专利名称：牙齿支架的制作方法牙齿支架相关申请的交叉引用本申请要求2009年6月17日提交的美国临时申请号61/187，875和2010年6月11日提交的美国临时申请号61/354，164的权益；它们通过全文引用结合到本文中。本发明涉及组织工程支架。牛物医学工稈和牙齿再牛。掉牙通常由各种口腔疾病和生理起因引起，包括龋齿、 牙周病、损伤、遗传病和老龄化(Amar 2003, Philstrom2005, Kim 2006)。掉牙可导致身体和精神的痛苦，其可降低个体的自尊和生活品质(Amar 2003，Philstrom 2005,Kim 2006)。许多形式的牙病和一些医学病况如不受控的糖尿病提高掉牙的风险。对于无牙症的治疗，目前的选择局限于使用牙齿移植物和/或常规的固定或可移动假体。近来，生物医学工程工具的出现和发展已导致在医学领域新的患者护理范围。例如，初步人临床实验已报道在成骨不全的儿童中在全身灌注骨髓基质干细胞(BMSSC)或骨髓细胞之后骨形成水平提高(Horwitz 2001, Horwitz 2002)。在牙齿组织工程、材料科学和干细胞生物学领域近来的进展提出，牙齿再生将是可能的(Duailibi 2006)。此外，存在于牙齿或颅面组织的不同的间充质干细胞(MSC)的近来的鉴定扩展了在帮助牙齿组织(比如牙质、牙骨质和牙周韧带(PDL))再生中潜在的临床益处范围(Shi 2005)。存在于乳牙和固齿的髓组织中的牙齿组织远祖细胞可用于使牙质和牙槽骨再生(Shi 2005 ；Zhang 2005)。此外，由大鼠和猪牙蕾二者分离的细胞可用于生物工程解剖学校正牙冠，但是具有有限的可预测性(Duailibi 2004，Honda 2005，Young 2002，Young 2005)。牙齿/牙周复合体通常称为个体器官。虽然认为该器官相对小，但是其结构和发育复杂性是公认的。牙齿结构由三种钙化的组织类型(牙釉质、牙质和牙骨质以及牙髓)组成。牙质占据牙齿的主体，而牙釉质和牙骨质分别覆盖牙冠和尖端部分。牙周组织具有对牙齿的支持作用，并且由牙骨质、牙周韧带、牙槽骨和牙龈组成。牙周韧带为通过贯穿纤维(Sharpey’s fiber)使牙骨质与牙槽骨连接的连接组织。牙周韧带能感知和缓冲咀嚼期间的机械力。尽管牙齿结构复杂，但是生物医学工程技术的进展已产生两种目前采用的牙齿再生方法。第一种方法基于组织工程，目标是通过在支架生物材料中接种干细胞使牙齿再生(Young 2002, Duailibi 2004, Honda 2005)。该技术已显示牙周组织再生的有希望的结果(Nakahara2006)。第二种方法试图复制或模仿胚胎牙齿形成的发育过程(Nakahara 2006)。该方法利用由小鼠胎儿采集的胚胎组织(牙齿上皮和牙齿间充质)并需要了解在胚胎中调节早期牙齿发育的原理(0hazama2004，Hu 2006,Nakao 2007)。采用这些方法，在许多研究中，将生物工程化的牙胚移植到动物宿主的身体中，所述动物宿主通常为啮齿动物，其中存在足够的血流来提供必要的营养物和氧，以使组织形成最佳(Nakahara 2006)。在组织再生中使用干细胞以及遇到的挑战。干细胞为存在于正常组织中的静止的细胞群，其呈现不对称的细胞分裂的不同的特性，形成两种子系细胞-新的远祖细胞/干细胞和能形成分化的组织的另一种子系细胞(Hawkins 1998, Lin 1998)。牙齿间充质远祖细胞已被鉴定并且特征为人乳牙和固齿两者的牙髓(Gronthos 2000, Mooney 1996，Shi2005)。如前面提及的，存在于未成熟的牙蕾中的这些后天的上皮和间充质牙齿干细胞/远祖细胞已证明能产生生物工程化的和解剖学的校正，但是使含有牙釉质、牙质、髓和牙槽骨的牙冠的大小微型化(Shi 2005 ；Zhang 2005)。已知牙周韧带细胞它们的再生潜能，以引起形成固有层、牙骨质、骨和牙周韧带(Melcher 1985, McCulloh 1985)。对于由牙周韧带的主要外植体衍生的细胞的亚群，已证明牙周韧带干细胞体外形成矿化的沉积物的能力(Arceo 1991, Cho 1992)。相信牙周韧带干细胞需要合适的支架来诱导体内形成骨、牙质和牙骨质(Gronthos 2000，Krebsbachl998)。当将牙周韧带干细胞掺入到羟基磷灰石/磷酸三钙支架中并在小鼠背部的皮下区域中异位移植时，形成典型的牙骨质/牙周韧带样结构(Seo 2004)。此外，已证明在移植物内的I型胶原蛋白-阳性牙周韧带样组织与新形成的牙骨质连接，它在形态上与贯穿纤维类似(Seo2004)。