专利名称：用于诱导特异性免疫耐受的组合物的制作方法用于诱导特异性免疫耐受的组合物本发明涉及在宿主中诱导针对肽或蛋白质活性物质(active principle)的免疫耐受的组合物，特别地针对治疗性肽、多肽或蛋白质，肽或蛋白质自身抗原，诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质，或者肽或蛋白质移植抗原。本发明还涉及治疗哺乳动物(包括人)的方法。已知肝脏有助于诱导免疫耐受。这一点可以通过肝脏中食物抗原的耐受以及对肝脏异体移植的接受来举例证明。对某些递送到肝脏的外源性抗原的抗原特异性耐受也可以证明。E. Breous等的文章H印atology，August 2009，612至621页报道了肝脏调节T细胞和枯否氏细胞是对靶向鼠肝脏之抗原的全身性T细胞耐受性的重要中介物。他们报道了在肝靶向基因转移模型中细胞毒T淋巴细胞对非自身抗原的应答受到肝脏调节T细胞的控制，肝脏调节T细胞应答于所述抗原而分泌免疫抑制性细胞因子白介素IL-10。此外，在此背景下，使得枯否氏细胞(Kupffer cell)致耐受而不是产生免疫应答。枯否氏细胞的致耐受作用也由C. Ju等报道，Chem. Res. Toxicol. 2003，16 :1514 1519。另外参见 Α. H. Lau 等 Gut 2003，52 1075 1078。本发明的目的是提供可用于诱导针对多种肽或蛋白质活性物质的免疫耐受的组合物。特别地，其目的是提供针对一种或多种肽或蛋白质活性物质的特异性免疫耐受。因此，本发明的一个目的是在宿主中诱导针对肽或蛋白质活性物质的免疫耐受的组合物，所述组合物包含含有所述活性物质的红细胞。此活性物质可以是治疗性肽、多肽或蛋白质，肽或蛋白质自身抗原，诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质，肽或蛋白质移植抗原，以及其混合物。所述活性物质可以是天然的、合成的或重组来源的。“含有”分子旨在涵盖含有目的肽、多肽或蛋白质以及另一部分的分子，所述另一部分可以是任何来源并且对于所述肽、 多肽或蛋白质的作用无害。例如，这些部分包括半抗原。不受理论的约束，认为本发明的组合物诱导抗原特异性调节T细胞(Treg)并且产生免疫抑制细胞因子或白细胞介素，特别是IL-10。生物的和/或来源于生物技术的肽、多肽或蛋白质越来越多被用作治疗剂。然而， 公认这些物质可诱导体液和/或细胞免疫应答。针对这些治疗剂的免疫反应的后果多种多样从没有任何临床意义的抗体短暂出现到严重威胁生命的状况。潜在的临床后果是严重的过敏性反应、疗效降低和诱导自身免疫(包括针对所述肽、多肽或蛋白质之内源形式的抗体)。(European Medicines Agency, Committee for Medicinal products for human use (CHMP)，Guidelines on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins, Draft, London,24 January 2007)0治疗性肽、多肽或蛋白质定义为有效治疗疾病的肽、多肽或蛋白质，或者是含有有效治疗疾病之分子的肽、多肽或蛋白质，所述疾病尤其是通过施以该分子可得到纠正的缺陷所引起的疾病。在一个实施方案中，所述治疗性肽、多肽或蛋白质为抗体。涵盖其任何片段。在另一个实施方案中，所述治疗性肽、多肽或蛋白质为凝血因子。涵盖其任何片段。在另一个实施方案中，所述治疗性肽、多肽或蛋白质为酶。涵盖其任何片段。在另一个实施方案中，所述治疗性肽、多肽或蛋白质为生长因子。涵盖其任何片段。术语片段用于涵盖已知代替整个分子来有效治疗相关疾病的肽、多肽或蛋白质的任何片段。这些定义也涵盖糖基化形式。在一个实施方案中，所述活性物质为溶酶体酶。