专利名称：肿瘤-睾丸抗原hca587蛋白疫苗及其应用的制作方法肿瘤发病率、死亡率呈逐年上升趋势，目前癌症已经成为严重威胁人类健康的头号杀手。尽管肿瘤的手术治疗、化疗和放射治疗不断取得进展，但仍然有相当比例的患者不治。近年来，随着人们对肿瘤的分子机理和免疫机制的不断揭示，肿瘤特异的免疫治疗日益受到重视。肿瘤特异性抗原的鉴定是开发有效的肿瘤免疫治疗途径的先决条件。肿瘤-睾丸抗原(简称CT抗原)是一种主要的肿瘤特异性抗原，其主要表达于正常的睾丸组织以及不同类型的肿瘤组织中。由于肿瘤-睾丸抗原高度的组织限制性表达模式，目前这类抗原被认为是癌症免疫治疗的理想靶点。迄今为止，已收录入CT数据库的CT基因家族成员已达到110个。很多CT抗原蛋白疫苗在小鼠模型中展现了强而特异的免疫应答，并能产生抗肿瘤效应。在含ISC0MATRIX佐剂的重组NY-ES0-1蛋白疫苗的临床前试验中，该疫苗在小鼠体内诱导产生了 NY-ES0-1特异的细胞免疫应答和体液免疫应答；接种了 NY-ES0-1疫苗的小鼠，当注射稳定表达NY-ES0-1蛋白的B16黑色素瘤细胞后，能很长时间处于无瘤状态。在小鼠模型中，重组HPV16来源的E6E7或E7GST融合蛋白与ISC0MATRIX佐剂共免疫， 诱导产生E7特异的细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答和抗体应答，并能在体内保护机体免受肿瘤攻击。现已有一些CT抗原的蛋白疫苗处于临床试验阶段，如NY-ES0-1、MAGE-A3的蛋白疫苗。NY-ES0-1蛋白疫苗的临床试验报告显示，其能在多数肿瘤患者诱导产生很强的抗体应答及⑶4+T、⑶8+T细胞应答。另外，在含纳18名肿瘤患者的MAGE-A3蛋白疫苗临床试验中，8名患者接种MAGE-A3蛋白疫苗(含佐剂)后，有7名能产生高滴度的抗体，4名能产生强烈的⑶4+T细胞应答，并有1名产生了⑶8+T细胞应答。自最后一次免疫后的3年内，18 名患者中有14名未见肿瘤复发；并且在再次免疫后，很高比例的患者能立即产生高峰度的 MAGE-A3特异性抗体。这些临床试验结果说明肿瘤抗原的重组蛋白疫苗能有效地诱导特异性的T细胞应答和B细胞应答，并能维持长时的记忆性，在二次遭遇抗原时，免疫细胞能快速地再活化，产生特异的免疫应答。肝细胞癌相关抗原(Hepatocellular carcinoma associated antigen, HCA) HCA587(又称 MAGE-C2)，是利用 SEREX(serological analysis of recombinant cDNA expression 1 ibraries)方法从HCC患者的肝癌组织cDNA表达文库中克隆出来的一种新的 CT抗原(Genbank AF 239802)。HCA587表达于多种肿瘤组织，如肝癌，肺癌，黑色素瘤等， 在正常组织中仅表达于睾丸，而睾丸属于免疫豁免区，不会产生免疫应答。此外，HCA587具有很好的免疫原性在肿瘤患者血清中能检测到自发的抗HCA587抗体的产生；在体外，用 HCA587重组蛋白可以从正常人外周血中成功地诱导出HCA587特异的⑶8+T细胞及⑶4+T细胞应答。鉴于HCA587抗原具有很好的肿瘤组织表达特异性，且免疫原性强，因此是作为肿瘤疫苗的理想的候选抗原。以往的研究工作主要集中在HCA587蛋白的MHC I类分子表位的鉴定，虽然表位肽疫苗在体内能诱导产生细胞免疫应答，但荷瘤小鼠的动物实验却未见表位肽疫苗的抗肿瘤效果(表现在对肿瘤生长速度和荷瘤小鼠的存活期均未见影响)。蛋白疫苗除可克服表位肽疫苗的MHC限制性外，还具有较强的诱导机体同时产生细胞免疫应答和体液免疫应答的作用，是具有较好临床应用前景的候选疫苗。
