专利名称：生物相容性组合物及由其聚合的材料用于抑制血管生成的应用的制作方法生物相容性组合物及由其聚合的材料用于抑制血管生成的应用本发明涉及一种基于可交联的亲水性聚合物的生物相容性组合物及由其聚合的材料用于抑制和/或预防血管生成的应用。血管生成是指新的血管结构的形成，所述结构具有内皮細胞内壁并具有平滑肌细胞和周細胞。血管生成不仅对于生理过程诸如在胚胎发育和伤ロ愈合中，还对于病理过程诸如在多发性关节炎和肿瘤生长中，起到非常大的作用。在研究和文献中，曾经且目前仍部分使用三个不同的概念用于血管的新形成—— 血管发生、血管生成和动脉发生——其中，目前采用血管生成这ー概念作为所有形式新血管形成的总概念，因为这三种所述形式的范围难以区分，并且根本原理是一致的。血管生成是ー个复杂的过程，其中构成血管壁所必须的内皮細胞、周細胞和平滑肌細胞通过不同的血管生成生长因子，例如通过成纤维细胞生长因子(FGF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)激活。新的毛細血管通过已存在于相关组织中的内皮細胞的増殖和迁移产生。血管生成具有重要的生物学和医药学意义，在此，血管生成的两种治疗应用区分为促血管生成的治疗和抗血管生成或非血管生成的治疗。在前一种治疗中应当刺激形成新血管，特別是通过使用和给药生长因子，像是例如对动脉硬化，特别是冠心病和外周阻塞疾病的治疗。而抗血管生成或非血管生成的治疗特别在必须阻止或不希望形成新血管的情况下使用，例如在肿瘤治疗中，因为实体瘤依赖于向其提供氧和养分的共生毛細血管网络。相应地，抗血管生成疗法尝试减少/阻隔肿瘤的血管供应，由此减少/阻隔对肿瘤的供血。因此，在现有技术中，为了进行肿瘤的抗血管生成治疗，使用例如中和VEGF的单克隆抗体。在其他疾病例如克隆氏症、银屑病和类风湿性关节炎中，不受阻的血管生成也有重要作用，因为通过新形成的血管，用于发炎的細胞群的连续流到达身体中的感染部位。与血管生成有直接关系的病症和疾病的概述可以在例如Polverini的著作《Angiogenesis in health and Disease :Insights into Basic Mechanisms and Therapeutic Opportunities)), Journal of Dental Educationバ2002) Vol. 66，962_975 中的表 1 中找到。此外，对于可植入的医疗装置/植入物，例如应当用以替代受损组织的植入物，或是安置到特定器官中用以支撑其壁的支架/斯滕特移植物，通常对于持久成功使用的前提条件是，要求它们在其植入位置不促进形成新的血管，而尽可能的被中性和惰性地填入包围它们的组织中，在那里，它们还有可能被再吸收。对于医学植入物来说，在这些情况下会产生巨大的危险，即内皮細胞粘连在植入物上并由此启动新血管形成机制。由此能够产生不希望的副作用，例如植入了所述装置的组织的肿胀和增生，直至导致出现肿瘤生长。为了防止出现这种情況，在现有技术中，通常对将植入装置用抗血管生成的(并且还消炎的)活性成分涂覆，例如抗体(如抗VEGF抗体)、视黄酸及其衍生物、苏拉明、金属蛋白酶-1-和金属蛋白酶-2-抑制剂、埃坡霉素、秋水仙碱、长春花碱、紫杉醇等等，其应当抑制内皮細胞粘连到所述装置上和可由此引发的新血管形成。但是这类涂覆的装置/植入物存在缺点，一方面，由于附加涂覆步骤而导致生产成本增高，另ー方面，覆层的抗血管生成或无血管生成效果依赖于设置覆层及活性成分的质量/数量，还依赖于覆层的耐久性。