基于hca587抗原的长肽及其在制备抗肿瘤药物方面的应用制作方法

尹艳慧, 张丽洁, 张毓

2011年10月19日

2011年4月22日

2011年4月22日

北京大学

A61K39/00GK102219835SQ20111010134

hca 抗原 基于

1.一种基于HCA587抗原的长肽，其特征在于，所述长肽诱导分泌IFN-γ的Thl型细胞免疫应答和体液免疫应答2.根据权利要求1所述一种基于HCA587抗原的长肽，其特征在于，所述长肽的氨基酸序列如 SEQ ID No. USEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、 SEQ ID No. 13 或 SEQ ID No. 14 所示3.一种基于HCA587抗原的长肽疫苗，其特征在于，由权利要求1-2所述任一长肽与完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、ISCOM佐剂、CpG 0DN-1826中的一种或多种混合乳化构成4.根据权利要求3所述一种基于HCA587抗原的长肽疫苗，其特征在于，所述长肽疫苗的总体积为100-200 μ 1，其中，长肽的用量为20-50 μ g，ISCOM佐剂的用量为12 μ g，CpG 0DN-1826 的用量为 12 μ g、20 μ g 或 50 μ g5.一种基于HCA587抗原的长肽在制备抗肿瘤药物方面的应用

本发明属于医学肿瘤学技术领域，具体涉及一种基于HCA587抗原的长肽及其在制备抗肿瘤药物方面的应用

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明以下实施例所用的C57BL/6小鼠由北京大学医学部动物中心饲养繁育；小鼠黑色素瘤细胞系B16的稳定表达HCA587的D12细胞培养传代于10% FBSDMEM ；长肽(SLP)由杭州中肽公司和上海吉尔公司合成；完全(CFA)弗式佐剂和不完全弗式佐剂(IFA)购自 Sigma-Aldrich 公司；具有免疫刺激活性的 CpG 0DN-1826 (5，-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3，) 由上海生工技术公司合成；免疫刺激复合物ISCOM AbISGOa-100购自瑞典的ISCONOVAAB 公司；荧光标记的抗小鼠的⑶8抗体和⑶4抗体购自美国的BD公司；PE标记的抗小鼠 IFN-Y抗体来自Biolegend公司；胞内染色所需的固定通透试剂Fixation buffer和 IOXpermeabilization buffer 购自 Biolegend 公司；ELISpot 实验中所用的抗小鼠 γ-干扰素(IFNy)抗体、生物素标记的抗小鼠IFNy 二抗、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素购自 MABTECH公司；HR标记的抗小鼠IgG购自Promega公司实施例1基于HCA587抗原的长肽疫苗免疫方案1、长肽(SLP)的合成、溶解与配制根据HCA587蛋白的序列信息(AF239802)，设计覆盖HCA587第136至373位氨基酸的14条长肽，每条长肽为25-35个氨基酸，人工合成这些序列，合成序列为SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 5，SEQ ID No. 7，SEQ IDNo. 8，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 14 的长月太用 DMSO 溶解为 20μ g/ml，序列为 SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，SEQ ID No. 13的长肽用无菌PBS溶解为10 μ g/ml，序列为SEQ ID No. 2的长肽用无菌PBS溶解为 2. 