牙齿干细胞生物技术和细胞-介导的鼠科牙齿再生的近来的发展助长了研究者探究具有适当功能性质的活的牙齿再生的潜能(DuaiIibi2004,Ohazama 2004, Shi 2005)。可使用许多不同的干细胞使鼠科牙齿再生，以在体内协同形成牙齿结构(Duailibi 2004，Ohazama 2004,Young 2005)。此外，当移植到免疫受损的小鼠中时，分别通过人牙髓干细胞(DPSC)和牙周韧带干细胞(F1DLSC)使牙质/髓组织和牙骨质/牙周复合体再生(Gronthos2000，Seo 2004)。然而，由于人牙齿生长和发育的复杂性，用目前可用的再生生物技术，整个牙齿结构(包括牙釉质、牙质/髓复合体和牙周组织)作为人的功能实体的再生是一个挑战(Sonomaya 2006)。在先前的研究中已报道了在牙齿组织的再生中使用干细胞的挑战(Duailibi2004,Young 2002,Young 2005)。已公认，虽然在生物工程化的牙齿构造中形成多个微型牙冠是可能的，但是实际大小的整牙再生遇到许多挑战。这些挑战同样归结于牙齿发育的复杂性质(Duailibi 2006, Tummers 2003)。细胞归位的概念。已提出，在支架内干细胞-接种的常规方法的目的是模仿细胞结构和在体外或体内重新产生功能组织等价物。细胞衍生自终端器官或更加未分化的来源比如骨髓(Schantz 2007)。这些方法受到问题的限制，比如来自细胞采集的供体部位发病率和在细胞-支架构造的移植部位的异质品质的组织形成(Schantz 2007)。因此，细胞归位的概念目前引起较多的关注。细胞归位目的是诱导期望的细胞在特定的解剖学部位归位至充满细胞因子的支架(Schantz 2007)。该方法试图体内组织再生，而无需细胞-接种。因此，细胞归位可为组织工程提供细胞方法的增强和为组织再生提供新型最小侵入的选择(Schantz2007)。基于上述讨论，需要牙齿支架的进一步开发。本发明解决该需求。概述在一些实施方案中，提供了一种无细胞哺乳动物牙齿形支架。所述支架包含趋化性、成骨性、成牙质性、成釉质性或成牙骨质性化合物。在其它实施方案中，提供了一种在哺乳动物的嘴中代替牙齿的方法。在这些实施方案中，牙齿缺失并且在嘴中在缺失牙齿的位置存在牙槽。所述方法包括在牙槽中植入具有丢失牙齿的形状的无细胞支架。此外，提供了制备牙齿支架的方法。所述方法包括合成哺乳动物牙齿形状的无细胞支架并加入至少一种趋化性、成骨性、成牙质性、成釉质性或成牙骨质性化合物。其它目的和特征部分是显而易见的，部分在下文中指出附图简述本领域技术人员将理解以下描述的附图仅用于说明的目的。这些附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。图I为显示在实施例中描述的研究的设计的流程图。图2为显示使用3D印刷系统(Bioplotter )的支架制造的照片。图A显示用于产生支架的Bioplotter ;图B显示制造的大鼠下颌中央门牙根(左)和人臼齿形PCL-HA支架(右)；图C显示用于使支架灭菌的环氧乙烷灭菌器；图D显示用生长因子(SDF1和BMP-7)处理的支架；图E显示在移植前用于在支架中胶原蛋白交联的温育的支架；图F显示被生长因子和胶原蛋白凝胶负载的支架；图G显示在拔出槽和背部部位在大鼠中移植的支架。图3为用于在大鼠背部移植的制造的人下颌臼齿形支架的照片。冠和根单独制造并后来融合。微通道明显。图4为拔出下颌中央门牙然后在槽中移植根形支架的照片。图A显示下唇的回缩；图B显示牙龈瓣的切开和反射；图(显示左下颌中央门牙的无创伤拔出，显示槽的保存的骨壁；图D显示拔出的门牙和根形支架的比较；图E显示在拔出槽中移植的支架；图F显示缝合的和主要封闭的牙龈瓣。图5为在大鼠背部部位中皮下移植的人下颌臼齿形支架的照片。图A显示制造的2-cm切口；图B显示产生皮下袋；图C显示将支架移植到袋中；图D显示主要闭合。图6为显示下颌中央门牙支架的整体采集的照片。图A显示在采集之前明显的完全伤口愈合；图B显示为接近支架制造的切口 ；图(显示支架(右)和相邻的门牙(左)的整体采集。图7为显示用于在背部部位移植的支架采集的程序的照片。图A显示在采集之前完全伤口愈合；图B显示为接近支架制造的切口；图C显示支架的筋膜包封；图D显示回收的支架。图8为显示选择用于组织学分析的区域的染色的支架部分的显微照片。图A显示在下颌中央门牙支架中选择的三个区域；图B显示在人下颌白齿支架中选择的四个区域。图9为显示在拔出槽内的门牙根形支架的组织-支架界面的染色的支架部分的显微照片(测试和对照组)。