此外，过去的事实证明，涂覆植入物本身不能够完全阻止内皮細胞的粘连。此外，覆层经常导致在接受治疗的患者体内产生副作用，这些副作用不仅影响每个手术的成效，还能够造成整体健康受损。因此，对于能够克服现有技术缺陷的、而且——同时具有出色的生物相容性的——使用起来有效的以及制造成本低廉的医学植入物的供应，目前仍存在巨大的需求。在所述技术背景下，本发明的目的在干，提供一种用于医学植入物的制品，所述制品不激活或不导致新血管形成，并且抑制内皮細胞的粘连。根据本发明，通过应用ー种生物相容性的組合物达到上述目的，所述组合物基于亲水性聚合物并能够聚合为水凝胶形成材料，其中亲水性聚合物为可交联的血清白蛋白或可交联的血清蛋白，用于抑制和/或预防血管生成或内皮細胞増殖。此外本发明还涉及所述生物相容性组合物的应用，用于对植入物进行涂覆和表面改性，所述植入物由另ー种与从上述組合物出发聚合得到的材料不同的材料构成。上述目的进ー步通过应用一种聚合的、水凝胶形成材料解決，所述材料通过聚合基于血清白蛋白或血清蛋白的組合物得到，用于抑制和/或预防血管生成或内皮细胞增殖。由此，本发明的基本目的完全得到解决。通过根据本发明组合物的应用以及聚合的、水凝胶形成材料，提供ー种新的治疗制品，或药物载体材料，使得例如利用植入物进行组织替代成为可能，并且同时抑制内皮细胞在其上粘连和増殖。有利之处在干，由此避免新血管形成以及在其中引入了用于替代患病或缺损组织的所述组合物的组织的肿胀和增生，且同时通过材料的吸收替代缺损或患病组织。根据本发明所述的应用，还提供植入物用载体材料，通过所述载体材料能够有针对性地抑制血管生成，并且例如通过预先引入所述组合物/材料中，可以有针对性地促进其它不參与血管生成的細胞的生长。除此之外，所述新应用的有利之处在于，组合物还是首先可原位聚合的，亦即可以将所述組合物注入到应当进行组织替代或组织支撑的位置，并首先在该位置进行聚合。由此，为所需的治疗处理仅需最少的医学手木。反之，所述组合物也能够在植入患者体内之前进行聚合，随后通过外科手术植入。发明者已在其试验中证实，基于血清白蛋白或血清蛋白的組合物，或更确切地说， 由所述组合物聚合得到的材料，特別适合于作为载体材料，用以抑制内皮細胞的粘连，从而用于抑制/预防血管生成。因此，这种基于血清白蛋白/蛋白的組合物/材料作为医学植入物，特別可以用于在新血管形成是不利的和/或是必须绝对避免的情况下，例如在软骨、 椎间盘、角膜进行组织替代吋，抑制血管生成。令人^C喜的是，在本发明中的基础实验证实， 与其它现有技术中应用的和公知的载体或基体相比，只有基于血清白蛋白/血清蛋白的材料抑制了内皮細胞的粘连。与此同吋，在此所述材料本身对内皮細胞是无毒的，并且因此对应接受所述材料作为医疗植入物的患者来说也是无毒的，这再次证明了所述材料对患者持别高的生物兼容性。除此之外，血清白蛋白能够结合大量不同的物质，像是例如金属离子(金属)、脂肪酸和氨基酸、各种蛋白质和药品，因此其极具生物相容性，而且如此之好而不在体内引起反应。由此，根据本发明所述的应用也能够与其它生物和/或治疗活性物质组合使用， 所述活性物质应在患者的目标位置通过组合物或者更确切地说通过凝胶发挥生物和/或治疗效果。与此同时，本发明所述应用能够以如下方式实施，即所述材料是可首先原位聚合的，或在植入前已聚合并且以水凝胶状态植入。由此理解的是，当植入聚合了的水凝胶时， 优选更加坚固的水凝胶稠度，使得对所述水凝胶的实际处理成为可能或变得容易。