本发明的目的在于提供一种肿瘤-睾丸抗原HCA587蛋白疫苗。本发明的目的还在于提供肿瘤-睾丸抗原HCA587在制备抗肿瘤药物方面的应用。一种肿瘤-睾丸抗原HCA587蛋白疫苗，其特征在于，该蛋白疫苗为HCA587蛋白与完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、ISCOM佐剂、CpG ODN-IS^中的一种或多种的混合乳化物。所述HCA587蛋白疫苗的总体积为100 μ 1，其中HCA587蛋白的用量为10 μ g， ISCOM 佐剂用量为 12 μ g, CpG 0DN-1826 用量为 12 μ g。肿瘤-睾丸抗原HCA587蛋白疫苗在制备抗肿瘤药物方面的应用。本发明的有益效果本发明的肿瘤-睾丸抗原HCA587蛋白疫苗能够诱导CD4和 CD8T细胞免疫应答和体液免疫应答；诱导分泌多种Thl类细胞因子，并且能够预防小鼠肿瘤的生长，对已建立肿瘤的荷瘤小鼠可延长其存活期，抑制肿瘤的生长速度，具有很好的抗肿瘤效果，为HCA587蛋白疫苗的临床应用奠定了科学基础。图1免疫小鼠脾细胞中产生IFN- γ的细胞频数检测；图中，medium-培基阴性对照、OVAprotein-阴性对照蛋白、HCA587protein_肿瘤-睾丸抗原HCA587蛋白。图2HCA587蛋白联合ISCOM、CpG免疫后小鼠⑶4+T细胞产生细胞因子的检测；图中，Isotype-荧光标记抗体的同型对照、OVA protein-阴性对照蛋白、 HCA587protein-肿瘤-睾丸抗原HCA587蛋白。图3HCA587蛋白联合ISCOM、CpG免疫后小鼠⑶8+T细胞产生细胞因子的检测；图中，I sotype-荧光标记抗体的同型对照、OVA protein-阴性对照蛋白、 HCA587protein-肿瘤-睾丸抗原HCA587蛋白。图4免疫后小鼠脾细胞在不同抗原刺激下分泌细胞因子IFN- γ的检测；图中，medium-培基阴性对照、OVA-阴性对照蛋白、HCA587-肿瘤-睾丸抗原 HCA587 蛋白、HCA587+CpG+ISC0M-HCA587 蛋白联合 ISC0M，CpG 免疫组、CpG+ISCOM-ISCOM 加 CpG免疫的佐剂对照组、PBS-PBS免疫的对照组。图5免疫后小鼠脾细胞在不同抗原刺激下分泌细胞因子IL-2的检测；图中，medium-培基阴性对照、OVA-阴性对照蛋白、HCA587-肿瘤-睾丸抗原 HCA587 蛋白、HCA587+CpG+ISC0M-HCA587 蛋白联合 ISC0M，CpG 免疫组、CpG+ISCOM-ISCOM 加 CpG免疫的佐剂对照组、PBS-PBS免疫的对照组。图6免疫后小鼠脾细胞在不同抗原刺激下分泌细胞因子TNF-α的检测；图中，medium-培基阴性对照、OVA-阴性对照蛋白、HCA587-肿瘤-睾丸抗原HCA587 蛋白、HCA587+CpG+ISC0M-HCA587 蛋白联合 ISC0M，CpG 免疫组、CpG+ISCOM-ISCOM 加 CpG免疫的佐剂对照组、PBS-PBS免疫的对照组。图7免疫后小鼠脾细胞的增殖能力检测；图中，medium-培基阴性对照、OVA-阴性对照蛋白、HCA587-肿瘤-睾丸抗原 HCA587 蛋白、HCA587+CpG+ISC0M-HCA587 蛋白联合 ISC0M，CpG 免疫组、CpG+ISCOM-ISCOM 加 CpG免疫的佐剂对照组、PBS-PBS免疫的对照组。图8小鼠二次免疫后6h，24h和48h的血清中IFN- γ的分泌量；图中，HCA587protein+CpG+ISC0M-HCA587 蛋白联合 ISCOM、CpG 免疫组、 CpG+ISCOM-ISCOM加CpG免疫的佐剂对照组、HCA587protein_HCA587蛋白免疫的对照组。图9小鼠二次免疫后6h，24h和48h的血清中IL-12的分泌量；图中，HCA587protein+CpG+ISC0M-HCA587 蛋白联合 ISC0M，CpG 免疫组、 CpG+ISCOM-ISCOM加CpG免疫的佐剂对照组、HCA587protein_HCA587蛋白免疫的对照组。