专利名称：新型腈水合酶的制作方法本申请是1997年2月13日提交的、发明名称为“新型腈水合酶”的97110241.4号专利申请的分案申请。本发明涉及一种新型氨基酸序列，它含有来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095(下文称作嗜热假诺卡氏菌)的腈水合酶的α-亚单位和β-亚单位，且本发明涉及一种编码所述酶的α-亚单位和β-亚单位的新型基因序列。此外，本发明涉及一种含有所述基因的重组质粒及一种用所述重组质粒转化的转化体菌株，且本发明涉及一种用所述转化体菌株生产腈水合酶的方法，本发明还涉及一种方法，它包括用一种经培养所述转化体菌株细胞获得的培养物，用培养细胞或用一种经加工培养细胞获得的产物处理一种腈化合物，从而由所述的腈化合物生产相应的酰胺化合物。关于通过水合腈化合物的腈基而将它转化成酰氨基，从而由所述的腈化合物生产相应的酰胺化合物的技术，到现在为止已有的公知化学方法是在有酸或碱存在的情况下或在有铜催化剂存在的情况下加热腈化合物。另一方面，近来已经发现了一各酶，即腈水合酶，它具有一种通过水合腈基而将它转化成酰胺基的腈水合活性，并且已经公开了用所述酶或含有所述酶的微生物细胞处理腈化合物，从而由所述腈化合物生产相应酰胺化合物的方法(见日本专利公开56-17918，62-21519，62-31914，59-37951，4-4873和6-55148)。已知这些方法更优于常规的化学方法，即由腈化合物转化成相应酰胺化合物的转化率和选择性是前者高于后者。为了用这类腈水合酶由腈化合物大规模生产酰胺化合物，重要的是相对于用所述酶生产酰胺化合物中的生产成本来说，要降低在所述酶生产中的生产成本。更具体地说，对于这一问题，有必要提高每单位细胞重量和每单位时间生产酰胺化合物(下文称作细胞活性)的生产率。根据得到的情况，已经进行了各种尝试来克隆所述的酶，即腈水合酶，以便使用所述酶的基因通过基因工程方法，来表达大量的所述酶。例如，公知的方法有使用棒状杆菌属的细胞(见日本未审公开的专利申请2-119778)，使用假单胞杆菌属的细胞(见日本未审公开的专利申请3-251184)，使用玫瑰红球菌(Rhodococcus rhodoclous)的细胞(见日本未审公开的专利申请4-211379)，使用根瘤菌属的细胞(见日本未审公开的专利申请6-25296)，或使用克雷伯氏杆菌属的细胞(见日本来审公开的专利申请6-303971)。然而，对于棒状杆菌属和玫瑰红球菌(Rhodococcus rhodoclous)来说，据报道用任意这些菌转化的大肠杆菌转化体的腈水合酶活性是极弱的(见TIBTECH Vol.10，pp.402-408，1992)。因此，通过这类基因工程方法，不可能总是获得所需的具有高细胞活性的转化体。我们(本发明人)已经首次成功地从嗜热假诺卡氏菌JCM3095的细胞(我们发现它具有一种腈水合酶活性)中分离出一种腈水合酶基因，并且明确了它的氨基酸序列和基因序列。我们还成功地形成了能够表达大量所述基因的基因重组细胞。根据这些发现，我们已经完成了本发明。具体地说，本发明的一个目的是提供来源于嗜热假诺卡氏菌腈水合酶的氨基酸序列和基因序列。本发明的其它目的是提供一种具有所述基因的重组质粒，一种具有所述质粒的转化体，一种用所述转化体细胞生产所述酶的方法，以及一种用所述转化体细胞处理腈化合物，从而由它生产相应酰胺化合物的方法。图1表示质粒pPT-B1的限制性内切核酸酶的切割图谱。
图2表示质粒pPT-DB1的限制性内切核酸酶的切割图谱。
在这些图中Amp表示一种编码β-内酰胺酶的基因，ORI表示在一种Col E1系统中复制起始位点，1acPO表示在来源于pUC18的乳糖操纵子中的启动子和操作基因区，NHα表示一种编码来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的α-亚单位的基因，NHβ表示一种编码来源于嗜热假诺卡氏菌腈水合酶的β-亚单位的基因，且(XbaI/Nspv)表示钝端化后所得到XbaI和NspV之间用于自身连接的位点。
现在，下文将描述本发明。本发明的腈水合酶基因基本上含有序列表中序列号1和序列号2的氨基酸序列。然而，就是在从一种具有相同碱基序列基因的模板中进行转录和翻译的过程中，可以将一种或多种接近氨基酸序列N-末端的氨基酸缺失或者可以将一种或多种氨基酸增加到氨基酸序列的N-末端上，从而得到具有与原始突变体相同酶促活性的突变体，这要取决于将基因导入的宿主类型，构成用于培养宿主的营养培养基的成分和培养基的组成，和用于培养的培养基的温度和pH值，并且还取决于通过基因表达，胞内酶在其生产后的修饰。此外，随着目前重组DNA技术的进展，通过在酶的氨基酸序列中取代，缺失或增加一种或多种氨基酸，已经能够相对容易地修饰一种酶而基本上不改变其活性。而且，近来已作了各种尝试来生产具有增加工业价值的突变体酶，例如，通过在酶的氨基酸序列中取代，缺失或增加一种或多种氨基酸，具有改善的有机溶剂的抗性或具有多种底物特异性。鉴于本领域中这类技术的水平，本文中称作的腈水合酶不仅包括那些具有序列表中序列号1和2的氨基酸序列的酶，而且包括具有通过在所述氨基酸序列中取代，缺失或增加一种或多种氨基酸而修饰的氨基酸序列的任意其它突变体(条件是它们具有所需的腈水合酶活性)，并且本发明包括具有任意这类氨基酸序列和这类修饰的氨基酸序列的任何腈水合酶。
具体地说，本发明是指含有α-亚单位和β-亚单位的腈水合酶，其中α-亚单位具有序列表中序列号1的205个氨基酸的氨基酸序列，β-亚单位具有序列表中序列号2的233个氨基酸的氨基酸序列。不用说，本发明包括下述任何腈水合酶，即它们含有(作为组成成份)通过在序列表中序列号1和2的氨基酸序列中部分取代，缺失或增加一种或多种氨基酸而构建的修饰的α-亚单位和β-亚单位中的一种或者两者都含有，并且它们具有一种腈水合的活性。
在本发明中，通过序列表中序列号1的205个氨基酸的氨基酸序列来表达的α-亚单位的编码碱基序列，落入构成本发明腈水合酶的α-亚基的编码基因范围内。此外，只要任何蛋白质含有通过在序列表中序列号1的氨基酸序列中部分取代，缺失或增加一种或多种氨基酸来构建的任何修饰的α-亚基，作为组成成份，且它们具有一种腈水合的活性，那么任何编码这种修饰的α-亚单位的碱基序列部落入本发明的腈水合酶基因的范围内。同样，在本发明中，通过序列表中序列号2的233个氨基酸的氨基酸序列来表达β-亚单位的编码碱基序列落入构成本发明腈水合酶的β-亚单位的编码基因范围内。此外，还是同样地，只要任何蛋白质含有通过在序列表中序列号2的氨基酸序列中部分取代，缺失或增加一种或多种氨基酸而构建的修饰的β-亚单位作为组成成份，且它们具有一种水合腈的活性，那么任何编码这种修饰的β-亚单位的编码碱基序列都在本发明的腈水合酶基因范围内。
本发明的腈水合酶基因基本上含有序列表中序列号3和4的碱基序列。然而，随着目前重组DNA技术的进展，使用任何其它的碱基序列，已经能够相对容易地取代作为基因翻译中模板的DNA碱基序列，从而生产一种酶，且基本上不改变所述酶的氨基酸序列。此外，通过在作为基因翻译中模板的DNA碱基序列中进行取代，缺失或添加已经能够将一种酶的氨基酸序列修饰到通过在其中取代，缺失或添加一种或多种组成的氨基酸而修饰过的酶中，且基本上不改变酶的酶促活性，从而生产所需的酶。鉴于本领域中这类技术的水平，本文称作的腈水合酶基因不仅包括那些具有序列表中序列号3和4的DNA碱基序列的基因，而且包括具有通过在所述DNA碱基序列中取代，缺失或添加一种或多种碱基而修饰的DNA碱基序列的任何其它突变体，条件是对于具有腈水合酶活性的蛋白质来说，它们能够起到模板作用。具体地说，本发明涉及编码一种腈水合酶的基因，其中α-亚单位含有序列表中序列号3的618个碱基的碱基序列，而β-亚单位含有序列表中序列号4的702个碱基的碱基序列。此外，在本发明中，只要任何蛋白质含有一种氨基酸序列的α-亚单位和一种氨基酸序列的β-亚单位中的一种或两者都含有作为其组成成份，该蛋白质具有一种腈水合活性，并且其中氨基酸的α-亚单位是由在序列表中序列号3的碱基序列中进行部分取代，缺失或添加来构建的任何修饰的碱基序列所编码的，而其中氨基酸序列的β-亚单位是由在序列表中序列号4的碱基序列中进行部分取代，缺失或添加来构建的任何修饰的碱基所编码的，那么这类修饰的α-亚单位和β-亚单位中的一种或两种的任何编码基因都落入本发明腈水合酶基因的范围内。