图A显示描述在界面骨向内生长的冯科萨氏(VK)-染色的载玻片；图B显示苏木精和曙红(H&E)-染色的部分，其显示支架对槽壁的亲密适应和整合；图〇显示证明在PCL-HA线之间明显的血管生成和软组织向内生长的较高放大图。图10为显示来自背部部位的人下颌白齿形支架的组织-支架界面的染色的支架部分的显微照片(测试和对照组)。图A显示在线周围和在线之间的组织的血管生成和向内生长；图B显示说明在支架和包封组织之间的整合的较高放大图。图11为染色的支架部分的显微照片，其显示来自拔出槽的支架的代表性图，其显示测试支架(图A)与不含生长因子的对照支架(图B)的细胞密度差异。图12为染色的支架部分的显微照片，其显示来自背部部位的支架的代表性图，其显示测试支架(图A)与不含生长因子的对照支架(图B)的细胞密度差异。图13为显示在实验组和移植部位之间的细胞密度差异的图。GF+ :测试；GF_ :对照。p < 0. 05。图14为染色的支架部分的显微照片，其显示来自拔出槽的支架的代表性图，其显示测试支架(图A)与不含生长因子的对照支架(图B)的血管密度差异。图15为染色的支架部分的显微照片，其显示来自背部部位的支架的代表性图，其显示测试支架(图A)与不含生长因子的对照支架(图B)的细胞密度差异。图16为显示在实验组和移植部位之间的血管密度差异的图。GF+ :测试；GF_ :对照。p < 0. 05。图17为染色的支架部分的显微照片，其显示说明来自拔出槽(图A)与背部部位 (图B)的支架的血管直径差异的代表性图。图18为显示在实验组和移植部位之间的血管直径差异的图。GF+ :测试；GF-:对照。“*”:p < 0.05。图19为VK-染色的支架部分的显微照片，其显示来自拔出槽的测试组支架的代表性图，其显示矿化。图20为VK-染色的支架部分的显微照片，其显示来自背部部位的测试组支架的代表性图，其显示矿化。详述本发明部分基于以下意外的发现，当移植到牙槽内时，牙齿形支架将吸引移殖到支架的细胞以提供活的牙齿，即使没有外源性地为支架提供细胞。因此，在一些实施方案中，提供了一种无细胞哺乳动物牙齿形支架。所述支架包含趋化性、成骨性、成牙质性、成釉质性或成牙骨质性化合物。因此移植这些支架,而没有外源性施用的细胞。如在实施例中建立的，通过迁移进入支架的本地细胞，移植的支架的移殖充分进行。通过掺入到支架中的趋化性、成骨性、成牙质性、成釉质性或成牙骨质性化合物，移殖得到进一步助长。所述化合物可具有任何结构，包括但不限于蛋白、低聚肽、小的有机分子(即，小于约2000mw或约IOOOmw或约500mw)、含金属离子的分子、碳水化合物或脂质。本文使用的趋化性化合物为吸引细胞的化合物。成骨性化合物为助长新骨合成的化合物。成牙质性化合物为助长新牙质合成的化合物。成釉质性化合物为助长牙齿牙釉质合成的化合物。成牙骨质性化合物为助长牙骨质合成的化合物。本文使用的“支架”为对细胞的生长和/或组织的形成提供基质的结构。支架的有用的性质为多孔性、生物相容性和生物降解性、能支持细胞生长及其作为受控的基因-和蛋白-递送媒介物的用途(Murphyl999)。支架提供的三维大分子结构引导生物工程化的组织的最终形状(Murphy 1999)。这些实施方案的支架可具有任何哺乳动物牙齿的形状。在这些实施方案的一些中，支架具有人门牙、人犬牙、人双尖牙或人白齿的形状。在这些实施方案中的化合物可为趋化性、成骨性、成牙质性、成釉质性或成牙骨质性的任何化合物。非限制性实例包括血小板-衍生的生长因子(TOGF)、内皮细胞生长因子(ECGF)、转换生长因子UTGF-P I)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、基质细胞-衍生的因子-I (SDFl)、骨形态发生蛋白(BMP) >TGF-^、生长和分化因子(OTF)、胰岛素样生长因子-I (IGFl)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、牙质基质蛋白、牙质涎腺蛋白、骨涎腺蛋白、牙釉蛋白或整联蛋白。在一些实施方案中，所述化合物为具有趋化性性质的SDFl。SDFl为趋化因子，据信它对于创伤后组织修复在干细胞和远祖细胞补充(recruitment)中是必要的(Kollet2003)。SDFl还可诱导造血远祖细胞在化学趋化性室内的迁移(Kim 1998)。此外，SDFl对于骨髓基质细胞向骨髓迁移是重要的，如间充质干细胞(MSC)响应SDFl刺激的剂量-依赖性迁移所显示(Win 2004)。