图10小鼠二次免疫后6h，24h和48h的血清中IL-6的分泌量；图中，HCA587protein+CpG+ISC0M-HCA587 蛋白联合 ISC0M，CpG 免疫组、 CpG+ISCOM-ISCOM加CpG免疫的佐剂对照组、HCA587protein_HCA587蛋白免疫的对照组。图11小鼠于第二次免疫后的第14天接种B16-HCA587瘤细胞，不同免疫方案的成瘤率；图中，no treatment-未治疗组、HCA587+CpG+ISC0M_HCA587 蛋白联合 ISC0M，CpG 免疫组、CpG+ISCOM-ISCOM加CpG免疫的佐剂对照组、HCA587protein_HCA587蛋白免疫的对照组。图12荷瘤小鼠给予蛋白疫苗后肿瘤生长速度的监测。图中，no treatment-未治疗组；HCA587+CpG+ISC0M_HCA587 蛋白联合 ISC0M，CpG 免疫组、CpG+ISCOM-ISCOM加CpG免疫的佐剂对照组、HCA587protein_HCA587蛋白免疫的对照组。图13荷瘤小鼠给予蛋白疫苗后生存期的监测；图中，no treatment-未治疗组、HCA587+CpG+ISC0M_HCA587 蛋白联合 ISC0M，CpG 免疫组、CpG+ISCOM-ISCOM加CpG免疫的佐剂对照组、HCA587protein_HCA587蛋白免疫的对照组。 实施例1HCA587重组蛋白的表达和纯化将编码HCA587 (AF239802)的cDNA通过酶切位点BamHI和I与pGEX_6p_l载体连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，0. 2mM IPTG 25°C诱导表达5小时，4000rpm 4°C离心15 分钟，收集细菌，溶解于裂解液中(pH 7. 4PBS, ImM EDTA and ImM DTT)，超声10次，每次持续15秒，14，OOOrpm离心15分钟，弃沉淀。融合蛋白首先通过GST Sepharose 4B(G^柱做亲和层析，洗涤后溶于裂解缓冲液 (20mM Tris, 150mM NaCl, ImM DTT，ImM EDTA，ρΗ7· 4)中，加入 PPase Q50ug/lml resin), 4°C作用3小时，切除GST。收集蛋白过HiTrap Q HP(GE)柱，缓冲液为20mM Hepes, IM NaCl，pH6. 7，流速为 5ml/min。收集的组分再通过 superdex 200prep grade column (GE) 4t。ililQuick Start Bradford DyeReagent (Bio-rad) ^llJSS^cit, Ι Size-Exclusion HPLC(Agilent 1100 withVWD ；CoIumn :T0S0H G3000SWXL)分析蛋白纯度，检测纯化蛋白中的内毒素含量。经HPLC检测，制备的HCA587重组蛋白纯度为96%，内毒素含量为5. 2EU/mg。实施例2HCA587蛋白疫苗的的制备及免疫程序方案一将HCA587蛋白50 μ 1 (10 μ g)和CpG 50 μ 1 (12 μ g)混合乳化，制成蛋白疫苗。取6-8周龄小鼠(C57BL/6)，每组3只，每只注射100 μ 1上述蛋白疫苗，尾根部皮下注射，进行第一次免疫，20天后，再次注射进行二次免疫。方案二将HCA587蛋白50 μ 1 (10 μ g)和ISCOM 50 μ 1 (12 μ g)混合乳化，制成蛋白疫苗。取6-8周龄小鼠(C57BL/6)，每组3只，每只注射100 μ 1上述蛋白疫苗，尾根部皮下注射，进行第一次免疫，20天后，再次注射进行二次免疫。方案三将HCA587 蛋白 50 μ 1 (10 μ g) ,ISCOM 25 μ 1 (12 μ g)和 CpG 25 μ 1 (12 μ g)混合乳