本发明进一步包括一种重组质粒的构建，所述的重组质粒具有插入其中的本发明腈水合酶基因，且本发明还包括用所述重组质粒将任何所需微生物转化成转化体的过程。此外，本发明还包括所需要酶的生产，它通过将所得的转化.体细胞在普通营养培养基中培养来进行，本发明还包括酰胺化合物的生产，它通过将所述转化体细胞(可生产所所需的酶)在含水培养基中与腈化合物接触而将所述腈化合物转变成相应酰胺化合物。
本发明重组质粒是一种通过将腈水合酶基因插入一种质粒载体而构建的质粒，所述质粒载体中具有一种用来表达所述基因所必需的控制区和一种用于所述基因进行自我复制所必需的区。能将这种质粒导入任何所需的宿主中，从而使它生产酶，即腈水合酶。作为本文中有使用价值的宿主，所提到的是大肠杆菌(如下面的实施例所述)，然而，它不具有限制性。除此之外，任何其它属的微生物，象芽胞杆菌属(诸如枯草芽胞杆菌)，酵母菌，放线菌及其它也是有使用价值的。用于表达的必需的控制区含有一种启动子序列(包括用于控制转录的操纵基因序列)，一种核糖体结合序列(SD序列)和一种转录终止序列。具体地说，该启动子序列包括来源于大肠杆菌的一种色氨酸操纵子的trp启动子和一种乳糖操纵子的Lac启动子，来源于λ噬菌体的一种PL启动子和一种PR启动子，以及来源于枯草芽胞杆菌的一种葡糖醛酸合成酶启动子(gnt)，一种碱性蛋白酶启动子(apr)，一种中性蛋白酶启动子(npr)和一种α-淀粉酶启动子(amy)。除这些之外，本文中有使用价值的还有一种tac启动子和已经将它们本身修饰或设计好的类似物。核糖体结合序列包括(例如)那些来源于大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的序列和作为本发明中嗜热假诺卡氏菌固有的序列。这些序列中的任何一种在本发明中都有使用价值，只要是它能在诸如大肠杆菌和枯草芽胞杆菌这样所需要的宿主中起作用，即没有特殊限制。例如，一种一致性序列含有一系列4个或更多个连续的碱基，这些碱基与16S核糖体RNA的3′-末端区互补，通过DNA合成可以制备上述一致性序列，并可以将它在本文中用作核糖体结合序列。转录终止序列不总是必须的，然而，对它来说，有使用价值的是一种不依赖于任何p-因子的序列，例如，一种脂蛋白终止子或一种trp操纵因终止子。对于重组质粒上的控制区序列，需要的是启动子序列，核糖体结合序列，腈水合酶基因和转录终止序列从区的5′-末端上游端开始，按照次序排列。在这类控制区中，可以将α-亚单位基因和β-亚单位基因表达成各自独立的顺反子，或(换句话说)可以使用为两者共有的相同控制区，按照多顺反子的方式，将上述两者一起进行表达。
作为满足上述要求的质粒载体实例，提到的是PBR 322，pUC18，BluescriptII SK(t)，pKK223-3和PSC101，它们都具有一种可在大肠杆菌中进行自我复制的区；所提到的还有pUB110，PTZ4，PC194，P11，?1和?105，它们都具有一种可在枯草芽胞杆菌中进行自我复制的区。作为可在两种或多种不同宿主中进行自我复制的质粒载体实例，提到的是pHV14，TRp7，YEp7和PBS7。
将编码本发明腈水合酶的基因插入到具有表达所述基因所必需区的质粒载体中，从而构建本发明所需的重组质粒的方法；用所述重组质粒转化一种需要的宿主的方法和在所得的转化体细胞中生产本发明所需的腈水合酶的方法，对于上述三个方法来说，可以使用分子生物学，生物工程和基因工程领域中一般公知的任何普通方法和宿主，诸如“分子克隆，第二版”(“MokcularCloning.Znd Edition”)中所述(T.Maniatis ed al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1988)。作为用于培养转化体细胞的培养基，一般使用的是LB培养基和M9培养基。更优选的是，用在本发明中的这些培养基含有Fe离子和Co离子，它们的量是0.1μg/ml或更多。
为了通过利用按上述方式制备的本发明的腈水合酶或转化体细胞，而由一种腈化合物生产相应的酰胺化合物，将一种需要的腈化合物在一种含水介质中与下列物质接触，这些物质是转化体细胞的培养物，或从转化体细胞培养物中分离的转化体细胞本身，或通过加工转化体细胞而生产的一种产物，或从转化体细胞中分离并纯化的一种腈水合酶。用于接触的温度不需特别确定，但优选在半将水合酶不失活的范围内，更优选在0℃到50℃的范围内。所处理的腈化合物不需特别确定，条件是它可以是一种底物，在这种底物上，本发明的腈水合酶能够起作用。然而，优选的是它包括(例如)具有2至4个碳原子的腈化合物，典型的诸如乙腈，丙腈，丙烯腈，甲基丙烯腈，正丁腈，异丁腈，丁烯腈和α-羟基异丁腈。腈化合物在含水介质中的浓度不需特别确定，条件是它在不超过所述介质中腈化合物最大溶解度的范围内。然而，考虑到酶的活性不被腈化合物所灭活，因此优选腈的浓度可以是5％(按重量计)或更低，更优选2％(按重量计)或更低。
将一系列步骤在下文中进行总结，在明确来源于嗜热假诺卡氏菌的、序列表中序列号1至4的腈水合酶的氨基酸序列和碱基序列之前，我们(本发明人)已经使用了这些步骤。已将嗜热假诺卡氏菌JCM3095保藏在日本的微生物保藏中心[Japan Collection of Microorganisms，The Institute ofPhysigal and Chemical Research(RIKEN)of 2-1，Hirosawa，Wako-shi，Saitama-Ken，Japan)，保藏号JCM3095，现在任何需要它的人都能得到。
(1)将菌株细胞进行培养，分离，破碎，并将它们进行硫酸铵分级分离，阴离子交换层析，凝胶过滤层析和疏水层析，由此从其中分离并纯化腈水合酶，将这种腈水合酶α-亚单位和β-亚单位N-末端上7个残基的氨基酸序列进行测序。
(2)以这样测序的N-末端的氨基酸序列为基础，制备用于基因扩增的寡核苷酸引物。从细胞中制备一种染色体DNA。通过使用这些引物和染色体DNA作为模板的PCR，得到扩增的DNA产物。
(3)用限制性内切核酸酶将染色体DNA进行部分断裂，从而收集从约1500bp至约4000bp的DNA片段。将每个DNA片段与一种质粒载体连接，用这种质粒载体转化大肠杆菌转化成一种质粒库。
(4)通过使用上述(2)中获得的扩增DNA产物作为探针，进行菌落杂交，从质粒库选择含有编码腈水合酶的DNA片段的阳性克隆。
(5)从阳性克隆中提取出质粒DNA，且将插入片段的整个碱基序列进行测序，从而确定了腈水合酶的α-亚单位和β-亚单位的编码基因碱基序列。将可从这样测序碱基序列推定的α-亚基和β-亚基的氨基酸序列与上述(1)中获得的两种亚基的7个残基的N-末端氨基酸序列进行比较，可以证明上述测序的碱基序列可编码腈水合酶。
(6)将含有腈水合酶基因的DNA片段从上述(4)中获得的阳性克隆质粒中重新制备，并将这种DNA片段插入一种具有适合启动子的质粒载体。
(7)将上述(6)中获得的质粒导入适合的宿主细胞中以便获得转化体细胞。将这些转化体细胞进行培养，并将它们从培养物中分离。然后将这些细胞在一种含水介质中保持与丙烯腈接触，因此确定了丙烯酰胺的形成。
现在，参照下面的实施例来更具体地描述本发明，然而，不将这些实施例用来限制本发明的范围。
实施例1从嗜热假诺卡氏菌JCM3095中纯化腈水合酶在50℃时，将嗜热假诺卡氏菌JCM3095细胞在一种含有0.2％的甲基丙烯酰胺的营养肉汤培养基(pH7.5)中培养3天。通过离心培养物(8000×G，30分钟)而获得3g的湿细胞。将这些湿细胞悬浮在7g的KPB(0.1M磷酸钾缓冲液；pH7.0)中，并使用一种超声细胞破碎器将它们破碎，从而得到一种含有细胞碎片的液体。将2.7g的硫酸铵加入到这种含有细胞碎片的液体中，在4℃时，将这种液体缓慢地进行搅拌1小时，然后将它离心(25000×G，30分钟)以便从其中除去不溶性固体。将1.2g的硫酸铵加入到90g的所得上清液中，在4℃时，将这些上清液缓慢地搅拌1小时，然后将它离心(25000×G，30分钟)以便收集沉淀物。将沉淀物溶于1ml的KPB，在4℃时，用2升相同的KPB将它进行透析，时间是48小时。使用一种Toso的DEAE-TOYOPEARL 650M柱(柱的尺寸5×6?cm)将所得透析物进行阴离子交换层析，使用KPB作为展开剂，通过用从0M到0.5M氯化钾进行梯度洗脱，从其中得到一种具有腈水合酶活性的组分。接下来，使用Pharmacia的SUPERDE×200-26/60作为载体，并使用含有0.2M氯化钾的KPB作为展开剂，将所得的活性组分进行凝胶过滤层析，从其中回收到具有腈水合酶活性的组分。然后，使用一种Toso的TSK Gel Phenyl-5PW柱(用于HPLC)，将这些活性组分进行疏水层析。在这一过程中，已用含有20％饱和浓度硫酸铵的KPB将柱进行饱和，将活性成分吸附到这种柱中的载体上，然后用一种含有硫酸铵(将它的浓度按线性梯度从20％的饱和度降至0％的饱和度)的洗脱剂通过梯度洗脱而将上述活性成分进行洗脱，从而获得一种活性组分。
