份上清，得胶原蛋白溶液；
三、活性胶原蛋白溶液的纯化
选孔径为10-50nm的超滤膜浓缩上述胶原蛋白溶液，加入NaCl至终浓度为0.5-1.3M，盐析过夜，然后离心10-30min，取沉淀，沉淀再次用0.5-1M乙酸溶解后，离心l_2h，取上清，对0.1-0.2M乙酸透析脱盐，用100-200nm孔径的超滤膜去除小分子物质和多肽，得到浓度为20-50%的大分子活性胶原蛋白溶液。
[0006]有益效果:本发明通过超声波、乙酸和复合酶的协同作用提取胶原蛋白，并综合运用盐析、透析和超滤技术制得大分子活性胶原蛋白溶液，并能稳定存在。

[0007]下面对本发明的进行详细的说明。
[0008]实施例1:选取新鲜鱼皮，100重量份，水洗去肉后，加入20% NaCI (0.05MTris-HCI, pH7.5)溶液中(1:20, w/v)均质5min,用转速为1000Orpm高速冷冻离心机离心lOmin，取沉淀，重复上述操作，直到没有浮游脂肪和气泡产生，然后用去离子水清洗。将预处理后的鱼皮加入预冷的去离子水中(1:50, w/v),冰浴,加入乙酸至0.5M超声IOmin,超声波功率300W。加入0.1重量份胃蛋白酶，酶解5h，离心，取上清。所得沉淀加去离子水(1:50)，调pH值至中性，加入0.1重量份中性蛋白酶，酶解3h，离心，取上清。合并两份上清，得胶原蛋白溶液。选孔径为IOnm的超滤膜浓缩上述胶原蛋白溶液，加入NaCl至终浓度为0.5M,盐析过 夜,然后离心IOmin,取沉淀。沉淀再次用0.5M乙酸溶解后，离心Ih,取上清，对0.1M乙酸透析脱盐，用IOOnm孔径的超滤膜去除小分子物质和多肽，得到浓度为20%的大分子活性胶原蛋白溶液。
[0009]实施例2:选取新鲜鱼皮，100重量份，水洗去肉后，加入30% NaCI (0.05MTris-HCI, pH7.5)溶液中(1:40, w/v)均质IOmin,用转速为15000rpm高速冷冻离心机离心25min，取沉淀，重复上述操作，直到没有浮游脂肪和气泡产生，然后用去离子水清洗。将预处理后的鱼皮加入预冷的去离子水中(1: 100, w/v),冰浴,加入乙酸至1.0|/[超声251]1；[11,超声波功率600W。加入0.5重量份胃木瓜蛋白酶，酶解8h，离心，取上清。所得沉淀加去离子水(1:100)，调pH值至中性，加入0.5重量份菠萝蛋白酶，酶解6h，离心，取上清。合并两份上清，得胶原蛋白溶液。选孔径为50nm的超滤膜浓缩上述胶原蛋白溶液，加入NaCl至终浓度为1.3M，盐析过夜，然后离心30min，取沉淀。沉淀再次用IM乙酸溶解后，离心2h，取上清，对0.2M乙酸透析脱盐，用200nm孔径的超滤膜去除小分子物质和多肽，得到浓度为50%的大分子活性胶原蛋白溶液。
[0010]实施例3:选取新鲜鱼皮，100重量份，水洗去肉后，加入25% NaCI (0.05MTris-HCI, pH7.5)溶液中(1:30, w/v)均质8min,用转速为12000rpm高速冷冻离心机离心20min,取沉淀，重复上述操作，直到没有浮游脂肪和气泡产生，然后用去离子水清洗；将预处理后的鱼皮加入预冷的去离子水中(1:70, w/v),冰浴,加入乙酸至0.8M超声20min,超声波功率400W，加入0.3重量份胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一种或数种，酶解6h，离心，取上清，所得沉淀加去离子水(1:80)，调pH值至中性，加入0.3重量份中性蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或两种，酶解5h，离心，取上清，合并两份上清，得胶原蛋白溶液；选孔径为30nm的超滤膜浓缩上述胶原蛋白溶液，加入NaCl至终浓度为0.9M，盐析过夜，然后离心20min，取沉淀，沉淀再次用0.8M乙酸溶解后，离心1.5h，取上清，对0.15M乙酸透析脱盐，用150nm孔径的超滤膜去除小分子物质和多肽，得到浓度为30%的大分子活性胶原蛋白溶液。[0011]应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技·术加以实现。