化，制成蛋白疫苗。取6-8周龄小鼠(C57BL/6)，每组3只，每只注射100 μ 1上述蛋白疫苗，尾根部皮下注射，进行第一次免疫，20天后，再次注射进行二次免疫。方案四将HCA587蛋白50 μ 1 (10 μ g)与CFA 50 μ 1或IFA 50 μ 1混合乳化，制成蛋白疫
田ο取6-8周性小鼠(C57BL/6)，每组3只，每只注射HCA587与CFA混合的100 μ 1蛋白疫苗，尾根部皮下注射，进行第一次免疫，20天后，每只注射HCA587与IFA混合的100 μ 1 蛋白疫苗，再次尾根部皮下注射进行二次免疫。上述实施方案佐剂对照组为CpGdOOy 1)和CpG (50 μ 1)+ISCOM(50 μ 1)，缓冲液对照组为PBS，免疫方法为尾根部皮下注射，进行第一次免疫，20天后，再次尾根部皮下注射进行二次免疫。第二次免疫后两周，取小鼠脾脏，研磨过400目筛网，重悬于含2% NCS的BSS缓冲液中，离心后ACK溶解红细胞冰上3min，用2% NCS的BSS缓冲液终止裂解，离心，用PBS再洗一遍，最后将脾细胞重悬在含10% FCS的1640培养液中，用于后续检测。实施例3酶联免疫斑点(ELISpot)法测定小鼠脾细胞中分泌IFN- γ的细胞频数(1)96孔平底硝酸纤维素板用抗小鼠IFN-Y单抗(5μ g/ml于PH 9. 6碳酸盐缓冲液中)包被，4°C过夜；(2)第二天经0. 05% Tween PBS (PBST)洗涤后，该板用含10% FCS的1640培养液 37°C孵箱封闭2小时；(3)经PBST洗涤后，对于实施例2中所述免疫后小鼠，每孔加入5X IO5脾细胞， 再加入2. 5 μ g/ml的HCA587蛋白，对照组包括培基对照和OVA无关蛋白对照，各三复孔，于 37°C,5% CO2 孵育 20 小时；(4)用PBST洗板3遍以去除残留细胞；随后加入生物素标记的抗小鼠IFN-单抗 (1. 5 μ g/ml)，于37°C孵育2小时后，洗板6遍；(5)加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(1 μ g/ml)在室温避光孵育1小时；(6)洗板8遍后，加入底物BCIP-NBT显色液避光显色2_5分钟，用自来水冲洗，终止反应；待反应板晾干后，于ELISpot全自动计数仪下计数每孔的斑点数；(7)每组斑点数均由三复孔的平均值得出并以spots/5X 105SplenOCyteS表示； 为了去除背景的干扰以更准确的反映免疫应答的特异性，定义应答指数(RI Responding hdex)，其计算方法如下
加入蛋白的实验组的spots-未加蛋白的对照组 RI =的 spots
未加蛋白的对照组的spotsRI >= 2，且实验组spots > 10可判定为应答阳性结果。HCA587蛋白与CpG和ISCOM两种佐剂联用后，分泌IFN- γ的HCA587抗原特异性的淋巴细胞频数明显升高，与其他各组相比，具有显著差异(Ρ< 0.0001) ；HCA587与CpG联用时，可见低频数的分泌IFN- γ的抗原特异的淋巴细胞；而HCA587重组蛋白单独与ISCOM 或弗氏佐剂(FA)联用时，未见分泌IFN-Y的HCA587特异的细胞(图1)。这些结果说明在小鼠体内，HCA587重组蛋白与CpG和ISCOM佐剂联合免疫后，能诱导产生特异且高强度的细胞免疫应答。实施例4小鼠脾细胞胞内细胞因子染色分析(1)HCA587蛋白联合CpG和ISCOM佐剂免疫小鼠后，脾细胞(5X106/ml)在含有 10 μ g/ml的HCA587蛋白(培基和OVA蛋白作为对照)及10% FCS的1640培基中培养Mh， 在培养终止前18h时，加入Bredfeldin A (1 μ 1/孔，1 1000稀释)。(2)收获培养细胞，用含2% NCS的BSS缓冲液洗涤后，用抗小鼠⑶4和⑶8的抗体进行表面分子染色30分钟，4°C，洗涤；(3)离心，弃上清，用500 μ 1固定液室温固定20min，用含2% NCS的BSS缓冲液洗