所述溶酶体酶可以是用于通过酶替代疗法(enzyme replacement therapy, ERT)治疗或纠正溶酶体储积症的酶，所述溶酶体储积症包括庞贝氏症(pompe disease)(糖原贮积病II型(Glycogen storage disease type II))、法布瑞氏症(Fabry disease)和粘多糖储积症(Mucopolysaccharidose)MPS I。 例如-α葡萄糖苷酶(alphaglucosidase)，如治疗庞贝氏症的Myozyme ；-拉罗尼酶(Iaronidase)，如治疗MPS I 的 Aldurazymen0 ；-α 半乳糖昔醇 A(alphagalactosidase Α)或阿力口糖醇 α (agalsidase alpha), 如治疗法布瑞氏症的Fabrazyme 和R印lagal 。在另一个实施方案中，所述活性物质为可用于治疗血友病的凝血因子。所述凝血因子可以是因子VIII，特别地用于治疗血友病A。所述凝血因子可以是因子IX，特别地用于治疗血友病B。所述凝血因子可以是因子VII，其用于治疗两种血友病。肽或蛋白质自身抗原定义为是正常组织的成分并且在患者中作为有害的体液或细胞介导免疫应答靶标(如在自身免疫疾病中)的抗原。在一个实施方案中，所述活性物质是针对风湿性关节炎(liheumatoid Arthritis, RA)的。在另一个实施方案中，所述活性物质是针对多发性硬化(Multiple Sclerosis, MS)的。例如所述活性物质为髓磷脂碱性蛋白质。在另一个实施方案中，所述活性物质是针对青少年糖尿病的，如1型糖尿病和 LADA(Latent Autoimmune Diabetes of Adults，成人潜伏性自身免疫糖尿病)。例如，β 细胞抗原，特别是谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)、前胰岛素和胰岛素样生长因子 2(insuline-like growth factor-2，IGF2)、和其混合物。在另一个实施方案中，所述活性物质是针对葡萄膜炎的。例如，视网膜S抗原。在另一个实施方案中，所述活性物质是针对炎性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)的，如克罗恩病(Crohn，s disease)和溃疡性结肠炎。在另一个实施方案中，所述活性物质是针对系统性红斑狼疮的。在另一个实施方案中，所述活性物质是针对银屑病的。在另一个实施方案中，所述活性物质是针对获得性重症肌无力的。例如，乙酰胆碱受体。诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质定义为在宿主中负责过敏反应的肽、多肽或蛋白质，所述反应可包括过敏性休克。在一个实施方案中，所述诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质为以上提到的治疗性5活性肽、多肽或蛋白质，其中本发明使得能够避免一些或任何对这些物质的过敏发应以及对其的中和。在另一个实施方案中，所述诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质为食物来源的或者任何其他可进入血液循环并引起过敏反应的肽或多肽分子，例如在经口摄入后。肽或蛋白质移植抗原定义为移植的组织所呈现的抗原，其参与患者中的移植物排斥，例如移植物抗宿主病(Graft Versus Host Disease，GVHD)。在一个实施方案中，所述移植抗原是参与肾脏移植排斥的抗原。在一个实施方案中，所述移植抗原是参与心脏移植排斥的抗原。在一个实施方案中，所述移植抗原是参与肝脏移植排斥的抗原。术语“宿主”优选地指人，但也指动物，特别是宠物(尤其狗或猫)和体育动物(尤其是马)。根据本发明，所述红细胞含有(即封装有)活性物质(active principle，AP)，其表示AP位于或基本上位于红细胞内部。