在这些层析处理中，将每个组分中的腈水合酶活性按下述方式进行测定。将每个组分用KPB进行适当稀释，向其中加入1％(按重量计)的丙烯腈，并在10℃时，将它们进行反应10分钟。向这种反应混合物中加入一种1M的磷酸水溶液(与反应混合物的量相同)，从而终止反应。然后，通过HPLC分析来测定这样形成的丙烯酰胺浓度。在这一过程中，所用的是ULTRON80HG(50×8?mm)作为HPLC柱，将一种10mM磷酸水溶液展开剂用于这种柱。通过测量220nm处的吸收度来测定所形成丙烯酰胺的量。
在一种还原条件下，将通过疏水层析获得的活性组分进行SDS-PAGE，它表明了29K道尔顿和32K道尔顿的两种主要多肽链和三种45K道尔顿或更高的次要多肽链的存在。在一种还原条件下，普通腈水合酶的SDS-PAGE一般得到两种30+/-3K道尔顿的多肽链。29K道尔顿和32K道尔顿的两种主要多肽链中的每种都存在于SDS-PAGE凝胶中，使用一种Sartorius′并干电印迹仪(Sartorius′semi-dry Electrobotter)，将上述两种主要多肽链中的每种都吸附到一种Bio Rad′s PVDE膜上。仅将已吸附在这种膜上的所需多肽链的部分从PVDE膜中切下，并使用一种Shimadzu的肽测序仪PSQ-1将多肽链的N-末端氨基酸序列进行测序。结果，发现29K道尔顿多肽链的N-末端氨基酸序列是THr-GlU-Asn-Ile-Leu-Arg-Lys，它与序列表中序列号1氨基酸序列的第2至第8氨基酸残基一致，且32道尔顿多肽链的N-末端氨基酸序列是Met-Asn-Gly-Val-Tyr-Asp-Val，它与序列表中序列号2氨基酸序列的第1至第7氨基酸残基一致。
实施例2从嗜热假诺卡氏菌JCM3095中分离腈水合酶。
按照与实施例1中相同的方式将嗜热假诺卡氏菌JCM3095细胞进行培养。将培养物进行离心(8000×G，30分钟)以便从中收集2g的湿细胞。向这些中加入40ml含有0.15M NaCl的50mM EDTA·2Na(PH 8.0)的水溶液，从而制备一种细胞悬浮液，然后将这种悬浮液在90℃时煮沸10分钟。将所得悬浮液冷却至37℃，向其中加入100mg的蛋白溶菌酶并在37℃时保持1小时。接下来，向其中加入30mg，2000U/mg的酶解酶(zymolylase)，并在37℃时保持1小时。接着，向其中加入5mg，20U/mg的蛋白酶K，并保持37℃1小时。此外，向其中加入2ml的10％SDS溶液并在65℃时保持1小时，然后立即将该体系进行苯酚/氯仿萃取。确切地说，将用TE(含有1mM EDTA·2Na的10mM Tris-HCl缓冲液；PH8.0)饱和的42ml苯酚加入到这种反应混合物中并将它们缓慢地进行搅拌。将该体系进行离心(3000rpm，10分钟)以便将它分离成一种水相和一种有机相，并仅收集水相。向这种水相中加入21ml上述TE饱和的苯酚和21ml的氯仿，并将它缓慢地搅拌。然后，再次将它离心(3000rpm，10分钟)以便将它分离成一种水相和一种有机相；并仅收集水相。向这种水相中加入42ml的氯仿并将它缓慢地搅拌。然后，仍再次将它离心(3000rpm，10分钟)以便将它分离成一种水相和一种有机相，并仅收集水相。向这种水相中加入含有1.1M NaCl的4ml TE和92ml的乙醇，然后将它在室温时保存一会儿。将这样沉淀的丝状DNA通过将它缠绕在一种玻璃棒上来收集。通过按照70％，80％和90％的顺序使用乙醇的水溶液进行处理而去除其中的水分，然后将它在空气中干爆。接下来，将这样收集的DNA再次溶于40ml的TE中。向其中加入30μg的RNaseA，并在37℃时保持1小时。接着，使用一种限制性内切核酸酶BamHI将这种DNA进行部分断裂。通过苯酚/氯仿萃取，随即经乙醇沉淀将这样部分断裂的DNA再次纯化，并将它溶于TE，从而得到一种最终浓度，是1.0μg/μl。
以29K道尔顿和32K道尔顿多肽链的N-末端氨基酸序列(在实施例1中已将它们测序)为基础，制备下面四种PCR引物。
引物15′-ACNGARAAYATNYTNMGNAA-3′引物25′-TTNCKNARNATRTTYTCNGT-3′引物35′-ATGAAYGGNGTNTAYGANGT-3′引物45′-ACNTCRTANACNCCRTTCAT-3′序列表中序列号5的引物1，和序列表中序列号6的引物2，分别与DNA链的互补链相对应，而该DNA链又与29K道尔顿多肽链的N-末端氨基酸序列相反。序列表中序列号7的引物3，和序列表中序列号8的引物4，分别与相应的DNA链的互补链对应，而该DNA链又与32K道尔顿多肽链的N-末端氨基酸序列相反。在这些引物中，N表示A，C，G或T。
将上文中已部分断裂的3μg染色体DNA(将它用作模板)进行PCR。确切地说，对于PCR反应1，所用的是一种总计100μl的反应系统，它含有3μg的DNA，200ng的引物1,200ng的引物4和5U的Taq DNA聚合酶。反应1由40个PCR循环组成，其中一个PCR循环包括在94℃时热变1分钟，在37℃时退火1分钟和在72℃时链扩增1分钟。对于PCR反应2，所用的是一种总计100μl的反应系统，它含有3μg的DNA，200ng的引物2，200ng的引物3和5U的TaqDNA聚合酶。反应2由40个PCR循环组成，其中一个PCR循环与反应1中的内容相同。在PCR后，将反应1和2每个反应中获得的5μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳(其中琼脂糖的浓度按重量计是1.0％)，从而检测(如果可能)来自反应混合物中DNA扩增的产物，这种检测表明了仅从PCR反应2获得反应混合物中约700bp扩增DNA产物的存在。这证明在嗜热假诺卡氏菌中，存在一种32K道尔顿的基因和一种29K道乐顿的基因，同时，它们按照从结合这些基因的5′末端上游区的顺序彼此互相邻接。
将上文中用BamHI部分断裂的染色体DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳(用一种低熔点琼脂糖，Sigma的VII型，琼脂糖的浓度按重量计是0.6％)，并将一种含有从约1500bp至约4000bp DNA片段的琼脂糖块从琼脂糖凝胶中切下。将这种琼脂糖块(约0.5g)精细地粉碎，将其悬浮在5ml的TE中，并将其在55℃时加热1小时，从而将这种琼脂块在TE中完全熔化。将所得的琼脂糖熔化物如上所述进行相同的苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，由此纯化DNA片段。按照这种方式，制备至少10pmol量的这样纯化的DNA片段，并使用一种Takara Shuzo的DNA连接试剂盒，将上述DNA片段插入BamHI位点，该位点位于一种质粒载体PUC18(由Takara Shuzo生产)中的多克隆位点，在用于这种连接以前，用一种限制性内切核酸酶BamHI将PUC18质粒载体DNA进行切割，然后通过苯酚/氯仿苯取和乙醇沉淀将其纯化，使用一种碱性磷酸酶(由Takara Shuzo生产)将它的5′末端进行去磷酸化，并再次通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀将其纯化。将已按这种方式加工并纯化的20ngpUC质粒载体DNA用于连接中。
使用这样连接的DNA转化大肠杆菌HB101的感觉态细胞(高感受态，由Toyobo Co.，Ltd.生产)。将含有这样转化细胞的10μl液体加在一种含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养皿(0.5wt％Bacto酵母菌提取物，1wt％Bacto胰蛋白胨，0.5wt％氯化钠，1.5wt％琼脂；pH7.5)上，并将它们在37℃时培养过夜。这样获得了许多实验皿，它们每个都含有其中已出现100至1000个集落/皿的培养基。
