专利名称:氟维司群在制备抗微管类化疗药物耐药逆转剂中的应用的制作方法
本发明的目的是提供新型雌激素受体氟维司群作为乳腺癌抗微管类化疗药物耐药逆转剂的应用。本发明采用的技术方案是氟维司群在制备抗微管类化疗药物耐药逆转剂中的应用。具体的,氟维司群可用于制备乳腺癌细胞抗微管类化疗药物耐药逆转剂,可与化疗药物联合治疗雌激素受体阳性或阴性的耐药乳腺癌患者。具体的,氟维司群可用于制备下列之一的抗微管类化疗药物的耐药逆转剂紫杉醇,多西紫杉醇,长春瑞滨。氟维司群在制备乳腺癌细胞抗微管类化疗药物耐药逆转剂药中的应用,具体表现在氟维司群逆转乳腺癌细胞抗微管类化疗药物耐药不依赖于雌激素受体表达与否,也不依赖于抑制P-糖蛋白的功能与否。氟维司群与抗肿瘤药物同时使用可促进肿瘤药物诱导雌激素受体阴性的乳腺癌耐药细胞凋亡。进一步分析发现氟维司群与抗肿瘤药物同时使用可既能促进肿瘤药物诱导P-糖蛋白阳性乳腺癌耐药细胞凋亡,也能促进肿瘤药物诱导P-糖蛋白阴性的乳腺癌耐药细胞凋亡。本发明的有益效果如下1)氟维司维已被批准用于临床使用,且具有副作用少, 患者耐受好,与其它雌激素受体调节剂或化疗药物少有交叉耐药等优势,与临床乳腺癌治疗常用化疗药物如紫杉醇,阿霉素,长春瑞滨等联合用药具有临床可操作性。2、临床上,氟维司群主要针对雌激素阳性乳腺癌患者进行内分泌治疗。本发明证实氟维司群与化疗药物联合用药不仅可以针对雌激素阳性耐药乳腺癌治疗,也可以针对雌激素阴性耐药乳腺癌治疗。幻肿瘤耐药类型有多种,依据肿瘤耐药标志物之一 P-糖蛋白的表达与否,可分为P-糖蛋白依赖型耐药和非P-糖蛋白依赖型耐药。本发明证实氟维司群与化疗药物联合用药不仅可以逆转P-糖蛋白阳性乳腺癌细胞抗微管类化疗药物耐药,也可以逆转P-糖蛋白阳性乳腺癌细胞抗微管类化疗药物耐药。因此,氟维司群作为抗微管类化疗药物耐药逆转剂用于治疗耐药乳腺癌具有很好的临床应用前景。图 1 为 BCap37,Bats-72 和 Bads_200P-糖蛋白和 ER-α 表达检测;图2为Bats-72和Bads-200的耐药性检测(以紫杉醇为例);图3为氟维司群对Bats-72和Bads-200细胞毒性检测;图4为氟维司群逆转Bats-72和Bads-200细胞对紫杉醇的耐受;图5为氟维司群促进紫杉醇损伤Bats-72和Bads-200细胞;图6为氟维司群逆转Bats-72和Bads-200细胞对多西紫杉醇(a),长春瑞滨(b) 的耐受。相对于BCap37,Bats-72和Bads-200对紫杉醇耐受分别增强了 113. 7和1137. 5倍。实施例3 氟维司群对Bats-72和Bads-200细胞毒性检测。(1)实验材料细胞株新型细胞株Bats-72和Bads-200 ;试剂耗材1640培养液(杭州吉诺),0. 25%胰酶(杭州吉诺),超级新生牛血清 (上海依科赛),IOOmm培养皿(Corning),96孔板(Corning),DMSO (上海国药),MTT,紫杉仪器细胞培养箱,超净工作台,血球细胞计数器,酶标仪。(2)实验方法Bats-72和Bads-200接种于IOOmm培养皿,培养72,更换新鲜培养液,0. 25%胰酶消化,收集细胞,细胞计数,配制20000个/ml浓度的单细胞悬液,分别每孔接种0. 2ml单细胞悬液至96孔板,每总细胞数为4000个,培养过夜,加入氟维司群处理浓度梯度为0、10、 20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000nM。处理 72h,去上清,加入 0. 2ml DMS0,酶标仪570nM波长检测OD值。(3)实验结果结果见图3,氟维司群浓度低于IOOOOnM时,处理72h后,Bats-72和Bads-200的细胞存活率在80%以上。(4)结论氟维司群浓度低于IOOOOnM时,对Bats-72和Bads-200的细胞毒性很低。其中,当氟维司群浓度为5000nM时,处理72h后,Bats-72和Bads-200的细胞存活率在90%以上, 表明在此浓度下氟维司群对Bats-72和Bads-200的细胞几乎没有毒性。实施例4 氟维司群逆转Bats-72和Bads-200细胞对紫杉醇的耐受。(1)实验材料细胞株新型细胞株Bats-72和Bads-200试剂耗材1640培养液(杭州吉诺),0. 25%胰酶(杭州吉诺),超级新生牛血清 (上海依科赛),IOOmm培养皿(Corning),96孔板(Corning),DMSO (上海国药),MTT,紫杉仪器细胞培养箱,超净工作台,血球细胞计数器,酶标仪。(2)实验方法Bats72和Bads-200接种于IOOmm培养皿,培养72小时,更换新鲜培养液,0. 