5 μ g/ml，序列为 SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 6 的长肽用无菌 PBS 溶解为 5 μ g/ml2、长肽疫苗的制备及免疫方案方案一将SLP配成100 μ 1体积(每条长肽为20或50 μ g)，与100 μ 1的CFA或IFA乳化，制成长肽疫苗首先给予6-8周的C57BL/6小鼠背部皮下注射20或50 μ g的CpG，同时皮下免疫200 μ 1的SLP与CFA/IFA的乳化物21天后，小鼠再次皮下注射20或50 μ g的 CpG,同时皮下免疫200 μ 1的SLP与IFA的乳化物在不含CpG的免疫方案中，仅给予SLP 与FA的乳化物，配制及免疫程序同上二次免疫后第10天取小鼠脾脏检测免疫应答情况 方案二将SLP配成50 μ 1体积(每条长肽为20 μ g)，ISCOM为12 μ g，CpG为12 μ g，总体积为100μ 1的混合物，制成长肽疫苗，于小鼠尾根部皮下注射该长肽疫苗21天后再次给予小鼠同样的免疫二次免疫后第10天检测小鼠的免疫应答情况方案三将SLP配成50 μ 1体积(每条长肽为20 μ g)，CFA、IFA或ISCOM为12 μ g，总体积为ΙΟΟμ 1的混合物，制成长肽疫苗，于小鼠尾根部皮下注射该长肽疫苗21天后再次给予小鼠相同的免疫二次免疫后第10天检测小鼠的免疫应答情况3、检测IFN-Y分泌的酶联免疫斑点实验(ELISpot)包被96孔硝酸纤维素板先经70%乙醇处理(15 μ 1/孔)，无菌水(100 μ 1/孔) 洗两遍，再加入已稀释好的包被抗体将抗小鼠IFNy单克隆抗体ANlSWl 200稀释至包被液，75 μ 1/孔，即0.375 μ g/孔的包被抗体4°C包被过夜，避光封闭将包被抗体甩掉，200 μ 1 0.05% PBST/孔洗板，洗3遍，加入250 μ 110% FBS RPMI1640/ 孔，37°C孵育 2 小时样品制备i细胞对照及肽免疫后小鼠处死，取脾，研磨，裂解红细胞，10% FBSRPMI1640重悬，计数每组小鼠的脾细胞按等比例混合，制备成5 X IO5全脾细胞/ΙΟΟμ 1 10 % FBS RPMI1640/孔的细胞悬液 长肽(SLP)及HCA587的稀释来源于HCA587的长肽按照方法1溶解后，用无血清RPMI1640将其稀释至每个长肽2. 5 μ g/ml, 100 μ 1/孔，终浓度为1. 25 μ g/ml ；对照肽 HIV用无血清RPMI1640配成20 μ g/ml, 100 μ 1/孔，终浓度为10 μ g/ml ；HCA587和对照蛋白OVA用无血清RPMI1640配成20 μ g/ml，100 μ 1/孔，终浓度为10 μ g/ml将封闭好的板子中的培基甩掉，按照实验设计，分别加入制备好的细胞悬液和稀释好的肽溶液置37°C孵箱孵育20小时检测IFN Y分泌i生物素标记IFN γ检测抗体将板中的样品甩掉，200 μ 1 0. 05% PBST/孔洗板， 洗6遍，将生物素标记的抗小鼠IFNy检测抗体R4-6A2-Biotin以1 1000稀释至PBS， 100 μ 1/孔，即0. 1 μ g/孔37°C孵育2小时 链霉亲和素标记的碱性磷酸酶将板中的抗体甩掉，200 μ 1 0. 05% PBST/孔洗板，洗6遍，将链霉亲和素标记的碱性磷酸酶以1 1000稀释至PBS，100 μ 1/孔，室温孵育 1小时iii显色将板中的液体甩掉，200 μ 1 0. 05 % PBST/孔洗板，洗8遍，将 5_溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑(BCIP-NBT)底物显色药片溶于IOml双蒸水中， 100 μ 1/孔，室温孵育5min，看到蓝色的点后，甩掉板中的显色液，流水洗板，终止显色将板子置于干燥通风避光处，待干透后使用ELISpot斑点计数仪分析结果4、胞内细胞因子染色检测IFN-Y的分泌体外肽刺激肽免疫的小鼠取脾，研磨，裂解红细胞，10% FBS RPMI1640重悬，计数每组小鼠的脾细胞按等比例混合，制备成5X106全脾细胞/ml24孔板培养细胞，每孔加入5X IO6细胞，再以每个长肽1.25 μ g/ml的浓度加入细胞，6小时后，以1 1000的浓度加入BFA以封闭细胞因子的分泌18小时后收获细胞，进行下一步的染色步骤表面染色收获细胞，PBS 洗一遍，离心弃上清，ΙΟΟμ 1 PBS重悬细胞，1 300稀释加入 CD4-PercP，CD8-FITC，4°C孵育 20min固定表面染色结束后，PBS洗一遍，离心弃上清，500 μ 1 fixation buffer重悬细胞，室温固定20min通透固定结束后，离心弃上清，500 μ 1 IXpermeabilization buffer重悬细胞，室温通透IOmin胞内IFN-Y 染色通透结束后，离心弃上清，PE标记的抗小鼠IFN-Y抗体以 1 800稀释加入样品，100μ 1/样品，4°C孵育30min染色结束后，PBS洗一遍，离心弃上清，PBS重悬，流式检测5、ELISA检测免疫小鼠HCA587抗体的水平包被将HCA587蛋白稀释至包被液，1 μ g/ml，100 μ 1/孔，即0. 