使用已在上文中制备的PCR扩增的DNA产物作为探针，将含有染色体DNA的质粒文库进行菌落杂交，随即进行筛选，从而选择含有所需腈水合酶基因的克隆。
确切地说，将一种尼龙膜(Amersham的Hybond -N)缓慢放在每个质粒文库的平皿上，在约1分钟后，将该膜缓慢地剥落。然后将这种剥下的膜浸入一种变性液体(含有1.5M NaCl的0.5M NaOH水溶液)中7分钟，随即将这种膜用一种中和液体(含有1.5M NaCl和1mMEDTA·2Na的0.5M Tris-HCl水溶液)处理3分钟。将这种中和作用重复两次。接下来，将这种膜用2×SSC(1×SSC是一种含有8.76g氯化钠和4.41g柠檬酸钠的1升水溶液)洗涤一次，并将它放在干燥的滤纸上，在滤纸上将该膜于空气中进行干爆。将紫外线UV以120mJ/cm2作用于该膜；通过它将DNA固定在该膜上。在42℃时，通过将它们浸入30ml/膜的一种杂交缓冲液(5×SSC进一步含有1wt％脱脂牛奶，0.1wt％N-月桂酰肌氨酸，0.02wt％ SDS和50wt％甲酰胺)中2小时，从而将这样处理的膜进行预杂交。另一方面，使用已在上文中制备的PCR扩增的DNA产物作为模板，并使用一种BoehringerMannheim的DIG-DNA标记试剂盒，制备一种荧光标记探针。将100ng的荧光标记探针和300ng的pUC18质粒DNA(通过在95℃时煮沸10分钟而已将它们加热变性后)转换到10ml有预杂交膜的杂交缓冲液。在42℃时，将它们在体系中进行杂交24小时以后，将膜在室温下用含有0.1wt％ SDS的150ml 2×SSC洗涤两次。接下来，在68℃时，将该膜再次用含有0.1wt％ SDS的150ml×SSC洗涤两次，时间是5分钟。将该膜用100ml的一种缓冲液A(含有0.3wt％吐温20和0.15M NaCl的0.1M马来酸缓冲液，pH7.5)进一步洗涤5分钟，然后在室温时，将它在一种缓冲液B(含有0.3wt％吐温20，0.15M NaCl和1wt％脱脂牛奶的0.1M马来酸缓冲液；pH7.5)中阻遏30分钟。接着，在室温时将这种膜用300ml的缓冲液A洗涤两次，时间是15分钟，然后将它在一种60ml缓冲液C(含有0.1M NaCl和50mM氯化镁的0.1M Tris-HCl水溶液；pH 9.5)中饱和5分钟。在室温时，将这种膜浸入30ml的一种溶液中10分钟，该溶液通过用缓冲液C将一种发光底物(Boehringer Mannheim的AMPPD100-fold)进行稀释来制备，然后将该膜转移到已吸附过量AMPPD的干燥滤纸上。根据上文所述的工艺，用一种聚乙烯薄膜将这样处理的膜进行包封，然后用X射线将它进行摄影。在所得X射线照片上，确定出现荧光信号的位置。这证明了在这种膜上有一种阳性信号存在，并且在原始实验平皿上证明已制备的膜来自阳性菌落。
将这样确定的阳性菌落从平皿中移植到含有氨苄青霉素的10ml液体LB培养基上，在37℃时通过以250rpm搅拌将菌落在培养基中培养过夜。按一种普通的方法从这样培养的细胞中提取质粒DNA，然后用一种限制性内切核酸酶BamHI进行切割，随后将它进行琼脂糖凝胶电泳(其中琼脂糖的浓度按重量计是0.7％)，从而测定插入片段的大小，结果是该片段的大小约是3.1kbp。将这种质粒称作pPT-B1(见图1)。根据引物续展方法，使用ABI的测序试剂盒和自动测序仪373A将插入片段的全长碱基序列进行测序。结果证明插入的片段含有开放阅读框架(一种具有702bp的碱基序列，且另一种具有618bp的碱基序列)，它们从其5′末端按顺序相互结合。将这些开放阅读框架称作ORF1和ORF2。包括翻译终止密码子在内的构成ORF1最3′末端的四种碱基与构成ORF2最5′末端的四种碱基重叠，这恰好与通过PCR获得的结果一致。此外，由7个氨基酸残基组成的N-末端氨基酸序列(已从ORF1的碱基序列中推定)与已在实施例中获得的32K道尔顿多肽链N末端的氨基酸序列完全相同。这种序列区与序列表中序列号2氨基酸序列的第1位至第7位氨基酸残基的序列一致。另一方面，由7个氨基酸残基组成的第2位至第8位N-末端氨基酸序列(已从ORF2的碱基序列中推定)与在实施例1中获得的29K道尔顿多肽链的7种氨基酸残基的N-末端氨基酸序列完全相同。这种序列区与序列表中序列号1氨基酸序列的第2位至第8位氨基酸残基的序列一致。此外，在ORF1和ORF2的氨基酸序列之间存在高同源性，并且在不同腈水合酶各自的β-亚单位和α-亚单位之间也存在高同源性。从这些中可以证明ORF1是来源于嗜热假诺卡氏菌腈水合酶的β-亚单位基因，且ORF2是同样来源于嗜热假诺卡氏菌腈水合酶的α-亚单位基因。
实施例3转化体的构建pPT-B1上1ac启动子的转录方向与ORF1和ORF2的转录方向完全相同。用限制性内切核酸酶XbaI和NspV在能够用这些限制性内切核酸酶切割的pPT-B1位点处切割pPT-B1，这些位点存在于pPT-B1腈水合酶基因5′-末端的上游区中，且仅能在这些位点处将pPT-B1切割，然后将切割的pPT-B1进行琼脂糖凝胶电泳(用一种低熔点琼脂糖，Sigma的VII型，琼脂糖的浓度是0.7％)，通过这一过程仅从质粒中切下约4.6kbp的DNA片段。将这样切下的琼脂糖片段(约0.1g)进行精细粉碎，将其悬浮在1ml的TE中，然后在55℃时，将其加热1小时，从而将琼脂糖片段完全熔化。将所得的熔化物进行与实施例2中相同的苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，通过这一过程将DNA片段进行纯化。用一种Takara Shuzo的DNA钝端化试剂盒将这种DNA片段进行钝端化，然后用一种Takara Shuzo的DNA连接试剂盒将它进行自身连接，从而构建一种质粒pPT-DB1(图2)。将这种pPT-DB1导入大肠杆菌HB101(由Toyobo Co.，Ltd.生产)的受觉态细胞，由此将HB101转化成一种转化体MT-10822。在这种转化体MT-10822中，将腈水合酶基因通过存在于其中的pUC18上的lac启动子进行转录和翻译。在1996年2月7日将这种转化体MT-10822进行保藏，并在International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chom，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan给予它保藏号FERM P-15426，在1997年1月10日将它转为布达佩斯条约下的保藏，并在所述的保藏单位给予它保藏号FERM BP-5785。
实施例4用转化体将腈化合物转化成酰胺化合物(1)将含有40μg/ml的硫酸铁7水合物和10μm/ml的氯化钴二水合物的100ml液体LB培养基放入装有挡板的500-ml锥形瓶中，并在121℃时通过将它高压灭菌20分钟而对它进行灭菌处理。自该培养基中加入氨苄青霉素以得到一种最终浓度是100μg/ml。然后，将一白金圈已在实施例3中制备的MT-10822细胞接种在培养基上，并在37℃时，通过以130rpm进行搅拌，将这种细胞在培养基中培养约20小时。将所得培养物进行离心(5000G×15分钟)以便仅从其中分离出细胞，并将细胞悬浮在50ml的生理盐水溶液中。将所得悬浮液再次离心以便从其中分离出湿细胞。将100mg的湿细胞悬浮在200ml 50mM磷酸钾水溶液(pH7.0)中，向其中加入10ml的丙烯腈，并在10℃时进行反应1小时，同时伴随缓慢地搅拌。在反应后，将反应混合物进行与实施例1中相同的HPLC分析，它证明在反应混合物中仅存在丙烯酰胺，且其中不存在丙烯腈和丙烯酸。因此，在本反应中转化率和选择率都是100％。