SDFl还具有抗凋亡性质，直接保护造血干细胞免受在其它生长因子存在下Y-辐射的凋亡效应(Herodin 2003)。此外，可引导衍生自骨髓的间充质干细胞(MSC)朝向 SDFl 迁移(Schantz 2007)。在其它实施方案中，所述化合物为BMP。BMP2、6和9显然是MSC成骨性分化的最有效的试剂，而其余的BMP在促进交付(commit)的成骨细胞前体和成骨细胞的末端分化方 面更有效(Cheng 2003)。在这些实施方案的一些方面中，所述BMP为BMP-7。BMP-7在将间充质细胞转化为骨和软骨中起到关键的作用。BMP-7处理足以诱导在各种细胞类型中成骨细胞分化的所有基因标记物(Chen 2004)。注意到，BMP-7已得到食品和药品管理局(FDA)的批准用于人临床使用。许多研究已调查了外源性生长因子在将生长因子递送至移植部位的载体中的作用和行为。虽然载体可能不能贡献组织形成所需的任何另外的因素，但仍可以是生长过程的重要组分(Wozney 1990)。载体功能之一是保持移植部位的因子，并因此提高其局部浓度。载体还用作其中可形成组织并因此帮助限定其中可形成新组织的区域的环境(Whang1998)。胶原蛋白或合成载体已用作递送媒介物，并且它们的物理化学性质以及产生的微观环境在诱导的结果中起作用。载体可为固体异种性(例如，轻基磷灰石)(Kuboki 1995,Murata 1998)、固体异源体性(聚乙烯聚合物)材料(Saito 1998, Isobe 1999)或自生的凝胶(Sweeney 1995, Schwartz 1998)、异源性(Bax 1999, Viljanen 1997)或异源体性来源(Santos 1998)以及上述的组合(Alpaslan 1996)。载体功能之一是在移植部位保持因子并因此提供其局部浓度。胶原蛋白基质在初期浸溃期间保持至多65%的BMP，并在两个阶段中将它释放在移植数小时内的初期阶段和取决于载体性质及其几何特性的第二阶段(Uludag 1999)。相信BMP不与载体结合(Uludag 1999)，而是物理截留于它的结构中，这使得某些设计与其它相比更有利于骨诱导(Tsuruga 1997)。在胶原蛋白海绵载体的情况下，大量的胶原蛋白交联和灭菌方法影响BMP沉淀，和随后胶原酶的海绵降解的抗性(FrieSS1999)。与聚合基质相比，胶原蛋白载体还可导致再生骨密度提高(Cochran 1997)。BMP-7在将间充质细胞转化为骨和软骨中起到关键的作用。BMP-7处理足以诱导在各种细胞类型中成骨细胞分化的所有基因标记物(Chen 2004)。还值得注意到，BMP-7已得到食品和药品管理局(FDA)的批准用于人临床使用。在这些支架的一些中，存在趋化性生长因子以及成骨性、成牙质性、成釉质性或成牙骨质性生长因子。在一个具体的实施方案中，所述趋化性生长因子为SDFl，并且所述成骨性、成牙质性、成釉质性或成牙骨质性生长因子为BMP-7。这些实施方案的支架可进一步包含任何其它生物活性分子，例如抗生素或另外的趋化性生长因子或另一种成骨性、成牙质性、成釉质性或成牙骨质性生长因子。在一些实施方案中，通过加入例如人血清白蛋白(HSA)、羟乙基淀粉、葡聚糖或它们的组合，将支架加强。用于本申请组合物的这些化合物的合适的浓度为本领域技术人员已知的，或者无需过度实验可容易地确定。支架中化合物的浓度根据化合物的性质、其生理作用和期望的治疗或诊断效果而变。治疗有效量通常为治疗剂显示期望的效果而无过度毒性的足够的浓度。在一些实施方案中，支架包含约10ng/g-1000 ii g/g支架的BMP-7在支架中和约10ng/g-1000 y g/g支架的SDFl在支架中。在更具体的实施方案中，BMP-7以约IOOii g/g支架在支架中，并且SDFl以100 Ii g/g支架在支架中。可通过任何已知的方法将化合物掺入支架中。在一些实施方案中，将化合物嵌入凝胶(例如，掺入到支架的孔中的胶原蛋白凝胶)，如实施例所述。或者，化学改性方法可用于将化合物共价连接在支架的表面上。使用本领域公知的偶联剂(比如醛化合物、碳二亚胺等)，可将支架的表面官能团与化合物的反应性官能团偶联，以形成共价键。此外，间隔分子可用于间隔表面反应性基团和生物分子的反应性基团，使得这些分子在基质的表面上更柔性。将生物分子与基质的内部或外部连接的其它类似方法为本领域技术人员已知。或者可通过基于载体的系统(比如包封媒介物)将化合物引入到基质内或基质上。这些媒介物可用作缓释组合物。例如，可将生长因子微包封，以提供增强的稳定性和/或延长的递送。