7涤；(4)离心，弃上清，用500 μ 1的1 X通透液室温通透lOmin，用1 X通透液洗涤一次；(5)离心，弃上清时残留50μ 1，细胞分别用PE-anti-IFN-γ和APC-anti-IL-4抗体进行染色，冰上30分钟。染色后，细胞用IX通透液洗2次后，重悬在含2% NCS的BSS 缓冲液中，进行流式上样分析。免疫后小鼠脾细胞体外HCA587蛋白刺激M小时，Bredfeldin A将细胞分泌的细胞因子阻断在细胞内，IFN-Y和IL-4双染后，流式分析结果如图2和图3显示，HCA587蛋白疫苗诱导产生的⑶4+T和⑶8+T细胞内均以产生IFN-Y为主，而细胞因子IL-4检测不到； 产生IFN-γ的细胞类型以CD4+T细胞为主。胞内流式结果说明HCA587蛋白疫苗能在体内诱导活化Thl型⑶4+T细胞。实施例5ELISA方法检测小鼠经过HCA587蛋白疫苗的免疫后产生的HCA587抗体水平(1)用包被缓冲液将HCA587抗原稀释成lyg/ml，每孔ΙΟΟμ 1，4°C过夜后，用 200 μ 1的PBST洗涤3次；(2)每孔加入200 μ 1 2% BSA的PBS，37°C封闭2小时，PBST洗涤3次；(3)将待检血清以不同稀释度加入反应板中，每孔加入量100μ 1，在37°C作用2小时后，PBST洗涤3次；(4)每孔加入HR标记的抗小鼠IgG抗体(1 25，000稀释)37°C作用1小时30 分钟后，PBST洗6次；(5)每孔加入TMB显色液100 μ 1，室温3-5分钟后，2Μ H2S04终止反应，在450nm 波长下，测定各孔的OD值。(6)结果以此判断(0D待检孔-OD空白孔)/(0D阴性孔-OD空白孔)> 2. 1为阳性。ELISA反应板中，各组小鼠血清以1观00倍稀释加入孔内，阴性对照为正常小鼠血清，空白对照用不加血清的PBS代替。小鼠经过HCA587蛋白疫苗免疫后，脾细胞在2. Syg/ml HCA587蛋白的刺激下培养24h，ELISA检测试剂盒检测细胞培养上清中细胞因子的分泌。见下图4，图5，图6，结果显示HCA587蛋白疫苗免疫后脾细胞在HCA587蛋白的刺激下，能分泌多种Thl类细胞因子， 如IFN-γ，IL-2，TNF-α，此结果进一步证实HCA587蛋白疫苗诱导的应答主要以Thl型免疫应答为主。实施例6小鼠脾细胞增殖试验HCA587蛋白疫苗免疫小鼠后，为观察脾细胞中HCA587抗原特异性的淋巴细胞，在再次遇到HCA587抗原时的增殖情况，我们用3H掺入的方法检测脾细胞增殖能力，具体步骤如下将免疫后小鼠脾细胞以IX IO6/孔铺入96孔平底板；于孔中加入2. 5 μ g/ml的HCA587蛋白，对照组包括培基对照和OVA无关蛋白对照，每组三复孔，于37°C，5% C02孵育72小时；终止培养前IOh时，加入0. 5 μ Ci/ml3H,在液闪仪下测定各组放射活性，取各组平均值观察增殖活性。小鼠在经过HCA587蛋白疫苗免疫后，利用咕掺入法检测脾细胞的增殖能力。 HCA587蛋白疫苗免疫后(包括佐剂对照组和缓冲液对照组)小鼠脾细胞用2.5yg/ml HCA587蛋白刺激72h，培养结束前IOh掺入3H。如图7，可见HCA587蛋白疫苗免疫组小鼠的脾细胞在HCA587蛋白的刺激下，呈现特异性的增殖(与无关蛋白OVA相比，P值=0. 0251)， 而佐剂对照组小鼠脾细胞则未见特异增殖，二组之间具有显著性差异(P值=0.0204)。说明HCA587蛋白疫苗诱导产生的记忆性T淋巴细胞在HCA587蛋白刺激下能呈现特异而且快速的增殖。实施例7ELISA方法检测小鼠免疫后脾细胞培养上清和血清中的细胞因子水平脾细胞培养上清的制备实验分三组进行，分别用HCA587+CpG+ISC0M(蛋白疫苗)、CpG+ISC0M(佐剂对照)和PBS(缓冲液对照)免疫小鼠，第二次免疫后两周收获脾细胞。