实施例5用转化体将腈化合物转化成酰胺化合物(2)将含有40μg/ml的硫酸铁7水合物和10μg/ml的氯化钴二水合物的100ml液体LB培养基放入一种装有挡板的500-ml锥形瓶中，并在121℃时，通过将它高压灭菌20分钟而对它进行灭菌处理。向该培养基中加入氨苄青霉素，从而得到一种最终浓度，是100μg/ml。然后，将一白金圈已在实施例3中制备的MT-10822细胞接种在培养基上，并在37℃时，通过以130rpm进行搅拌，将该细胞在培养基中培养约20小时。将所得培养物离心(5000G×15分钟)以便仅从其中分离出细胞。将细胞悬浮在50ml的一种生理盐水溶液中。将所得悬浮液再次进行离心以便从其中分离出湿细胞。将100mg的湿细胞悬浮在200ml 50mM磷酸钾水溶液(pH7.0)中，向其中加入50ml的甲基丙烯腈，并在10℃时通过缓慢地搅拌进行反应2小时。在反应后，将反应混合物进行与实施例1中相同的HPLC分析，它证明在反应混合物中仅存在甲基丙烯酰胺且其中不存在甲基丙烯腈和甲基丙烯酸。因此，在本反应中转化率和选择率都是100％。
实施例6带有部分取代的氨基酸序列，具有腈水合酶活性的突变体(1)
这用来证明用Met取代已在实施例3中制备的质粒DNA pPT-DB1中α-亚单位区中的第6位的Leu。用质粒DNA pPF-DB1作为模板，使用一种Takara Shuzo的“LA PCR体外诱变试剂盒，按照下述方式将质粒DNA pPT-DB1进行位点特异性突变。该”LA PCR体外诱变试剂盒在下文中称作试剂盒。在用于下述突变的工艺中，根据试剂盒的原理和制造者为试剂盒写的说明书来操作这种试剂盒。
将10ml的液体LB培养基放入30-ml试管中，并在121℃时，通过高压灭菌20分钟将它进行灭菌处理。向这种培养基中加入氨苄青霉素以便获得一种100μg/ml的最终浓度。将一白金圈已在实施例3制备的MT-10822细胞接种在培养基上，并在37℃时，通过以300rpm搅拌将这种细胞培养约20小时。将1ml所得培养物放入一种适合的离心管中，并以15000rpm将它离心5分钟，以便从培养物中分离出细胞。通过碱性SDS提取而从细胞中提取出质粒DNA pPT1-DB1。
将1μg的质粒DNA pPT-DB1(将它用作模板)进行两种不同类型的聚合酶链反应(PCR)。确切地说，对于PCR反应1，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol具有序列表中序列号9序列的引物和50pmol的M13引物M4(具有序列表中序列号10的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应1由25个PCR循环组成，其中一个循环包括在98℃时进行加热变性15秒，在55℃时进行退火30秒和在72℃时进行链续展120秒。对于PCR反应2，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列号11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列号12的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应2由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环与反应1中的内容相同。在PCR后，将在反应1和2中的每个反应所获得的5μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳(其中琼脂糖的浓度按重量计是1.0％)，从而将由反应混合物中DNA扩增产生的产物进行检测(如果可能)。这种检测表明在两种PCR反应中生产出了扩增DNA产物。使用Takara Shuzo的Microcon 100，从这些PCR反应混合物中除去过量的引物和dNTP。向每种反应混合物中加入TE以便制备每种都是50μl的TE溶液。制备总计47.5μl的退火溶液，它含有0.5μ的两种上述TE溶液。对于退火溶液的基本组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书。将这种溶液在98℃时进行加热变性10分钟，然后将它以恒定的冷却速度在超过60分钟的间隔内冷却至37℃，随后将它在37℃时保持15分钟。因此，完成了所需的退火。将0.5μl的TAKRALA Taq加入到这样退火的溶液中，然后将它在72℃时加热3分钟。由此，完成了异源双链DNA的形成，将它进行PCR反应了。确切地说，对于PCR反应3，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有48μl的所述异源双链DNA溶液，50pmol的M13引物M4(具有序列表中序列号10的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列号12的序列)。PCR反应3由25个PCR循环组成，其中一个PCR包括在98℃时进行加热变性15秒，在55℃时进行退火30秒和在72℃时进行链延伸120秒。在PCR后，将在PCR反应3中获得的5μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳(用一种低熔点的琼脂糖Sigma的VII型，琼脂糖的浓度按重量计是0.8％)，从而将由反应混合物中DNA扩增产生的产物进行检测。这种检测表明了在PCR反应3中生产出了约2.0kbp扩增的DNA产物。从PCR反应混合物中取出的仅是约2.0kbp的DNA片段。将这种片段(约0.1g)精细地粉碎，将它悬浮在1ml的TE中，并在55℃时将它加热1小时，从而完全熔化该片段。将所得熔化物进行与实施例2中相同的苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，通过这一过程将DNA片段进行纯化。最后，将该片段溶于10μl的TE中。用限制性内切核酸酶ECORI和Hind III切割这样纯化为20kbp扩增DNA片段，然后将它进行与实施例2中相同的苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，通过这一过程将DNA片段进行纯化。最后，将该片段溶于10ml的TE中。另一方面，将质粒pPT-DB1用限制性内切核酸酶在它们的切割位点处切割，然后将它进行琼脂凝胶电泳(用一种低熔点的琼脂糖，Sigma的VII型，琼脂糖的浓度是0.7％)，通过这一过程仅将约2.7kbp的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。将这样切下的琼脂片糖段(约0.1g)精细地粉碎，将它悬浮在1ml的TE中，并将它在55℃时加热1小时，从而在TE中将该片段完全熔化。将所得熔化物进行与实施例2中相同的苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，通过这一过程将DNA片段进行纯化。最后，将该片段溶于10μl的TE中。用一种Takara Shuzo的DNA连接试剂盒，将扩增的DNA产物和上述制备的pPT-DB1片段进行相互连接，用它转化大肠杆菌HB101(由Toyobo生产)的感觉态细胞。这样制备出一种大肠杆菌库。
将含有40μg/ml硫酸铁7水合物和10μg/ml氯化钴二水合物的10ml液体LB培养基(将这种培养基在下文中称作一种活性表达培养基)放入30-ml的试管中，并在121℃时通过将它高压灭菌20分钟来对它进行灭菌处理。将氨苄青霉素加入这种培养基中，从而得到一种100μg/ml的最终浓度。然后，将任意选自大肠菌库五个克隆中的任何一个用一个白金圈接种在培养基上，并在37℃时，通过以300rpm搅拌将它在培养基中培养约20小时。将1ml所得培养物放入一种适合的离心管中并离心(以15000rpm进行15分钟)，以便从培养物中分离出细胞。将细胞悬浮在200μl的磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，向其中加入1％(按重量计)的丙烯腈并在10℃时进行反应2分钟。向反应混合物中加入与反应混合物相同量的1M磷酸水溶液，用它将反应终止。通过与实施例1中相同的HPLC分析，测定这样生产的丙烯酰胺在反应混合物中的浓度。结果是在5个克隆中的四个中检测出形成了丙烯酰胺，它证明四个克隆具有腈水合酶活性。
从1ml四个活性克隆(在本文中保留着未被用于检测其腈水合酶的活性)的每个培养物中，将细胞分离，并将它进行碱性SDS提取，从而提取每个克隆的质料DNA。接下来，通过与实施例2中相同的引物延伸，使用同样的ABI的测序试剂盒和自动测序仪373A，将每个克隆腈水合酶结构基因的碱基序列进行测序。结果见表1，其中已知用Met取代了来自表中所示克隆腈水合酶α-亚单位中的第6位的Leu。