在一个实施方案中，所述组合物靶向网状内皮系统的抗原呈递细胞 (antigen-presenting cell, APC)。根据这一特征，所述红细胞设计为、选为或修饰为促进对网状内皮系统的抗原呈递细胞(APC)的靶向。在一个优选实施方案中，所述组合物靶向肝脏，尤其是枯否氏细胞。根据这一特征，所述红细胞设计为、选为或修饰为促进肝脏靶向。递送AP到肝脏的结果是诱导AP耐受性，尤其是AP特异性耐受性。这种耐受性的诱导涉及肝脏的致耐受性APC。这些细胞基本上是枯否氏细胞(Kupffer cell，KC)、未成熟的肝脏树突细胞，和肝窦内皮细胞。在一个优选的实施方案中，所述组合物用于抑制APC的促炎反应。根据这一特征， 所述红细胞优选地设计为或修饰为抑制APC的促炎反应。在一个优选的实施方案中，本发明所述组合物包含含有AP并靶向肝脏的红细胞。 所述组合物通过肝脏的APC，尤其KC，促进这些红细胞的吞噬作用。根据第一个实施方案，所述红细胞含有AP，并且为与识别所述红细胞表面上表位的免疫球蛋白形成的免疫复合物形式，以促进肝脏的APC，尤其KC，对所述红细胞的吞噬作用。所述组合物还使得促进巨噬细胞的吞噬作用成为可能。优选地，所述免疫球蛋白为免疫球蛋白G。可用来产生足够调理作用的抗体如抗凝血因子(anti-Iihesus)抗体、抗血型糖蛋白(anti-glycophorin)抗体、和抗CRl (CRl = 1型补体受体)抗体。优选抗凝血因子抗体。根据另一个实施方案，所述靶向肝脏和/或抑制促炎症应答通过适当的化学处理来进行，所述化学处理使用修饰红细胞表面的试剂，特别地桥联或交联剂如双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸盐(bis (sulphosuccinimidyl) suberate，BS3或BS3)、戊二醛或神经氨酸酶。根据另一个实施方案，所述靶向肝脏和/或抑制促炎症应答通过使用离子载体来进行。正如本领域技术人员所熟知的，离子载体表示一种脂溶性分子，其使得能够穿过细胞膜的脂双层来运输离子。离子载体可以是，特别地脂溶性分子，如微生物所合成以用于运输离子穿过细胞膜脂双层的。一般来说，所述离子载体能够与离子形成复合物并用作离子运 6载体。在一个实施方案中，所述离子载体与二价阳离子如钙离子形成复合物。根据本发明，所述离子载体可与钙一起使用，其诱导细胞内钙浓度的增加和磷脂酰丝氨酸的暴露，导致红细胞的早衰。例如，可使用钙离子载体A23187(卡西霉素)。认为，离子载体例如A23187诱导 RBC细胞内钙离子浓度的增加，导致细胞衰老，以及对衰老红细胞的吞噬抑制促炎症应答。 其根据 Romero P. J. , RomeroE. A, Blood Cells Mol，Dis，25 (1999) 9-19 ；和 Bratosin D. et al. , Cell Death Differ,8(2001) 1143-11560在一个特定实施方案中，将至少两种靶向方法相组合，例如，所述组合物包含含有 AP的红细胞，所述红细胞是免疫复合物的形式并经过化学处理以使得促进它们在肝脏中被摄取以及被APC (特别是KC)所吞噬。在一个实施方案中，所述红细胞来源于患者自身。在另一个实施方案中，所述红细胞来源于血型匹配的捐献者。本发明的组合物在同一红细胞中可包含一种或多种AP，或在不同的红细胞中包含每一种AP。在红细胞中封装活性物质的技术是已知的，本文优选的裂解-再封装的基本技术描述于专利EP-A-101341和EP-A-679101，本领域技术人员可参考这些技术。根据此技术， 向透析元件(如透析管或透析袋)的第一区室连续地供应红细胞悬浮液，而第二区室含有相对于红细胞悬浮液来说是低渗的水溶液，以裂解红细胞；然后，在再封装单元里，在AP存在下，通过增加渗透压和/或膨胀压诱导红细胞的再封装，之后收集含有AP的红细胞悬浮液。在到目前为止所描述的方案中，优选W02006/016247给出的方法，该方法使得可以有效、可重复、安全、稳定地封装AP。