脾细胞重悬于10% FCS的1640培基中，将其以5 X IO6/孔铺入M孔板，加入2. 5 μ g/ ml的HCA587蛋白(OVA蛋白作为无关蛋白对照)培养，24h小时后收获上清，对其中的细胞因子类型进行检测，包括IFN- y , IL-2、TNF-a和IL-IO0血清的制备实验分三组进行，分别用HCA587+CpG+ISC0M(蛋白疫苗)、 CpG+ISCOM(佐剂对照)和HCA587蛋白(单纯蛋白的对照)免疫小鼠，各组15只小鼠，分别于第二次免疫后ωι、24Κ4 !处死5只小鼠，采取血清，了解免疫后小鼠体内产生的细胞因子类型及其动态变化。检测的细胞因子有IFN- y、IL-12、IL-6和IL-10。小鼠血清、上清IFN- γ、IL-12按美国R&D公司提供的ELISA试剂盒说明书操作； 小鼠血清、上清IL-2、IL-6、TNF-a和IL-10按北京达科为生物科技公司提供的ELISA试剂盒说明书操作。在第二次免疫结束后收集6h，24h和4 的血清，对血清中IFN- γ，IL-12，IL-6 和IL-10的水平进行了检测。如图8-10所示，单纯的HCA587蛋白免疫，不能刺激免疫细胞分泌细胞因子；当HCA587蛋白在联合了 CpG和ISCOM双重佐剂后，机体不仅产生了如期的佐剂效应，分泌IL-12和IL-6(图9，10，HCA587蛋白疫苗组与佐剂对照组无差异)，同时对 HCA587特异性的应答也大大增强，表现为血清中大量IFN- γ的释放，且在疫苗注射后的他即达到很高水平，与佐剂对照组相比，具有显著性差异(图8，Ρ = 0.0313)。而Th2类细胞因子IL-10水平很低，检测不到。这些结果表明HCA587蛋白疫苗能诱导机体免疫细胞产生大量的Thl型细胞因子，从而启动Thl型免疫应答，并且IFN- γ的分泌是HCA587抗原特异的。实施例8稳定表达HCA587的B16瘤细胞克隆株的构建1、重组质粒 pEGFP-Cl-HCA587 的提取含重组质粒pEGFP-Cl-HCA587的BL21菌用划痕法在LB固体培养基(加入卡那霉素)上划痕，37°C孵箱培养12-1他。挑取单克隆入LB液体培养基(含卡那霉素)于37°C 摇床里培养16h，之后收获细菌沉淀，进行质粒提取。质粒提取使用Promega公司试剂盒，步骤简述如下(1) IOOOOrpmX Imin,室温离心，收集过夜培养的菌液；(2)加入250 μ 1重悬液，充分地重悬细菌菌体；(3)加入10 μ 1碱性蛋白酶，颠倒4次充分混勻，室温孵育5min ；
(4)加入350 μ 1中和液，颠倒4次充分混勻；(5)室温离心，I2OOOrpmX3Omin ；(6)将吸附柱置入收集管中；(7)将离心后的上清移入吸附柱内；(8)室温离心，12000rpmX lmin,弃掉滤出液，重新将吸附柱置入收集管中；(9)加入750 μ 1洗涤液，室温离心，12000rpmXlmin，弃掉滤出液；(10)加入250 μ 1洗涤液重复步骤9)；(11)室温离心，12000rpmX2min ；(12)将吸附柱置入1. 5mlEP管；(13)加入100μ 1无核酸酶的水，室温静置5min，12000rpmXanin ；(14)质粒DNA分装贮存于_20°C。pEGFP-Cl-HCA587重组质粒经测序证实无突变后，做后续转染用。2、G418筛选浓度的确定将B16细胞以1000个细胞/孔铺入M孔板，Iml/孔。24h后于各孔中加入G418， G418 浓度梯度为 0，100，200，300,400, 500，600，700，800，900，1000ng/ml。培养 10-14 天后， 以最低细胞全部死亡浓度为基准，压力筛选时选择比该浓度再高的一个级别(作为筛选浓度)，压力维持时使用筛选浓度的半量。3、B16细胞的瞬时转染B16细胞以每孔6 X IO4的起始细胞数于M孔板中培养1天，培基为含10% FCS 的Opti-MEM，待生长至90-95%汇合度时，即可用于转染。