表1
实施例7带有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突变体(2)这用来证明在质粒DNA pPT-DB1中用Thr取代α-亚单位区中的第6位的Leu。用质粒DNA pPT-DB1作为模板将它按照与实施例6中相同的方式进行位点特异性突变。
在这一过程中，将已在实施例6中制备的1μg质粒DNA pPT-DB1(用它作为模板)进行两种不同类型的PCR。确切地说，对于反应1，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol具有序列表中序列号13序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列号10的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应1由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环包括在98℃时进行加热变性15秒，在55℃时进行退火30秒，并在72℃时进行链续展120秒。对于反应2，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列号11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列号12的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应2由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环与反应1中的内容相同。在PCR后，将在反应1和2中每个反应所获得的5μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳(其中琼脂糖的浓度按重量计是1.0％)，从而检测(如果可能)反应混合物中由DNA扩增产生的产物。这种检测表明在两种PCR反应中生产出了扩增DNA产物。使用这些产物，按照与实施例6中相同的方式制备一种大肠杆菌库。
将任意选自大肠杆菌库的五个克隆中任何一个用一个白金圈接种在与实施例6中所用相同的10ml活性表达培养基上，并在37℃时，通过以300rpm搅拌，将它在培养基中培养20小时。将1ml所得培养物放入一种适合的离心管，并按照与实施例6中相同的方式来测定其腈水合酶的活性。结果是在五个克隆中的四个中检测出了形成的丙烯酰胺，它证明四个克隆具有腈水合酶活性。
从1ml四个活性克隆(在本文中保留着未被用于检测其腈水合酶的活性)的每个培养物中，将细胞分离并将它们进行碱性SDS提取，从而提取每个克隆的质粒DNA。接下来，按照与实施例2相同的方式，将每个克隆腈水合酶结构基因的碱基序列进行测序，结果见表2，其中已知由Thr取代了来自如表中所示克隆腈水合酶α-亚单位中的第6位的Leu。
表2
实施例8带有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突变体(3)这用来证明在质粒DNA pPT-DB1中用Ala取代α-亚单位区中的第6位的Leu。用质粒DNA pPT-DB1作为模板，将它按照与实施例6中相同的方式进行位点特异性突变。
在这一过程中，将已在实施例6中制备的1μg质粒DNA pPT-DB1(用它作为模板)进行两种不同类型的PCR。确切地说，对于反应1，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol具有序列表中序列号14序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列号10的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应1由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环包括在98℃时进行加热变性15秒，在55℃时进行退火30秒并在72℃时进行链续展120秒。对于反应2，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列号11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列号12的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应2由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环与反应1中的内容相同。在PCR后，将在反应1和2中每个反应所获得的5μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳(其中琼脂糖的浓度按重量计是1.0％)，从而检测(如果可能)反应混合物中由DNA扩增产生的产物。这种检测表明在两种PCR反应中生产出了扩增DNA产物。使用这些产物，按照与实施例6中相同的方式制备一种大肠杆菌库。
将任意选自大肠杆菌库的五个克隆中任何一个用一个白金圈接种在与实施例6中所用相同的10ml活性表达培养基上，并在37℃时，通过以300rpm搅拌，将它在培养基中培养20小时。将1ml所得培养物放入一种适合的离心管，并按照与实施例6中相同的方式来测定其腈水合酶的活性。结果是在五个克隆中的四个中检测出了形成的丙烯酰胺，它证明四个克隆具有腈水合酶活性。
从1ml四个活性克隆(在本文中保留着未被用于检测其腈水合酶的活性)的每个培养物中，将细胞分离并将它们进行碱性SDS提取，从而提取每个克隆的质粒DNA。接下来，按照与实施例2相同的方式，将每个克隆腈水合酶结构基因的碱基序列进行测序，结果见表3，其中已知由Ala取代了来自如表中所示克隆腈水合酶α-亚单位中的第6位的Leu。
表3
实施例9带有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突变体(4)这用来证明在质粒DNA pPT-DB1中向Val取代α-亚单位区中的第6位的Leu。用质粒DNA pPT-DB1作为模板，将它按照与实施例6中相同的方式进行位点特异性突变。
在这一过程中，将已在实施例6中制备的1μg质粒DNA pPT-DB1(用它作为模板)进行两种不同类型的PCR。确切地说，对于反应1，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol具有序列表中序列号15序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列号10的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应1由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环包括在98℃时进行加热变性15秒，在55℃时进行退火30秒并在72℃时进行链续展l20秒。对于反应2，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列号11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列号12的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应2由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环与反应1中的内容相同。在PCR后，将在反应1和2中每个反应所获得的5μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳(其中琼脂糖的浓度按重量计是1.0％)，从而检测(如果可能)反应混合物中由DNA扩增产生的产物。这种检测表明在两种PCR反应中生产出了扩增DNA产物。使用这些产物，按照与实施例6中相同的方式制备一种大肠杆菌库。