坚固性的程度，或更确切地说，水凝胶或材料的流体性质能够在此通过其交联度得到调整，交联越強，其后水凝胶或材料就越坚固。因此，凝胶的流体性质处于液体和固体之间。虽然白蛋白作为生物兼容性物质是公知的，并且还作为凝胶或载体材料，作为这些在例如DE 10 2008 008 071. 3中得以叙述，但它在抑制内皮細胞的粘连和増殖及抑制血管生成方面的应用尚属未知。用于根据本发明所述应用的組合物，或更确切地说基于所述组合物聚合的水凝胶形成材料，可以在其中含有能够从任何哺乳动物获得，或能够相应地应用于任何哺乳动物的血清白蛋白/血清蛋白，在此优选为人类、牛、羊或家兔血清白蛋白，并且根据本发明所述的应用，对人类优先使用基于人类血清白蛋白的材料。根据本发明所述的应用进ー步的优点在干，所述水凝胶形成材料的前体是可在室温操作的。因此，所述材料能够与各种加入的成分或細胞分开存放，并当需要吋，在即将进行本发明所述应用前，再使其与成分，或有时与細胞，例如应当支持形成新组织的細胞，汇合到一起。其中，聚合时间是可调节的，可以将时间设计为几秒至2分钟。由此，组分和/ 或細胞立即固定于材料中，避免不希望的从材料中向外的扩散。在此如上文所述，所述应用要么通过可原位聚合的水凝胶形成材料实现，要么通过在向患者体内引入之前已经聚合的水凝胶材料实现。在本说明书中，在根据本发明所述的应用中使用术语“組合物”和“材料”，其中， “组合物”偏重于但并不专一地用于尚未聚合的材料，而“材料”或“凝胶”用于已聚合的组合物。不过可以理解，这些术语不能够完全地相互分开，因为组合物和材料实际上指的是同 ー对象。此处，“凝胶”指的是组合物的半固体状态，它以三维的聚合的网络形式存在。根据本发明所述的应用进ー步的优点在于，亲水性聚合物的原料是可变的，所以一方面可以使用可商购的白蛋白，例如提纯或重组制备的人白蛋白，另ー方面也能够使用异源或自体血清。如上文所述，根据本发明所述的应用以下述方式实现将基于血清白蛋白或血清蛋白的組合物注入待治疗位置，在该处所述组合物聚合成为水凝胶形成材料，或者将已聚合的水凝胶形成材料直接植入。向患者植入之后，在一段确定的时间内，交联的白蛋白分解，在此过程中，例如存在于材料中的細胞原位发展为細胞周的基质，并且因此构造在所述环境中。同吋，抑制了内皮細胞的粘连和増殖及因此触发的基于材料的新血管形成。在此，根据本发明所述的应用的一个实施方式设计为，聚合的水凝胶形成材料中的白蛋白浓度处于约5至约20特別是约10mg/ml材料。制造用于根据本发明所述应用的組合物的范例方法，可在上文已述的DE 10 2008008 071. 3中找到，其内容明确通过引用结合在此。根据本发明所述的ー个优选的实施方式设计为，将例如活的哺乳动物細胞，特別是人类的活細胞，以及药理学试剂，生物效应试剂，或者其中的一种或多种或其混合物，与所述组合物/材料共同应用。此处，哺乳动物細胞指任何从哺乳动物导出或源自哺乳动物的細胞，其中特別要提到人类和动物的細胞。这些细胞能够例如选自无肌肉骨架細胞，特別是软骨細胞、骨细胞、纤维软骨細胞、以及调节新陈代谢的腺細胞、岛细胞(Inselzellen)、生成褪黑素的细胞、前体细胞以及干細胞、特别是间充质干細胞，因此就是那些对組合物的各种使用或各种注入位置来说适合的和所期望的細胞。这些細胞能够在组合物或聚合的水凝胶形成材料中存活，并且在吸收材料的同时发展新的组织。根据本发明所述的应用还适合用于防止疗法中的新血管形成，所述疗法目的是原位生产激素，如胰岛素、甲状腺素或褪黑素。