质粒用前lOOOOrpm，10min，4°C离心。将0. 9 μ g pEGFP-Cl-HCA587重组质粒用50 μ 1 Opti-MEM 无血清无双抗培养基稀释，轻轻混勻；2. 5 μ 1 Lipofectamine 2000转染试剂用50 μ 1 Opti-MEM 培基稀释，轻柔混勻，室温孵育5min。将制备好的两个mix轻柔混勻，室温孵育20min。孵育结束后，将此complex加入到含细胞和培基的孔中，继续培养Mh。本实验中也以pEGFP-Cl空载体平行转染了 B16细胞，作为后续实验的对照。4、转染后B16细胞的筛选和阳性单克隆的建立B16细胞完成重组质粒pEGFP-Cl-HCA587的瞬时转染，24h后作梯度(如20、50、 100倍)稀释到6孔板，用G418压力筛选3-4周。荧光显微镜下观察形成克隆簇的细胞团， 将GFP阳性的混合克隆簇挑出，重悬到培养基中计数。将细胞用有限稀释法稀释到96孔板中，每孔0. 8个细胞，并加入小鼠脾细胞作饲养细胞开始培养。克隆逐渐长大，约10天后， 挑出荧光显微镜下GFP阳性的克隆转移到M孔板，长满后取小部分细胞进行流式细胞仪鉴定，选取GFP阳性的单一克隆，转入6孔板中培养扩增。实施例9HCA587蛋白疫苗对B16-HCA587瘤细胞的预防效应实验取6-8周龄C57BL/6小鼠，每组12只。预防免疫分组为(1)蛋白疫苗组 HCA587+CpG+ISC0M ； (2)单纯佐剂组:CpG+ISC0M ； (3)单纯 HCA587 蛋白组:HCA587 蛋白； (4)未处理，即观察组。HCA587蛋白10 μ g/只，CpG12 μ g/只，佐剂ISCOM 12 μ g/只。实验体积为100 μ 1/只，尾根部皮下注射，于第0、21天免疫。第二次免疫后14天，皮下接种 IX IO4/只(100μ 1)B16-HCA587D12克隆细胞，接种部位为小鼠右侧胁腹部，成瘤后每周测量肿瘤大小2-3次。
结果如图11所示，HCA587蛋白疫苗免疫组显示了良好的预防肿瘤生长的作用，观察到第120天时成瘤率为16. 7%,12只小鼠中仅两只小鼠成瘤，且成瘤时间均在60天之后；HCA587蛋白免疫组和CpG+ISCOM佐剂免疫组成瘤率分别为75%和66. 7%，未免疫组的小鼠成瘤率为100%。实施例10蛋白疫苗的抗肿瘤效应利用荷瘤小鼠动物模型，对HCA587蛋白疫苗在体内的抗肿瘤效果进行评估。小鼠接种肿瘤细胞后的第7天开始给予疫苗治疗，并于第21天再次给予疫苗。经过HCA587蛋白疫苗治疗后，小鼠肿瘤生长减慢，与未治疗组有显著差异(图12，P = 0.0346)，而单纯蛋白治疗组和单纯佐剂治疗组与未治疗组相比，未见明显差异(图12) ；HCA587蛋白疫苗治疗后，荷瘤小鼠生存时间明显延长，与未治疗组相比有显著差异(图13，P = 0.0056)，蛋白治疗或佐剂治疗组与未治疗组相比，并不能改善荷瘤小鼠的生存期(图13)。将表达GFP的B16肿瘤细胞作为对照细胞，接种小鼠后，给予HCA587蛋白疫苗治疗。HCA587蛋白疫苗并不能延缓肿瘤细胞的生长，也不能改善荷瘤小鼠的生存期。以上结果说明HCA587蛋白疫苗的抗肿瘤效果是针对HCA587抗原表达的肿瘤细胞。


本发明公开了属于医学肿瘤学技术领域的一种肿瘤-睾丸抗原HCA587蛋白疫苗及其应用。本发明的蛋白疫苗包括HCA587蛋白、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、ISCOM佐剂、CpG ODN-1826。本发明的HCA587蛋白疫苗能够诱导CD4和CD8T细胞免疫应答和体液免疫应答，并且能够预防小鼠肿瘤的生长，对已建立肿瘤的荷瘤小鼠可延长其存活期，抑制肿瘤的生长速度，具有很好的抗肿瘤效果，为HCA587蛋白疫苗的临床应用奠定了科学基础。