包封媒介物包括但不限于微粒、脂质体、微球体等，或任何上述的组合，以提供不同比例的期望的释放分布。试剂的受控-释放递送的其它方法为专业技术人员已知。此外，可将这些和其它系统组合和/或修改，以使试剂在基质内的整合/释放最佳。聚合微球体可使用天然存在或合成的聚合物生产，并且为尺寸在0. 1-500 iim范围内的颗粒系统。聚合胶束和聚合物泡囊(poIymeromes)为具有与微球体类似特性的聚合递送媒介物，并且也能促进本文描述的化合物的包封和基质整合。对于各种有效载荷的微球体的制造、包封和稳定在本领域技术范围内(例如参见，Varde&Pack(2004)ExpertOpin.Biol. 4(1)35-51)。通过聚合物的类型、聚合物分子量、共聚物组成、加入到微球体制剂的赋形剂和微球体尺寸，可调适微球体的释放速率。可用于形成微球体的聚合物材料包括PLA、PLGA、涂有 DPPC 的 PLGA、DPPC, DSPC、EVAc、明胶、白蛋白、壳聚糖、葡聚糖、DL-PLG, SDLM、PEG(例如,ProMaxx)、透明质酸钠、二酮哌嗪衍生物(例如,Technosphere)、磷酸韩-PEG颗粒和/或寡糖衍生性DPPG(例如，Solidose)。可例如使用水/油单乳液方法、水-油-水双乳液方法或冻干实现包封。可利用几种工业包封技术(例如，ProLease ，Alkerme)。脂质体还可用于将化合物与支架整合。脂质体的试剂携带能力和释放速率可取决于脂质组成、尺寸、电荷、药物/脂质比率和递送方法。常规的脂质体由中性或阴离子脂质(天然或合成)组成。常用的脂质为卵磷脂，比如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺 、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇。脂质体包封方法为本领域通常已知(Galovic等人(2002) Eur. J. Pharm. Sci. 15，441-448 ；ffagner 等人(2002) J. Liposome Res. 12，259-270)。靶向的脂质体和反应性脂质体也可与试剂和基质组合使用。靶向的脂质体具有靶向配体，比如与它们的表面连接的单克隆抗体或外源凝集素，使得与特异性受体和/或细胞类型相互作用。反应性或多形态脂质体包括宽范围的脂质体，它们的共同性质是当特定的相互作用之后倾向于改变它们的相和结构(例如，PH-敏感性脂质体)。例如参见Lasic (1997)Liposomes in Gene Delivery (基因递送中的脂质体)，CRC Press, FL)。这些实施方案的支架可使用专业技术人员公认有用的任何材料来制造。合适的基质材料例如在以下讨论Ma和Elisseeff编辑(2005) Scaffolding in TissueEngineering(在组织工程中支架化)，CRC, ISBN 1574445219 ；Saltzman(2004)TissueEngineering EngineeringPrinciples for the Design of Replacement Organs andTissues (组织工程代替器官和组织的设计的工程原理)，Oxford ISBN 019514130X。用于全部或部分支架的可能有用的材料的非限制性实例包括聚乙二醇、聚丙交酯、聚羟基乙酸、丙交酯-乙交酯共聚物、聚(己内酯)、聚酸酐、polyglactin、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酸酐、聚氨基酸、聚原酸酯、聚乙缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚磷腈、可降解的聚氨酯、聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物和其它酰基取代的纤维素乙酸盐和它们的衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚乙烯基批咯烧酮、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、特氟龙 、尼龙、琼脂糖、藻酸盐(例如，藻酸钙凝胶)、纤维蛋白、纤维蛋白 原、纤维连接蛋白、胶原蛋白(例如，胶原蛋白凝胶)、明胶、透明质酸、几丁质和其它合适的聚合物和生物聚合物，或以上的类似物、混合物、组合和衍生物。在一些实施方案中，支架由包含骨传导(osteoconductive)材料的组合物制造。