将任意选自大肠杆菌库的五个克隆中任何一个用一个白金圈接种在与实施例6中所用相同的10ml活性表达培养基上，并在37℃时，通过以300rpm搅拌，将它在培养基中培养20小时。将1ml所得培养物放入一种适合的离心管，并按照与实施例6中相同的方式来测定其腈水合酶的活性。结果是在五个克隆中的四个中检测出了形成的丙烯酰胺，它证明四个克隆具有腈水合酶活性。
从1ml四个活性克隆(在本文中保留着未被用于检测其腈水合酶的活性)的每个培养物中，将细胞分离并将它们进行碱性SDS提取，从而提取每个克隆的质粒DNA。接下来，按照与实施例2相同的方式，将每个克隆腈水合酶结构基因的碱基序列进行测序，结果见表4，其中已知由Val取代了来自如表中所示克隆腈水合酶α-亚单位中的第6位的Leu。
表4
实施例10带有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突变体(5)这用来证明在质粒DNA pPT-DB1中用Val取代α-亚单位区中的第19位的Ala。用质粒DNA pPT-DB1作为模板，将它按照与实施例6中相同的方式进行位点特异性突变。
在这一过程中，将已在实施例6中制备的1μg质粒DNApPT-DB1进行两种不同类型的PCR，用它作为模板确切地说，对于反应1，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol具有序列表中序列号16序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列号10的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应1由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环包括在98℃时进行加热变性15秒，在55℃时进行退火30秒并在72℃时进行链延伸120秒。对于反应2，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列号11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列号12的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应2由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环与反应1中的内容相同。在PCR后，将在反应1和2中每个反应所获得的5μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳(其中琼脂糖的浓度按重量计是1.0％)，从而检测(如果可能)反应混合物中由DNA扩增产生的产物。这种检测表明在两种PCR反应中生产出了扩增DNA产物。使用这些产物，按照与实施例6中相同的方式制备一种大肠杆菌库。
将任意选自大肠杆菌库的五个克隆中任何一个用一个白金圈接种在与实施例6中所用相同的10ml活性表达培养基上，并在37℃时，通过以300rpm搅拌，将这种白金圈接种物在培养基中培养20小时。将1ml所得培养物放入一种适合的离心管，并按照与实施例6中相同的方式来测定其腈水合酶的活性。结果是在五个克隆中的四个中检测出了形成的丙烯酰胺，它证明四个克隆具有腈水合酶活性。
从1ml四个活性克隆(在本文中保留着未被用于检测其腈水合酶的活性)的每个培养物中，将细胞分离并将它们进行碱性SDS提取，从而提取每个克隆的质粒DNA。接下来，按照与实施例2相同的方式，将每个克隆腈水合酶结构基因的碱基序列进行测序，结果见表5，其中已知由Val取代了来自如表中所示克隆腈水合酶α-亚单位中的第19位的Ala。
表5
实施例11带有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突变体(6)这用来证明在质粒DNA ppT-DB1中用Leu取代α-亚单位区中的第38位的Met。用质粒DNA pPT-DB1作为模板，将它按照与实施例6中相同的方式进行位点专一突变。
在这一过程中，将已在实施例6中制备的1μg质粒DNA pPT-DB1进行两种不同类型的PCR用它作为模板。确切地说，对于反应1，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol具有序列表中序列号17序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列号10的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应1由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环包括在98℃时进行加热变性15秒，在55℃时进行退火30秒并在72℃时进行链延伸120秒。对于反应2，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列号11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列号12的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应2由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环与反应1中的内容相同。在PCR后，将在反应1和2中每个反应所获得的5μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳(其中琼脂糖的浓度按重量计是1.0％)，从而检测(如果可能)反应混合物中由DNA扩增产生的产物。这种检测表明在两种PCR反应中生产出了扩增DNA产物。使用这些产物，按照与实施例6中相同的方式制备一种大肠杆菌库。
将任意选自大肠杆菌库的五个克隆中任何一个用一个白金圈接种在与实施例6中所用相同的10ml活性表达培养基上，并在37℃时，通过以300rpm搅拌，将它在培养基中培养20小时。将1ml所得培养物放入一种适合的离心管，并按照与实施例6中相同的方式来测定其腈水合酶的活性。结果是在五个克隆中的四个中检测出了形成的丙烯酰胺，它证明四个克隆具有腈水合酶活性。
从1ml四个活性克隆(在本文中保留着未被用于检测其腈水合酶的活性)的每个培养物中，将细胞分离并将它们进行碱性SDS提取，从而提取每个克隆的质粒DNA。接下来，按照与实施例2相同的方式，将每个克隆腈水合酶结构基因的碱基序列进行测序，结果见表6，其中已知由Leu取代了来自如表中所示克隆腈水合酶α-亚单位中的第38位的Met。
表6
实施例12带有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突变体(7)这用来证明在质粒DNA pPT-DB1中用Ser取代α-亚单位区中的第77位的Thr。用质粒DNA pPT-DB1作为模板，将它按照与实施例6中相同的方式进行位点特异性突变。
在这一过程中，将已在实施例6中制备的1μg质粒DNA pPT-DB1进行两种不同类型的PCR用它作为模板。确切地说，对于反应1，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol具有序列表中序列号18序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列号10的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应1由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环包括在98℃时进行加热变性15秒，在55℃时进行退火30秒并在72℃时进行链续展120秒。对于反应2，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列号11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列号12的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应2由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环与反应1中的内容相同。在PCR后，将在反应1和2中每个反应所获得的5μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳(其中琼脂糖的浓度按重量计是1.0％)，从而检测(如果可能)反应混合物中由DNA扩增产生的产物。这种检测表明在两种PCR反应中生产出了扩增DNA产物。使用这些产物，按照与实施例6中相同的方式制备一种大肠杆菌库。
