专利名称：鱼类胚胎冷冻方法 现有技术利用低浓度的抗冻剂冷冻保存鱼类胚胎，冷冻前平衡处理时间10min，因未能充分脱除在冷冻保存过程中多余的水分，容易形成冰晶，对胚胎造成直接损伤，冷冻胚胎不能成活；在降温速率上采用慢速降温和分段慢速降温，不能快速越过容易结冰的危险温区(0～-60℃)，容易造成胚胎内的水分结冰，冰晶对细胞的细胞核和线粒体等细胞器的超微结构造成严重损伤，由于采用慢速降温，胚胎在抗冻剂中的时间过长，虽然能够脱除部分水分，但抗冻剂的毒性作用也造成胚胎的死亡，使冷冻仍不能获得成功。胚胎经液氮冷冻保存后成活的实验结果不能重复实现。
本发明需要解决的技术问题是提供一种可消除和减少冰晶对胚胎损伤的鱼类胚胎冷冻方法。本发明的技术方案包括采用抗冻保护剂、冷冻前平衡处理、液氮中冷冻保存、解冻，其特征是以两种或两种以上抗冻剂复合成的易玻璃化溶液作为鱼类胚胎冷冻保存的抗冻保护剂；冷冻前平衡处理30～50min后装至毛细管或0.5ml离心管，并快速进入-196℃液氮中保存；解冻时，在-180℃平衡处理10min，再用38～40℃水浴解冻；最后用稀释培养液培养，可获得成活胚胎。本发明由于采用易玻璃化溶液作为鱼类胚胎冷冻保存的抗冻保护剂，可消除和减少冰晶对胚胎损伤；快速降温法，让复合抗冻剂快速越过容易结冰的危险温区，在快速降温过程中由液态转变为非晶态的玻璃化液保存鱼类胚胎，可避免和减少冰晶对细胞的细胞核和线粒体等细胞器的超微结构造成的损伤，能获得鱼类胚胎冷冻保存成活，具有实验重复性强的技术效果。附图表示的是本发明工艺流程图。

实施本发明的最好方式是以两种或两种以上高浓度抗冻剂组合成的易玻璃化的溶液作为鱼类胚胎冷冻保存的抗冻保护剂；流程图中的流程①表示玻璃化溶液用1.2丙二醇+DMSO配制或采用1.2丙二醇+甲醇配制；采用浓度25％～30％的1.2丙二醇与浓度10％～15％DMSO配制的溶液或浓度20％～30％的1.2丙二醇与浓度10％～15％的甲醇配制的溶液低毒、无高渗损伤、易玻璃化；例如保存泥鳅胚胎的玻璃化液配方为1.2丙二醇25％+DMS015％，即总数为100ml玻璃化溶液中60ml蒸馏水+25ml1.2丙二醇十15ml DMSO；不同种类鱼类胚胎冷冻保存玻璃化的配比不尽相同，但两种抗冻剂的总浓度应达到40％以上才能获得玻璃化的效果；在2～4℃的低温条件下，玻璃化液的毒性作用比在温室下小，因此，流程图中的流程②设定在2～4C进行冷冻前平衡处理，处理时间为30～50min，可充分脱除胚胎中的水分，减少胚胎内结冰；随后进入流程③装入毛细管或0.5ml离心管；接着快速进入流程④放在-196℃液氮中保存，让复合抗冻剂快速越过容易结冰的危险温区，在快速降温过程中由液态转变为非晶态的玻璃化液保存鱼类胚胎，可避免和减少冰晶对细胞的细胞核和线粒体等细胞器的超微结构造成的损伤；流程图的流程⑤表示解冻时在-180℃平衡处理10min，随后进入流程⑥，用38～40℃水浴解冻；最后进入流程⑦用稀释培养液培养，用稀释培养液培养可避免渗透压差过大而导致胚胎破裂、胚胎死亡，获得成活胚胎。培养液浓度0.4％NaCl+浓度12％蔗糖+浓度2.5％柠檬酸三钠配成。例如在50ml蒸馏水中加入NaCl0.4g、蔗糖12g、柠檬酸三钠2.5g后加蒸馏水稀释至100ml配成培养液。


鱼类胚胎冷冻方法，本发明涉及鱼类胚胎在液氮中冷冻保存。本发明需要解决的技术问题是提供一种消除和减少冰晶对鱼类胚胎损伤的冷冻方法。本发明包括采用抗冻保护剂、冷冻前平衡处理、液氮中冷冻保存、解冻，其特征是以两种或两种以上抗冻剂复合成的易玻璃化溶液作为鱼类胚胎冷冻保存的抗冻保护剂；冷冻前平衡处理30～50min后装至毛细管或0.5ml离心管，并快速进入－196℃液氮中保存；解冻时，在－180℃平衡处理10min，再用38～40℃水浴解冻；最后用稀释培养液培养，可获得成活胚胎。本发明适用于水产养殖。