骨传导材料的非限制性实例为羟基磷灰石(HA)。由于HA优良的生物相容性和高生物活性，它已用作骨代用品许多年(Liao2006, Nebahat 2006, Lijun 2006, Wei 2003)。虽然HA具有良好的生物活性和骨传导性，但是它非常脆并且固有拉伸性质差。因此，在一些实施方案中，将HA与e -聚己内酯(PCL)组合。由于PCL需要好几年才在体内降解并且为生物相容性、相对廉价和可大量得到，它是良好的骨支架材料(Rich 2002，Kim 2004)。PCL和HA的组合(PCL-HA)提供了生物活性、生物降解性和强度的期望的组合(Patcharaporn 2005, Rezwan 2006, Landis 1995, Ziv 1994)。认为复合物 PCL-HA 的材料具有生物相容性、细胞-粘合、增殖和分化的最佳支架性质(Zhao 2008)。在一些实施方案中，支架包含约80%重量聚己内酯和约20%重量羟基磷灰石的混合物。在其它实施方案中，支架包含约60%重量聚己内酯和约40%重量羟基磷灰石至约95%重量聚己内酯和约5%重量轻基磷灰石的任何数量。例如,支架可包含约70%重量聚己内酯和约30%重量轻基磷灰石。作为另一个实例，支架可包含约90%重量聚己内酯和约10%重量羟基磷灰石。在一些实施方案中，支架具有高孔隙率。这种多孔结构为新的骨组织的细胞迁移、粘合和向内生长提供空间(Gazdag 1995，Rezwan2006, Mano 2004，Shin 2003，Kim 2001，Leong 2003)。支架的孔和通道可被工程化，以具有各种直径。例如，支架的孔可具有数微米到数毫米的直径范围。在一些实施方案中，基质材料的孔包括微通道。微通道通常平均直径为约 0. I u m-约 1，000 u m,例如，约 50 u m_ 约 500 u m(例如约 100 u m、150 u m、约 200 u m、约250 u m、约 300 u m、约 350 u m、约 400 u m、约 450 u m、约 500 u m 或约 550 u m)。本领域技术人员将理解微通道直径的分布可具有任何分布，包括正态分布或非正态分布。在一些实施方案中，微通道为基质材料天然存在的特征。在其它实施方案中，将微通道工程化，以存在于基质材料中。
在一些实施方案中，将所述化合物嵌入微通道中的凝胶中。任何凝胶可用于该目的。在一些实施方案中，所述凝胶为胶原蛋白凝胶。在各种实施方案中，支架进一步包含无孔牙冠(cap)。这种牙冠为支架提供进一步的强度和防止感染。所述无孔牙冠可简单地为与支架的其余部分相同的材料，除了没有孔。或者，所述无孔牙冠可为不同的材料，例如，典型的牙齿牙冠材料，比如陶瓷或金。
本文还提供了在哺乳动物的嘴中代替牙齿的方法。在这些实施方案中，牙齿缺失并且在嘴中在缺失牙齿的位置存在牙槽。所述方法包括在牙槽中植入具有丢失牙齿的形状的无细胞支架。使用多种方法来制造多孔支架，包括颗粒浸出、气体发泡、电自旋、冷冻干燥、由浆料使陶瓷发泡和形成聚合海绵(Mikos 1994,Mooney 1996, Qing 2002, Sylvain 2006)。然而，通过使用这些方法制备的支架在控制孔的结构和互联性方面具有一些缺点，这可限制它们在组织工程中在细胞渗透方面的应用(Yeong 2004，Tan 2003)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过计算机辅助设计(CAD)制备缺失的牙齿的模型，以及使用bioplotter合成所述支架。这种方法可提供具有高孔隙率和良好互联性的支架。如在实施例中所描述的，可制备具有受控的和可再现的孔隙率和良好限定的3D微观结构的三维(3D)支架。已提出快速原型制造(RP)方法，比如融合沉积模型化、选择性激光烧结、3D印刷、多阶段喷射固化和3D绘图(Hutmacher 2001，Moroni 2006)。快速原型制造的关键特征为固体自由形态制造(SFF)方法将3D计算机模型切割成层的序列，其用于逐层构造复杂的物体。通过熔体的固化、层光聚合或使用激光束诱导的烧结(选择性激光烧结)或特殊粘合剂之一使颗粒粘合来生产层(Landers 2002)。近来，已引入专门化的快速原型制造系统(Bioplotter , EnvisionTec,德国)，使得能设计和制造具有不同内部结构的具有解剖学形状的支架，从而能精确控制孔尺寸、孔隙率、渗透性和刚度(Landers 2002 ；Landers 2005)。