如果将产生这些或其它激素的細胞通过所述组合物或材料引入患者体内的治疗位置，它们产生各种激素并且将其释放到环境中，而同时抑制新血管形成。可以理解，根据本发明所述的应用也能够与生物或药物活性物质共同起作用。“生物活性物质或起生物学效果的物质”和“药物活性物质或起药物效果的物质”在此应当表示每ー种天然的或合成的物质，该物质要么对细胞或组织能够有生物或药物的影响，要么能够在細胞上或細胞内进行反应。与此同时，这些影响能够限制在特定的細胞和特定的条件下，而所述物质并不失去其生物或药物活性含义。与此同吋，已有的可用物质的化学结构并不局限于特定(化合物)类，而能够包含任何天然和合成的物质，所述物质通过其天然性质和/或以其改性形式对生物细胞产生任意影响。因此特别优选的是，使用例如抗生素、消炎药、新陈代谢激素、软骨保护剂、基因治疗剂、生长激素或分化和/或调节因子、免疫抑制剂、刺激免疫的物质、一般的肽、蛋白质、 核酸、有机活性物质、透明质酸、诱导細胞凋亡的活性物质、受体激动剂和受体拮抗剂、或它们的混合物，作为生物或药物活性或效应物质。此外，可以使用胞外基质的蛋白质、細胞表面的蛋白质、以及一般的多糖、脂类、抗体、生长因子、糖、凝集素、碳水组合物、細胞因子、 DNA、RNA、siRNA、适配体、以及对结合和性能重要的片段、以及所谓的疾病修饰骨关节炎药剂，或上述物质的混合物。在此，全部物质能够被合成制造或由天然得到，或来自重组的源。 “疾病修饰骨关节炎药剂”(DMOA)在此指一系列物质，其目前作为药物使用，特别是用于关节炎——其中也包括其它自身免疫疾病——以缓解疼痛和发炎，而其严格的起效机理至今尚未完全明确。大多数这种物质含有葡糖胺和硫酸软骨素的混合物。在根据本发明所述应用的一个实施方式中特別优选生物效应物质是透明质酸，井且其在材料中的最终浓度为约1至约10mg/ml材料，特別是约％ig/ml材料。其它实例包括但不限于下列合成的或天然的或由其重组的源生长激素，包括人类生长激素和重组生长激素(rhGH)、牛生长激素、猪生长激素；生长激素释放激素；干扰素，包括干扰素-α、-β和-Y ；白介素-1 ；白介素-2 ；胰岛素；类胰岛素生长因子，包括 IGF-I ；肝素；红細胞生成素；促生长素抑制素；促生长素；蛋白酶抑制剂；促皮质素；前列腺素；以及这些化合物的类似物、片段、模拟物或聚乙ニ醇(PEG)修饰的衍生物；或它们的組合。可以理解，一般说来，所有目前使用原位从载体/基体中释放出(药)物的疾病疗法领域对本发明的应用来讲都是可行的，而使用的(药)物或是使用的細胞依赖于当时的治疗情况，这对于专业技术人员而言每次都需要明确。在根据本发明所述应用的一个实施方式中优选的是，将血清白蛋白或血清蛋白用选自下列基团中的基团功能化马来酰亚胺_、乙烯基磺基-、丙烯酸酷-、烷基卤化物-、 1-氮杂环丙烯(Azirin)-、吡啶基-、硫代硝基苯甲酸基团或芳基化基团。“功能化的”或功能化是指现有的每个——完成的——过程，在该过程中向聚合物——例如通过向聚合物添加基团——提供其通常没有的功能。通过用马来酰亚胺基团对聚合物功能化，可以在将其引入所述组合物/材料中时保证聚合物良好的交联以及同时保证細胞的生存能力或物质的生物功能性。在某些情况下，待引入組合物的細胞或物质通过将与細胞/物质交联的功能化聚合物在組合物中进行分散而引入。如上文所述，本发明还涉及所述组合物或材料在植入物覆层和表面改性方面的应用，该植入物由与随后由所述组合物聚合而成的材料不同的材料制成。