25% 胰酶消化,收集细胞,细胞计数,配制20000个/ml浓度的单细胞悬液,分别每孔接种0. 2ml 单细胞悬液至96孔板,每总细胞数为4000个,培养过夜,对照组加PBS,实验组加入终浓度为5000nM的氟维司群预处理3小时,再加紫杉醇处理,紫杉醇的处理浓度梯度为0、5、10、 20、50、100、200、500、1000、2000nM。72 小时后,去上清,加入 0. 2ml DMS0,酶标仪 570nM 波长检测OD值。(3)实验结果结果见图4,对于Bats-72和Bads-200细胞,氟维司群实验组OD值较相应的对照组低。(4)结论5000nM氟维司群可以逆转Bats-72和Bads-200细胞对紫杉醇的耐受。实施例5 氟维司群促进紫杉醇损伤Bats-72和Bads-200细胞(1)实验材料细胞株新型细胞株Bats-72和Bads-200 ;试剂耗材1640培养液(杭州吉诺),超级新生牛血清(上海依科赛),,35mm培养皿(Corning)仪器倒置显微镜,正置显微镜,细胞培养箱,超净工作台(2)实验方法Bats-72和Bads-200接种于35mm培养皿,培养48小时,分别以下实验组处理细胞对照组(CTL组),氟维司群处理组(ICI),紫杉醇处理组(PTX)和氟维司群处理组和紫杉醇共同处理组(ICI+PTX)。其中氟维司处理浓度为5000nM,Bats-72的紫杉醇处理浓度为200nM,Bads-200的紫杉醇处理浓度为2000nM。氟维司群处理3小时后,加入紫杉醇处理。48小时后更换新鲜培养液,倒置显微镜上观察,拍照。(3)实验结果结果见图5,对于Bats-72和Bads-200细胞,对照组和氟维司群处理组基本上没有飘浮的细胞或出现明显凋亡特征的细胞,紫杉醇处理组只有小量的细胞飘浮的细胞或出现明显凋亡特征,而氟维司群处理组和紫杉醇共同处理组则有大量细胞飘浮的细胞或出现明显凋亡特征。(4)结论5000nM氟维司群可促进紫杉醇损伤Bats-72和Bads-200细胞,增强紫杉醇诱导细胞凋亡。实施例6 氟维司群逆转Bats-72和Bads-200细胞对其它常用化疗药物的耐受。(1)实验材料细胞株新型细胞株Bats-72和Bads-200。试剂耗材1640培养液(杭州吉诺),0. 25%胰酶(杭州吉诺),超级新生牛血清 (上海依科赛),IOOmm培养皿(Corning),%孔板(Corning),DMSO(上海国药集团),MTT, 多西紫杉醇,阿霉素,长春瑞滨和甲氨蝶呤。仪器细胞培养箱,超净工作台,血球细胞计数器,酶标仪。(2)实验方法Bats72和Bads-200接种于IOOmm培养皿,培养72小时,更换新鲜培养液,0. 25% 胰酶消化,收集细胞,细胞计数,配制20000个/ml浓度的单细胞悬液,分别每孔接种0. 2ml 单细胞悬液至96孔板,每总细胞数为4000个,培养过夜,对照组加PBS,实验组加入终浓度为5000nM的氟维司群预处理3小时,再加多西紫杉醇(DTX),,长春瑞滨(VBN)处理。其中多西紫杉醇的处理浓度梯度为0、1、2、5、10、20、50、100、200、500nM ;长春瑞滨的处理浓度梯度为 0、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000nM ;72 小时后,去上清,加入 0. 2ml DMS0,酶标仪570nM波长检测OD值。(3)实验结果结果见图6,对于Bats-72和Bads-200细胞,氟维司群与多西紫杉醇,阿霉素,长春瑞滨共处理组OD值较相应的对照组低,而氟维司群与甲氨蝶呤共处理组OD值较相应的对照组变化非常的少。(4)结论5000nM氟维司群可以逆转Bats_72和Bads-200细胞对多西紫 杉醇,阿霉素,长春瑞滨的耐受,但不能逆转Bats-72细胞对甲氨蝶呤的耐受(Bads-200细胞相对于亲代细胞 BCap37不耐受甲氨蝶呤)。
本发明提供了氟维司群在制备乳腺癌抗微管类化疗药物耐药逆转剂中的应用。氟维司群逆转乳腺癌细胞抗微管类化疗药物耐药不依赖于雌激素受体表达与否,也不依赖于抑制P-糖蛋白的功能与否。氟维司群与抗肿瘤药物同时使用可促进肿瘤药物诱导雌激素受体阴性的乳腺癌耐药细胞凋亡。氟维司维已被批准用于临床使用,且具有副作用少,患者耐受好,与其它雌激素受体调节剂或化疗药物少有交叉耐药等优势,与临床乳腺癌治疗常用化疗药物如紫杉醇,阿霉素,长春瑞滨等联合用药具有临床可操作性,作为抗微管类化疗药物耐药逆转剂用于治疗耐药乳腺癌具有很好的临床应用前景。
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