使用 Bioplotter 用于制造组织-特异性 PCL-HA支架的原型制造方法需要目标组织或组织缺陷的3D形态信息，这些可通过计算机断层X射线照相法(CT)或磁共振成像(MRI)得到。当缺失牙齿在嘴的另一侧具有对应物时，该对应物可用作模型来为丢失的牙齿设计支架。以上得到的信息随后用于通过CAD设计功能支架，并且转移到Bioplotter 系统。在该系统中，Bioplotter 机器熔融支架材料，并在收集板上逐层分配支架材料(例如，PCL-HA)。作为设计的一部分，可产生孔，例如微通道。通过RP系统制造的3D支架导致显著的细胞渗透，并因此具有理想支架的性质(Heo 2007)。通过为患者提供组织-特异性解剖学形状以及用于营养物运输和血管形成的最佳化的内部微观结构，这些3D支架可具有临床应用的可能。这些方法的其它细节在PCT公布W02009006558中提供，该公布通过引用
彡口口 此外，提供了一种制备牙齿支架的方法。所述方法包括合成哺乳动物牙齿形状的无细胞支架并加入至少一种趋化性、成骨性、成牙质性、成釉质性或成牙骨质性化合物。在这些方法的一些实施方案中，所述牙齿的形状像在哺乳动物中缺失的牙齿，并且所述方法进一步包括通过计算机辅助设计(CAD)制备缺失牙齿的模型、以及用bioplotter合成所述支架。当缺失的牙齿在嘴中具有对应物(例如，白齿)时，所述方法进一步包括进行类似的臼齿的CT扫描，例如在嘴的另一侧，其中CAD利用第二臼齿的CT扫描数据来设计所述支架。
在这些方法的一些实施方案中，所述化合物为血小板-衍生的生长因子(I3DGF)、内皮细胞生长因子(ECGF)、转换生长因子l(TGF-0 I)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、基质细胞-衍生的因子-I (SDFl)、骨形态发生蛋白(BMP) ,TGF-^、生长和分化因子(GDF)、胰岛素样生长因子-I (IGFl)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、牙质基质蛋白、牙质涎腺蛋白、骨涎腺蛋白、牙釉蛋白或整联蛋白。在其它实施方案中，所述支架由包含骨传导材料的组合物制造。如以上所讨论的，可用的骨传导材料的实例为羟基磷灰石。其它实例为如以上所讨论的e-聚己内酯和羟基磷灰石的混合物。在这些方法的各种实施方案中，支架包含直径在50-500 u m之间的微通道。在另外的实施方案中，支架进一步包含无孔牙冠。在一些实施方案中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方案的表不成分的量、性质比如分子量、反应条件等的数字应理解为在一些情况下被术语“约”修饰。在一些实施方案中，所述术语“约”用于说明该值包括用于测定该值的装置或方法的平均值的标准偏差。在一些实施方案中，在书面说明书和所附权利要求中描述的数值参数为近似值，其可根据寻求通过具体实施方案得到的期望的性质而变。在一些实施方案中，应考虑所报道的有效数的数字并应用通常的四舍五入技术来解释所述数值参数。尽管描述本发明的一些实施方案的宽范围的数值范围和参数为近似值，但是在具体实施例中描述的数值尽可能精切地报道。在本发明的一些实施方案中呈现的数值可包含由在它们相应的测试测量中发现的标准偏差必然引起的某些误差。本文中数值范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围的每个单独值的简化方法。除非本文另外说明，否则将每个单独的值并入说明书中，就好像本文中单独引用了一样。在一些实施方案中，除非另外说明，否则在描述具体实施方案的上下文中(特别是在某些权利要求的上下文中)使用的术语“一”和“该”及类似引用可解释为覆盖单数和复数两者。在一些实施方案中，本文(包括权利要求)使用的术语“或”用于指“和/或”，除非明确说明是仅指替代物或者替代物相互排他。术语“包含”、“具有”和“包括”为开放式连接动词。一个或多个这些动词的任何形式或时态，比如“包含”、“包含”、“具有”、“具有”、“包括”和“包括”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不局限于仅具有那些一个或多个步骤，并且还可覆盖其它未列举的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个特征的任何组合物或装置不局限于仅具有那些一个或多个特征，并且可覆盖其它未列举的特征。本文描述的所有的方法可采用任何合适的顺序进行，除非本文中另外说明或者上下文明确地否定。