1 μ g/孔，4°C包被过夜，避光封闭将包被液体甩掉，200 μ 1 0. 05% PBST/孔洗板，洗3遍，加入含1 % BSA的 PBS 200μ 1/孔，37°C孵育 2 小时血清样本的稀释及加样将各小鼠血清按1 1000，1 5000,1 25000的比例稀释至PBS中将稀释好的血清样本按100 μ 1/孔加入板中37°C孵育2小时加入抗小鼠IgG-HRP 将样本甩掉，200 μ 1 0. 05% PBST/孔洗板，洗6遍，HR标记的抗小鼠IgGWl 2500稀释至PBS，200y 1/孔，37°C孵育1.5小时显色将二抗甩掉，200 μ 1 0.05% PBST/孔洗板，洗6遍，TMB显色液100 μ 1/孔， 孵育1-2分钟，阳性对照明显可见，阴性对照未见时，加入2Μ H2SO4IOO μ 1/孔终止显色不同佐剂辅助SLP免疫应答的效果在小鼠二次接受长肽免疫后第10天检测，收获免疫小鼠的脾细胞，按照方法3的酶联免疫斑点实验(ELISpot)操作，结果见图1，SLP在 CpG1826和CFA两种佐剂的共同辅助下产生较强的SLP特异性的细胞免疫应答，同时也可检测到较强的针对HCA587蛋白的特异细胞反应，免疫反应强度显著高于HCA587SLP与CFA联合使用或HCA587SLP与CpG1826联用组；SLP在单独的IFA的辅助下产生的分泌SLP特异性IFN- γ的细胞频数较低，即使SLP在IFA及CpG1826的联合作用下，也很难提高SLP特异性反应细胞的频数，这就表明在我们的实验体系中IFA对HCA587长肽的免疫应答的辅助作用较弱；对HCA587蛋白免疫应答有极佳作用的ISCOM佐剂对诱导长肽的免疫应答的效果亦不如CFA和CpG1826联用效果好这些结果表明HCA587长肽与CFA和CpG1826的联合应用是最佳组合，能在体内诱导产生强烈的免疫应答小鼠在接受SLP与FA和CpG1826 二次免疫后第10天，取脾，胞内细胞因子染色检测CD4和CD8细胞分泌IFN- γ的情况结果见图2和图3，免疫后小鼠的CD4细胞中有约3%的细胞在HCA587SLP刺激下分泌IFN- γ ,0. 79%的细胞在HCA587蛋白的刺激下产生 IFN-γ而⑶8细胞中几乎没有检测到IFN-Y的分泌这个结果表明HCA587的长肽在 CFA和CpG1826的辅助作用下，诱导产生分泌IFN- γ的Thl型细胞免疫应答对接受不同免疫方案的C57B6小鼠的血清抗HCA587抗体进行了检测结果见图 4，HCA587SLP 与 CFA 和 CpG1826 联用、HCA587SLP 与 CFA 组合、HCA587SLP 与 IFA 组合及 HCA587SLP与ISCOM和CpG1826联用均可诱导较强的HCA587蛋白特异的体液免疫应答； HCA587SLP仅与CPG组合或HCA587SLP仅与IFA组合诱导产生的抗体应答均较弱实施例2基于HCA587抗原的长肽在制备抗肿瘤药物方面的应用1、SLP+CFA+CpG免疫方案的肿瘤治疗模型6-8周的C57BL/6小鼠接种1. 5X104D12细胞，于第2天皮下给予20 μ g或50 μ g 的CpG及20 μ g SLP和CFA的乳化物，即第一次长肽免疫；第一次免疫后的21天，再次皮下给予20 μ g或50 μ g的CpG，20 yg SLP和IFA的乳化物每隔一天观测各组小鼠，测量肿瘤时记录最长径和最短径2、SLP+ISCOM+CpG免疫方案的肿瘤治疗模型6-8周 的C57BL/6小鼠接种1. 5 X 104D12，于第7天尾根部皮下给予20 μ gSLP， 12 μ g ISCOM和12 μ g CpG的混合物，即第一次长肽免疫；第一次免疫后的21天，即28天， 再次尾根部皮下给予同第一次肽免疫的混合物每隔一天观测各组小鼠，测量肿瘤时记录最长径和最短径统计学分析采用log-rank检验方法分析不同治疗的小鼠生存期；两组小鼠肿瘤大小的比较采用非配对t检验在接种肿瘤后第2天和22天给予SLP+CFA+CpG治疗可降低小鼠的成瘤率且能显著延长小鼠的生存期(如图5所示)，SLP治疗除了能改善小鼠的生存期，还可以控制肿瘤的大小，见图6实验结果表明HCA587SLP在CFA和CpG1826两种佐剂的辅助下，可以产生明显的抗肿瘤作用