该方法包括以下步骤1.在等渗溶液中配制红细胞压积水平大于或等于65%的红细胞沉淀悬液，冷却至+1°C 至+8°C。2.用来自所述红细胞沉淀的红细胞样品测定渗透脆性，步骤1和步骤2可以按任何次序实施(包括平行实施)，3.在持续维持在+1 ！至+8°C的温度下，在相同腔室内进行的细胞裂解和AP过程， 其包括使红细胞压积水平大于或等于65%红细胞悬浮液和冷却至+1°C至+8°C的低渗裂解液通过透析袋；并且根据之前测定的渗透脆性调节裂解参数；和4.在高渗溶液存在下，在温度为+30至+40°C的第二腔室中进行的再封装过程。“内化”旨在表示AP渗透进入红细胞。特别的，为了透析，将红细胞沉淀以高红细胞压积水平悬浮在等渗溶液中，红细胞压积水平大于或等于65%，优选的大于或等于70%，以及将该悬液冷却到+1 ！至+8°C，优选+2°C至+6°C，通常+4°C附近。根据一个特定实施方案，红细胞压积水平为65%至80%， 优选70%至80%。有利地，在临细胞裂解之前测定红细胞的渗透脆性。有利地，红细胞或含有它们的悬液处于接近或等于用来溶解它们的温度。根据本发明的另一个有利特征，渗透脆性测量快速地进行，即裂解过程在取出样品后很短时间内实施。优选地，取出样品到开始裂解这段时间少于或等于30分钟，优选为少于或等于25分钟，甚至少于或等于20分钟。有关在测量和考虑渗透脆性的情况下实施裂解再封装过程的形式，本领域技术人员可参考W02006/016M7以得到更多细节。根据本发明的一个特征，本发明的组合物最终包含红细胞压积水平为约40%至约 70%，优选约45%至约55%，更优选约50%的红细胞悬液。优选地包装成约1至约250ml 的体积。包装物优选为血袋、注射器和类似的适于血液输注或施用的形式。优选地，对应于医学处方的所封装AP的量全部包含在血袋、注射器等中。本发明的另一个目的是用于在宿主中诱导针对肽或蛋白质活性物质的免疫耐受的方法，所述组合物包含含有选自下列的活性物质的红细胞治疗性肽、多肽或蛋白质，肽或蛋白质自身抗原，诱导过敏反应的肽、多肽或蛋白质，以及肽或蛋白质移植抗原。该方法包括向宿主施用有效量的本发明组合物，特别是通过静脉内、注射或输注，优选通过输注。根据本发明的一个特征，施用约Iml至约250ml，尤其是约IOml至约250ml，通常是约IOml至约200ml的红细胞悬液。施用具有合适的红细胞压积水平的所述悬液，一般为约40%至约70%，优选地为约45%至约55%，更好地为约50%。红细胞对于同时出现的活性物质(装入的活性物质)可以有它们自身的耐受性。因此，大数量的红细胞可有利于耐受作用。另一方面，如上所述的靶向肝脏可允许使用低剂量的红细胞。因此，本领域的技术人员可选择在患者中使用的最优量的活性物质和红细胞，也可以考虑是否处理红细胞以靶向肝脏。本发明还有一个目的是本发明组合物用于诱导针对所施用的红细胞中所存在的活性物质之特异性免疫耐受的用途。本发明的另一个目的是本发明的组合物，其用作诱导针对所施用的红细胞中所存在的活性物质之特异性免疫耐受的药物。下面通过以采用非限制性实施例之实施方案的方式来详细描述本发明，其参考以下附图图1是表示表达F0XP3的⑶4T细胞之百分比的图。图2是表示产生IL-10的调节性⑶4+⑶25+T细胞之百分比的图。图3是表示脾脏中表达F0XP3的⑶4T细胞之百分比的图。图4是表示肝脏中表达F0XP3的⑶4T细胞之百分比的图。图5是表示OVA特异性⑶8T细胞之百分比的图。实施例1 在小鼠红细胞中封装FITC-葡聚糖使用柱式低渗透析将FITC-葡聚糖荧光染料(70kDa)封装到小鼠来源(0F1小鼠) 的红细胞中。将血液离心，然后用PBS洗3遍。透析之前，在加至8mg/ml终浓度的FITC-葡聚糖存在下，将红细胞压积调节到70%。以aiil/分钟的速率相对于具有低渗透压的裂解缓冲液(逆流速率为15ml/分)透析红细胞。用高渗溶液将离开柱的裂解红细胞再次细胞化并在37°C孵育30分钟。