将任意选自大肠杆菌库的五个克隆中任何一个用一个白金圈接种在与实施例6中所用相同的10ml活性表达培养基上，并在37℃时，通过以300rpm搅拌，将它在培养基中培养20小时。将1ml所得培养物放入一种适合的离心管，并按照与实施例6中相同的方式来测定其腈水合酶的活性。结果是在五个克隆中的四个中检测出了形成的丙烯酰胺，它证明四个克隆具有腈水合酶活性。
从1ml四个活性克隆(在本文中保留着未被用于检测其腈水合酶的活性)的每个培养物中，将细胞分离并将它们进行碱性SDS提取，从而提取每个克隆的质粒DNA。接下来，按照与实施例2相同的方式，将每个克隆腈水合酶结构基因的碱基序列进行测序，结果见表7，其中已知由Ser取代了来自如表中所示克隆腈水合酶α-亚单位中的第77位的Thr。
表7
实施例13带有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突变体(8)这用来证明在质粒DNA pPT-DB1中用Ala取代α-亚单位区中的第90位的Gly。用质粒DNA pPT-DB1作为模板，将它按照与实施例6中相同的方式进行位点专一突变。
在这一过程中，将已在实施例6中制备的1μg质粒DNA pPT-DB1进行两种不同类型的PCR用它作为模板。确切地说，对于反应1，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmol具有序列表中序列号19序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列号10的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应1由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环包括在98℃时进行加热变性15秒，在55℃时进行退火30秒并在72℃时进行链续展120秒。对于反应2，所用的是一种总计50μl的反应系统，它含有50pmo1的MUT4引物(具有序列表中序列号11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列号12的序列)(对于该系统的组成来说，所参照的是制造者为试剂盒写的说明书)。反应2由25个PCR循环组成，其中一个PCR循环与反应1中的内容相同。在PCR后，将在反应1和2中每个反应所获得的5μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳(其中琼脂糖的浓度按重量计是1.0％)，从而检测(如果可能)反应混合物中由DNA扩增产生的产物。这种检测表明在两种PCR反应中生产出了扩增DNA产物。使用这些产物，按照与实施例6中相同的方式制备一种大肠杆菌库。
将任意选自大肠杆菌库的五个克隆中任何一个用一个白金圈接种在与实施例6中所用相同的10ml活性表达培养基上，并在37℃时，通过以300rpm搅拌，将这种白金圈接种物在培养基中培养20小时。将1ml所得培养物放入一种适合的离心管，并按照与实施例6中相同的方式来测定其腈水合酶的活性。结果是在五个克隆中的四个中检测出了形成的丙烯酰胺，它证明四个克隆具有腈水合酶活性。
从1ml四个活性克隆(在本文中保留着未被用于检测其腈水合酶的活性)的每个培养物中，将细胞分离并将它们进行碱性SDS提取，从而提取每个克隆的质粒DNA。接下来，按照与实施例2相同的方式，将每个克隆腈水合酶结构基因的碱基序列进行测序，结果见表8，其中已知由Ala取代了来自如表中所示克隆腈水合酶α-亚单位中的第90位的Gly。
表8
实施例14具有腈水合酶活性带有部分取代的氨基酸序列的突变体(9)本实施例是为了阐明用Ala取代质粒DNA pPT-DB1中α-亚单位区域内的第102位Val。以质粒DNA pPT-DB1作为模板，并按实施例6中同样的方法将它进行位点特异性突变。
在此过程中，将实施例6中已制备的1μg质粒DNA pPT-DB1进行两种不同类型的聚合酶链反应，用它作为模板。具体地，对于第一种聚合酶链反应，使用的是总量为50μl的反应体系，它包括50pmols带有序列表中序列号20的序列的引物以及50pmols M13引物M4(带有序列表中序列号10的序列)(对于这一体系的组成，所参照的是制造商对试剂盒的说明)。第一种反应包括25个聚合酶链反应循环，其中一个聚合酶链反应循环包括在98℃时15秒钟的热变性，在55℃时30秒钟的退火以及在72℃时120秒钟的链延伸。对于第二种聚合酶链反应，使用的是总量为50μl的反应体系，它包括50pmols MUT4引物(带有序列表中序列号11的序列)和50pmols M13引物RV(带有序列表中序列12的序列)(对于此体系的组成，所参照的是制造商对试剂盒的说明)。第二种反应包括25个聚合酶链反应循环，其中一个聚合酶链反应循环与第一种反应中的相同。聚合酶链反应后，将第一和第二种反应分别得到的5μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳(其中琼脂糖浓度为1.0Wt％)，如果有的话，用此方法可测定反应混合物中DNA扩增所得的产物。这一测定表明了两种聚合酶链反应中有扩增的DNA产物产生。使用这些产物，根据实施例6所述的同样方法制备大肠杆菌库。
用一个白金圈将从大肠杆菌库中任意选择的五个克隆中的任意一个接种在10ml与实施例6中所用的相同的活性表达培养基中，并在37℃温育20小时，以300rpm震荡。将1ml所得的培养物放在合适的离心管中，按实施例6中同样的方法测定其腈水合酶活性。结果，在五个克隆中有四个发现有丙烯酰胺形成，这证实了四个克隆具有腈水合酶活性。
从保留着未被用于测定其腈水合酶活性的有活性的四个克隆的各1ml培养物中，分离出细胞，并进行碱性SDS提取，由此提取到每个克隆的质粒DNA。接着，按实施例2中同样的方法将每个克隆的腈水合酶结构基因的碱基序列进行排序。结果如表9所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的α-亚单位中的第102位Val被Ala取代了。
表9
实施例15具有腈水合酶活性带有部分取代的氨基酸序列的突变体(10)本实施例是为了阐明用Ile取代质粒DNA pPT-DB1中α-亚单位区域内的第106位Val。以质粒DNAp PT-DB1作为模板，并按实施例6中同样的方法将它进行位点特异性突变。
在此过程中，将实施例6中已制备的1μg质粒DNA pPT-DB1进行两种不同类型的聚合酶链反应，用它作为模板。具体地，对于第一种聚合酶链反应，使用的是总量为50μl的反应体系，它包括50pmols带有序列表中序列号21的序列的引物以及50pmols M13引物M4(带有序列表中序列号10的序列)(对于这一体系的组成，所参照的是制造商对试剂盒的说明)。第一种反应包括25个聚合酶链反应循环，其中一个聚合酶链反应循环包括在98℃时15秒钟的热变性，在55℃时30秒钟的退火以及在72℃时120秒钟的链延伸。对于第二种聚合酶链反应，使用的是总量为50μm的反应体系，它包括50pmols MUT4引物(带有序列表中序列号11的序列)和50pmols M13引物RV(带有序列表中序列12的序列)(对于此体系的组成，所参照的是制造商对试剂盒的说明)。第二种反应包括25个聚合酶链反应循环，其中一个聚合酶链反应循环与第一种反应中的相同。聚合酶链反应后，将第一和第二种反应分别得到的5μl反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳(其中琼脂糖浓度为1.0Wt％)，如果有的话，用此方法可测定反应混合物中DNA扩增所得的产物。这一测定表明了两种聚合酶链反应中有扩增的DNA产物产生。使用这种产物，根据实施例6所述的同样方法制备大肠杆菌库。
用一个白金圈将从大肠杆菌库中任意选择的五个克隆中的任意一个接种在10ml与实施例6中所用的相同的活性表达培养基中