这种覆层或改性提供了对由其它不具可比的兼容性的材料制成的植入物进行涂覆的可能性，以使这些通常促进内皮細胞增殖且由此促进血管生成的植入物成为非血管生成的。与此同时，对每个植入物加以考虑，特别是那些进而本身基于水凝胶，但不基于所述組合物的植入物。这在下面的情况下更加特別有利，即有可能发生直接的化学成键化学，正如将应用于聚合的材料那些。这允许在植入物材料上有ー层薄材料层的共价连接。如上文所述，本发明还涉及所述组合物或聚合的水凝胶形成材料的应用，用于治疗或预防与血管生成有关的疾病。这种措施的优点是，所述疾病能够通过根据本发明所述的应用，通过抑制血管生成，得到减轻或甚至预防。ー份与血管生成有关的疾病的列表可在例如Carmeliet，〃 Angiogenesisin health and disease"，Nature Medicine (2003)，Vol. 9Nr. 6 :653-660 中找到，特别是在该文中列出的表1中找到，其中，列出了以过度血管生成为特征的疾病，例如包括癌症、某些传染病、自身免疫疾病、迪格奥尔格综合征、动脉硬化、肥胖症、银屑病、卡波济肉瘤、糖尿病视网膜病变、原发性肺高血压、支气管哮喘、腹膜粘连、子宮内膜异位症、关节炎、滑膜炎、骨赘形成、骨髄炎。其它的优点由描述和附图给出。可以理解，在不脱离本发明的范围的情况下，目前所述及下文即将叙述的特征不仅能够应用于各个给出的組合，也还能应用于其它的組合或単独情況。本发明的实施例在附图中示出，并在接下来的描述中详细解释。其中图1示出了在一种基于血清白蛋白的聚合的水凝胶形成材料(下文中也称之为 “白蛋白凝胶”(AUximingel或Albugel))上的内皮細胞粘连试验的结果在白蛋白凝胶上的内皮細胞培养的示意图(A) ；1天和5天之后在白蛋白凝胶上的内皮細胞的数量的定量图 (B)；用鬼笔毒环肽染色的不同培养条件下的内皮細胞(C)；图2示出了在白蛋白凝胶上的内皮細胞的活力的证据在白蛋白凝胶上的内皮细胞的定量图(A)；白蛋白凝胶的提取物对内皮細胞的細胞毒害效果的研究图(B)；用钙黄緑素和DAPI染色的不同培养条件下的内皮細胞(C，E，G，I)和使用DiI-Ac-LDL的照片(D，F，7图3示出了对在白蛋白凝胶上的内皮細胞増殖的研究结果用DAPI和BrdU染色的不同培养条件下的内皮細胞(A-D)；在白蛋白凝胶上的内皮細胞増殖的定量图(E)；图4示出了对穿过白蛋白凝胶的内皮細胞侵入的研究結果装置示意图㈧；通过白蛋白凝胶移动的内皮細胞的定量图(B)；趋化性指数分析图(C)；化学侵入指数分析图 (D)；孟加拉玫瑰红染色的在Transwell过滤器下腔面上的内皮細胞(E-L)；图5示出了在白蛋白凝胶中的尿囊绒膜血管生长的研究结果胚胎内(in ovo)植入物的照片(A，B)；带有白蛋白凝胶的外植尿囊绒膜的照片(C，D) ；HE(苏木精-曙红)染色的带有白蛋白凝胶的尿囊绒膜(E，F)；接骨木花黑质凝集素染色的带有白蛋白凝胶的尿囊绒膜(G，H)；以及G和H的相差照片(I,J)；图6示出了 Skid/nu小鼠背上皮下白蛋白凝胶的植入试验结果带有周边小鼠组织的白蛋白凝胶的HE染色(A)；带有周边小鼠组织的白蛋白凝胶的接骨木花黑质凝集素染色和DAPI染色⑶；以及图7示出了在白蛋白凝胶上的无限増殖化的内皮細胞的粘连试验的结果用鬼笔毒环肽染色的不同培养条件下的内皮細胞(A-F) ；1天之后白蛋白凝胶上的内皮細胞数量的定量图(G)。