专利名称：苏云金芽孢杆菌mb-15菌株及其可湿性粉剂的制备方法苏云金芽孢杆菌iBaciIlus thuringiensi51,简称Bt),是一种分布极广的革兰氏阳性细菌，其制剂是目前世界上产量最大的微生物杀虫剂(喻子牛.苏云金芽孢杆菌制剂的生产与应用[M].北京:农业出版社，1993.)。其广泛用于防治鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目等9个目的多种昆虫(Schnepf E., Crickmore N., Van Rie, et al.Bacillus thuringi ensis and its pesticidal crystal proteins[J].Microbiol MolBiol Rev, 1998,62:775-806.)。Bt制剂的主要活性成分是其在稳定生长期形成的伴孢晶体(parasporal crystal protein),又称杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein,I CP)，ICP可占培养物生物量总干重的20% 30%，分子量在27 150kDa之间(ChattopadhyayA., Bhatnagar N.B., Bhatnagar R.Bacterial Insecticidal Toxins[J].CriticalReviews in Microbiology, 2004, 30 (I): 33-54.)。自本世纪初发现，苏云金芽孢杆菌至今已有100多年的历史，在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用。但是，随着Bt应用范围的不断扩大，Bt作为杀虫剂的缺陷也日益暴露，表现为:杀虫谱窄，杀虫速度慢，其中最为严重的是抗性昆虫的产生。自上世纪80年代中期开始，抗性问题在实验室以及田间试验中都得到证实(William H.M.1nsect resistanceto the Biological insecticide Bacillus thuringiensis\_]~.Science.1995,229(4709): 193-195)，原因主要是持续使用单品种以及亚致死剂量的Bt及Bt转基因抗虫植物的应用，昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力所造成。到目前为止，室内人工选择条件下，已证实分属鳞翅目、鞘翅目、双翅目等近20种昆虫对Bt菌株或毒素可以产生抗性(Bauer.L.S，1995.Resistance:a threat to insecticidal crystal proteins ofBacillus thuringiensis [J].Florida Entomologist, 78 (3)，414-443.)。而小菜蛾在田间自然条件下对Bt表现高抗性则警示人们，昆虫Bt的抗性问题已经不容忽视(TabashnikB E, Cushing N L, Finson N, et al.Field development of resistance to Bacillusthuringi ensis in diamondback moth (Lepidoptera:PlutelIidae) [J].Journal ofEconomic Entomology, 1990,83:1671-1676.Sayyed A.H., Gatsi R., Ibiza-PalaciosM.S., et al.Common, but Complex, Mode of Resistance of Plutella xylostel lato Bacillus thuringi ensi s Toxins CrylAb and CrylAc.Appled and EnvironmentalMicrobiology, 2005,71(11): 6863 - 6869)。因此，为了避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力菌株及制剂是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治也有着十分重要的意义。直到目前，苏云金芽孢杆菌常 用的剂型包括以水为介质的水悬剂、以有机溶剂为介质的油悬剂和以固体填充剂为介质的可湿性粉剂。尽管近年来水分散性粒剂和胶囊剂等新剂型发展迅猛，但无论从产品登记数量还是产量来看，目前可湿性粉剂在现代农药剂型中仍占据重要地位，并且由于可湿性粉剂与水具有高度亲和性，能够形成稳定的悬浮液，可喷雾施用，具有便于运输、贮藏、施用、使用方便、无有机溶剂、无环境污染以及加工成本低等优点，所以本专利以可湿性粉剂作为Bt的应用剂型。
本发明的目的之一是提供一株对鳞翅目蔬菜害虫棉铃虫、甜菜夜蛾、小菜蛾、斜纹夜蛾和菜粉蝶等幼虫具有广谱高毒力的苏云金芽孢杆菌新菌株MB-15。本发明的第二个目的是针对以往苏云金芽孢杆菌制剂存在的持效期短、性能不稳定、起效慢等问题，提供一种苏云金芽孢杆菌MB-15可湿性粉剂及制备方法。本发明的第三个目的是提供了苏云金芽孢杆菌MB-15在防治蔬菜鳞翅目害虫上的用途。为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案实现: 本发明提供的菌株MB-15为芽孢杆菌属(BaciIIus)，苏云金芽孢杆菌(BaciIIusthuringiensis),简称Bt MB-15。已于2011年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委理员会普通微生物中心(简称06110:，地址为:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为 CGMCC Na.5255。所述苏云金芽孢杆菌CGMCC Ns.5255的筛选方法为醋酸钠-抗生素法筛选，用含有青霉素钠盐的醋酸钠选择性液体培养基培养土样(200r/min，30°C)4h, 土壤悬液离心，取上清65°C热处理后涂LB固体平板，30°C培养3-4d，从平板上挑取Bt单菌落涂片，用考马斯亮蓝染色，发现一株含有菱形晶体形态的Bt菌株，将其命名为MB-15。经鉴定，苏云金芽 孢杆菌CGMCC Na.5255菌株包括如下信息:经过30°C恒温培养72h后，能产生菱形伴孢晶体(见图1) ；SDS-PAGE电泳分析显示，该菌株主要产生130.0kDa和65.0kDa大小的蛋白条带(见图2);其晶体蛋白在48h开始少量表达，72_96h这期间是该菌株产晶高峰期，120h以后伴孢晶体开始逐渐减少；对该菌株生长特性的测定表明该菌株与标准菌株HD-1的生长特性无明显差异(见图3);基因型鉴定表明该菌株含有crylAc, cry2Ac和vip3Aa四种基因(见图4、图5和表I)。表I菌株MB-15杀虫基因型鉴定
本发明公开了一株对蔬菜鳞翅目害虫具有广谱高毒力的苏云金芽胞杆菌MB-15(BacillusthuringiensisMB-15)，菌株保藏号为CGMCC№.5255。该菌株能形成菱形杀虫晶体蛋白，含有cry1I、cry1Ac、cry2Ac和vip3Aa四种基因，对小菜蛾、菜粉蝶、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫等鳞翅目害虫具有高效的杀虫活性。本发明还涉及该菌株可湿性粉剂的制备方法，该可湿性粉剂主要组分和含量为苏云金芽孢杆菌MB-15菌粉40.0~50.0%，分散剂5.0~10.0%，润湿剂5.0~10.0%，稳定剂0.5~1.0%，紫外光保护剂0.5~1.0%，载体28.0~49.0%。该可湿性粉剂可用于防治蔬菜上多种鳞翅目害虫，具有广谱、高效、安全等特点。