关于本文中某些实施方案提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如“比如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对另外要求保护的本发明的范围产生限制。在说明书中没有语言应解释为说明本发明的实施必要的任何未要求保护的要素。本文公开的本发明的供选要素或实施方案的分组不应解释为限制。每个组成员可单独涉及和要求保护或者与该组的其它成员或本文发现的其它要素进行任何组合。出于方便或可专利性的原因，组中的一个或多个成员可包括在一个组中或从一个组中删除。当出现任何这种包括或删除时，说明书在本文中可视为包含修改的组，从而实现在所附权利要求中使用的所有马库什组合的书面描述。
在本申请中引用的所有的出版物、专利、专利申请和其它参考文献出于所有目的通过全文引用结合到本文中，和好像每个单独的出版物、专利、专利申请或其它参考文献具体和单独地说明出于所有目的通过全文引用结合的程度相同。本文中参考文献的引用不应解释为承认该参考文献为本发明的现有技术。已经详细地描述了本发明，显而易见的是，在不偏离所附权利要求限定的本发明范围的情况下，修改、变化和等价实施方案是可能的。此外，应理解，本公开中的所有实施例作为非限制性实施例提供。
实施例提供以下非限制性实施例来进一步说明本发明。本领域技术人员应理解，在以下实施例中公开的技术代表本发明发明人发现在本发明的实施中良好运作的方法，因此可认为构成其实施方式的实施例。然而，鉴于本公开，本领域技术人员应理解，在不偏离本发明 精神和范围的情况下，在所公开的具体实施方案中可进行许多改变且仍得到相似或类似的结果。实施例I :通过细胞归位的解剖学校正牙齿的再生牙科学的基本使命之一为恢复患病的、丢失的和失去的牙齿结构。目前，对掉牙的常规处理包括使用或不使用外科手术放置的牙齿移植物的假牙修复术治疗。尽管已报道牙齿移植物的高成功率，但并不是没有并发症，比如疏松、感染和骨丢失。近来，在医师和科学家中存在可使用生物医学工程提示(cue)使单独的牙齿结构或整个牙齿再生的共同愿望。然而，该新兴领域遇到了几种障碍，其中最大的是再生和牙齿结构形态的复杂性。本研究提出使用生物工程化的牙齿支架和通过递送已知对牙齿发育重要的生长因子来建立整个牙齿器官的再生。使用Bioplotter 机器，通过e-聚己内酯和羟基磷灰石(PCL-HA)的结合体的层沉积的快速原型制造，首先制造全尺寸人牙齿支架。并行地，还以3D构建SpragueDawley大鼠的下颌中央门牙根形状的支架。该支架随后用基质细胞衍生的因子_1 (SDFl)和骨形态发生蛋白7 (BMP-7)灌注。有22只Spraque Dawley大鼠，测试组和对照组中各11只。在每只大鼠中，在背部部位皮下移植人下颌白齿形支架，并且在外科手术拔出两个下颌中央门牙之一后在拔出槽内移植大鼠下颌门牙根形支架。测试组支架用SDFl和BMP-7浸溃，而对照组支架不含生长因子。在移植后9周时采集所有的移植的支架，并组织学评价组织向内生长、细胞渗透、血管生成和矿化。材料和方法。在开始该研究之前,得到哥伦比亚大学学会动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。该研究使用12周龄雄性SpragueDawley大鼠的下颌中央门牙拔出槽和皮下背部部位(Charles River，NY)。所有的部位接受PCL-HA支架。共有22只SD大鼠，将它们随机分成两组测试组和对照组，两组中的每一组中有11只大鼠。如图I所示，分别为每只大鼠给予识别号_#1至#11和#12至#22-测试组和对照组。在购买后，在一周适应期期间，将大鼠成对保持在12小时亮/暗周期中，并且在支架移植的外科手术程序之前，随意喂食大鼠食物(Rodent Laboratory Chow 5001, Ormond Veterinary Supply, Ontario,力口拿大)和水。表I概括了研究组和移植的支架数量。表I.研究组和移植的支架数量


本发明提供一种无细胞哺乳动物牙齿形支架，其包含趋化性、成骨性、成牙质性、成釉质性或成牙骨质性化合物。还提供一种在哺乳动物的嘴中代替牙齿的方法，其中牙齿缺失并且在嘴中在缺失牙齿的位置存在牙槽。所述方法包括在牙槽中植入具有丢失牙齿的形状的无细胞支架。此外，提供了一种制备牙齿支架的方法。所述方法包括合成哺乳动物牙齿形状的无细胞支架并加入至少一种趋化性、成骨性、成牙质性、成釉质性或成牙骨质性化合物。