实施例A)制备由马来酰亚胺修饰的血清白蛋白将250mg人、家兔或羊的血清白蛋白(Sigma-Aldrich)溶于5ml IM的硼酸钠(pH 8. 2)。向其加入75 μ 1的在PBS/硼酸钠(pH 8.2)(1 1)中的260mM的N-马来酰基-β-丙氨酸(Sigma-Aldrich Kat. -Nr 63285)溶液，并在室温培养90min。将106mg的3-马来酰亚胺-丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMP，Obiter Research, Urbana, IL, USA)溶于 950 μ 1 ニ甲基甲酰胺(DMF)中。将不能溶解的物质通过离心法分离。将500μ1上层清液加入白蛋白溶液中，随后将其在室温培养60min。随后向其中加入500μ1 3Μ乙酸钠(pH 4. 7)，并且在冰上对1升PBS渗析三次。随后将渗析液通过超滤(ΥΜ-3膜，Millipore)浓缩至体积为3. 5ml，过滤消毒并且在_80°C存放。如此功能化后的血清白蛋白/蛋白能够通过加入SH-交联剂进行聚合。在此，特别考虑在两端都带有SH基团的交联剂双硫代聚乙ニ醇。除了双硫代-PEG，通常考虑作为交联剂的物质为带有SH-基团的物质，特别是聚合物，例如ニ硫代-PEG或SH修饰的葡聚糖、 SH修饰的聚乙烯醇、SH修饰的聚乙烯吡咯烷酮等等。双硫代-PEG是商业可得的，使用摩尔质量为10000 g/mol的交联剂。如果摩尔质量小于此值，它将减少凝胶形成，在更高的质量吋，凝胶过快凝胶化，不能够形成充分的物质混合。当交联剂的SH基团和白蛋白中的马来酰亚胺基团具有相同摩尔浓度吋，凝胶形成达到最优。使用在凝胶中最终浓度各自为3mM的马来酰亚胺和SH基团。此外，羊白蛋白凝胶包含細g/ml在聚合前混合入其中并且因此从物理上讲牢固地固定存在的高分子透明质酸(在下文和附图中也用“HS”表示/縮写)。但是作为白蛋白来源，可使用多种动物和人的血清白蛋白。B)用于证明白蛋白凝胶的非血管生成性质的试验1.作为用于人内皮細胞的基材的白蛋白凝胶的测试a)为了研究白蛋白凝胶对内皮細胞(‘ Ζ”)的效果，传代3至9的初级人脐静脉内皮細胞(HUVEC) (PromoCe 1, Heidelbergl)在凝胶中培养，随后研究細胞的粘连、活力和増殖。为此，在48孔板上每个孔中聚合100 μ 1羊白蛋白凝胶，并将处于300 μ 1内皮細胞培养基中的1. 5xl04HUVEC在凝胶上培养M小时或5天(试验装置见图1A)。为了对照，在一个明胶化的(0. 5% )48孔板上培养相同数量的細胞，并且制备含附加0. 5%明胶(凝胶中的最终浓度)的白蛋白凝胶。同吋，在10mg/ml的Matrigel 上培养所述細胞，Matrigel 是ー种几乎尚未定义的来自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤的基底膜提取物，其在基础研究中作为基底膜等价物。白蛋白凝胶的制备(在下文和附图中縮写/标记为“AG”)

本发明涉及一种生物相容性组合物的应用，所述组合物能够聚合为水凝胶形成材料并基于亲水性聚合物，用于抑制和/或预防血管生成或内皮细胞增殖，其中所述亲水性聚合物是可交联的血清白蛋白或可交联的血清蛋白。本发明还涉及一种聚合的水凝胶形成材料用于抑制和/或预防血管生成或内皮细胞增殖的用途，所述聚合的水凝胶形成材料通过将基于血清白蛋白或血清蛋白的组合物聚合而得到。