用含有葡萄糖的PBS洗数次以后，将细胞调节到50%红细胞压积。实施例2.用ImM的双磺基琥珀酰亚胺辛二酸盐(BS3)对含FITC-葡聚糖的红细胞的化学处理将封装了 FITC-葡聚糖的红细胞悬液洗数次，然后用PBS调节到1. 7X IO8细胞/ μ ，并与一体积的2mM BS3缓冲液(所述BS3溶液含有0. 09%的葡萄糖和磷酸盐缓冲液，PH为7. 4。)混合，这样得到ImM的BS3终浓度。细胞在室温下孵育30分钟。通过加入一体积的20mMtris-HCL和140mM的NaCl来停止反应。在室温孵育5分钟之后，将混合物于 40C以800g离心5分钟。然后将细胞用含葡萄糖的PBS (经800g离心)洗两次，用6%的 SAG-BSA (以IOOOg离心)洗一次，每次10分钟，之后调节到红细胞压积为50%，得到终产PΡΠ O^MM 3.用5mM的双磺某琥珀酰亚胺辛二酸盐(BS3)对含FITC-葡聚糖的红细胞的化学处理将封装了 FITC-葡聚糖的红细胞悬液洗数次，然后用PBS调节到1. 7X IO8细胞/ μ 1，并与一体积的IOmM BS3缓冲液(所述BS3溶液含有0. 09%的葡萄糖和磷酸盐缓冲液， PH为7.4。)混合，以获得5mM的BS3终浓度。细胞在室温下孵育30分钟。通过加入一体积的20mM的tris-HCL和140mM的NaCl来停止反应。在室温孵育5分钟之后，将混合物于 40C以800g离心5分钟。然后将细胞用含葡萄糖的PBS (以800g离心)洗两次，用6%的 SAG-BSA (以IOOOg离心)洗一次，每次10分钟，之后调节到红细胞压积为50%，得到终产PΡΠ O实施例4用A23187离子载体处理含FITC-葡聚糖的红细胞将封装了 FITC-葡聚糖的红细胞悬液用含H印es IOmM, NaC1140mM, BSA 0. 1%, CaCl2 2. 5mM的缓冲液A洗一次，之后用缓冲液A将悬浮液稀释到IXlO6细胞/μ 。将 DMSO中的离子载体浓度用缓冲液A稀释，然后加入到细胞悬液中，得到0. 15 μ Μ、0. 2 μ M或 0. 3μΜ的终浓度。将细胞在37°C下孵育30分钟。混合物于4°C以800g离心6分钟。然后将细胞用含葡萄糖的PBS (以800g离心)洗两次，用6%的SAG-BSA (以IOOOg离心)洗一次，得到终产品。实施例5.在小鼠中注射所述红细胞后FITC-葡聚糖的生物分布制备如下5批次来自小鼠OFl的含有FITC-葡聚糖的红细胞，所述红细胞按实施例1制取，用BS3或离子载体处理或者不做处理(基于实施例2至4)批次1 不处理批次2 :BS3 ImM批次3 :BS3 5mM批次4 离子载体0· 2μ M批次5 离子载体0· 3μΜ将每一批次在Jl通过IV注射进OFl小鼠。注射后1小时30分钟后处死小鼠，回收血液、脾脏、肝脏和骨髓50μ 1血液的等分试样，对于脾脏、肝脏和骨髓则是这些器官的所有细胞研磨和勻浆处理后的50 μ 1等分试样。将这些等分试样在-20°C冷冻至少20分钟，然后在室温下缓慢融解。来自对照组小鼠的等分试样用来制作FITC-葡聚糖标准浓度范围；这些等分试样随后用125 μ 1不同浓度的FITC-葡聚糖裂解来建立标准浓度范围。用125 μ 1的蒸馏水裂解待分析的样品等分试样。然后在这些等分试样中加入 175 μ 1 12%的TCA。然后，将混合物于4°C以15000g离心10分钟。取200μ1的酸性上清，在荧光检测G94nm激发，521nm发射)前加入500μ1 0.4Μ的三羟乙基胺。每个样品的FITC-葡聚糖浓度可以利用标准浓度范围算出，然后就可以推算出相应器官中FITC-葡聚糖的比例。9
OFl小鼠中注射所述红细胞后1小时30分时FITC-葡聚糖的生物分布(表1)


本发明涉及在宿主中诱导针对肽或蛋白质活性物质的免疫耐受的组合物，所述组合物包含含有活性物质的红细胞，所述活性物质选自治疗性肽、多肽或蛋白质，肽、蛋白质自身抗原，诱导过敏反应的肽、多肽、或蛋白质，以及肽或蛋白质移植抗原。