专利名称：含生长因子的纳米纤维复合多孔骨修复材料及其制备方法由创伤、感染、肿瘤及发育异常等原因造成的骨损伤与骨缺损等硬组织疾病是世 界性多发病和常见病。临床上用于骨修复的治疗方法有自体骨移植、同种异体骨移植、移植 人工骨替代物等方法。自体骨移植存在供区损伤、植骨量不足、不能制备成特殊形状等的限 制，同种异体骨移植易致排斥反应，因此人工骨修复材料已成为国际上用于临床骨缺损修 复的主要材料。目前研究成熟的和已临床应用的人工骨修复材料的种类繁多，按其基质材料的性 质可分为有机高分子材料、无机材料和复合材料。其中的无机材料，包括合成的磷酸三钙 (a-TCP及β-TCP)、磷酸四钙(TeCp)和它们的混合物等磷酸钙陶瓷，羟基磷灰石(Hap)， 生物活性玻璃；天然的珊瑚基和贝壳基材料，及天然骨改性材料等。无机材料的成分与骨矿 物组成类似，生物相容性和力学性能较好，对人体安全、无毒，因此已广泛用于骨缺损修复 (孙文晓、张海港、韦卓等，骨修复材料的研究应用现状与展望，生物骨科材料与临床研究， 2009,6(3) 35-40 ；中国发明专利ZL03113339. 8 ；中国发明专利申请号200710031438. 6)。然而，传统的自体骨移植仍是目前最理想的骨移植材料，是骨移植的“金标准”。其 原因主要在于上述人工材料不能提供模拟体内生理环境的骨组织再生条件，缺乏骨细胞生 长因子及细胞外基质诱导环境，因此人工骨修复材料的骨缺损修复效果与自体骨移植相比 仍然有显著差距。细胞在动物体内生存的微环境(细胞外基质)大多是由直径为50 150nm的蛋 白多糖和胶原纤维构成的三维纳米支架，具有与天然细胞外基质相似的组成及结构的壳 聚糖纳米纤维已被证实对细胞的黏附、生长和功能表达等具有重要的促进作用[Miattaai N, Edmondson D, Veiseh 0, et al. Electrospun chitosan—based nanofibers and their cellular compatibility, Biomaterials，26，6176 6184 (2005)]。同时，骨形态发生蛋 白-2(BMP-2)、成纤维细胞生长因子_2(bFGF)、转化生长因子- β (TGF-β)、胰岛素样生长 因子-I(IGF-I)、血小板衍化生长因子(PDGF)等骨生长因子对骨组织的修复和再生具有重 要的调节、促进作用。但是由于骨生长因子在水相及室温环境下易失去生物活性，在体内还 存在酶解作用，因此其在体内直接使用会很快失活，达不到所期望的生物效应。构建在体环 境下能保持并尽可能延长生长因子生物活性的生长因子释放系统已成为骨生长因子在临 床上成功应用的关键。目前以纳米微粒、脂质体、生物陶瓷和聚合物为载体的骨生长因子缓释体系的应 用报道已有很多(中国发明专利ZL01117292. 4 ；中国发明专利ZL200510021909. 6 ；中国发 明专利申请03109785. 5)。但现有的骨生长因子缓释体系还不能全面地模拟骨组织再生所 需求的生理微环境。
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种含生长因子的纳米 纤维复合多孔骨修复材料的制备方法。本发明的另一目的在于提供由上述方法制备得到的含生长因子的纳米纤维复合 多孔骨修复材料，该材料在多孔骨修复材料内原位形成含有骨生长因子的壳聚糖纳米纤 维，从而具有了良好的生物相容性和力学性能，模拟了骨细胞外基质的纳米纤维结构，可以 保持骨生长因子的生物活性并持续缓慢释放，有利于骨组织的再生和功能重建。本发明的再一目的在于提供上述含生长因子的纳米纤维复合多孔骨修复材料的 应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种含生长因子的纳米纤维复合多孔骨修复材料的制备方法，包括以下步骤(1)取壳聚糖溶于乙酸中，配成壳聚糖乙酸溶液，在搅拌的同时加入骨生长因子， 混合均勻；(2)将多孔骨修复无机材料负压下浸入步骤⑴制成的溶液中，浸泡1 2小时， 取出；(3)将步骤⑵处理的多孔骨修复材料低温冷冻，再冷冻干燥；(4)将步骤( 处理的多孔骨修复材料浸入稳定剂溶液稳定化，再用水洗涤，冷冻 干燥，然后灭菌，即制成一种含生长因子的纳米纤维复合多孔骨修复材料；所述多孔骨修复无机材料为钙磷生物陶瓷多孔骨修复材料、贝壳基多孔骨修复材 料、珊瑚基多孔骨修复材料、生物活性玻璃多孔骨修复材料或生物型多孔骨修复材料；所述骨生长因子是骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、成纤维细胞生长因子_2(bFGF)、 转化生长因子-β (TGF-β)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、血小板衍化生长因子(PDGF)及 它们相应活性肽中的一种以上混合物；所述壳聚糖，脱乙酰度为75 100%、分子量为20000 200000 ；步骤(1)中所述乙酸是体积浓度为0. 025 0. 05%的乙酸水溶液；所述壳聚糖乙 酸溶液中壳聚糖的浓度是0. 025 0. 05(g/mL)；所述加入的骨生长因子与壳聚糖的质量比 为 0. 001 0. 1 1 ；步骤(3)中，所述低温冷冻，温度为-60 _200°C，优选_80°C，冷冻时间0. 5h ；所 述冷冻干燥的冷凝温度为-50 _80°C，真空度为20 以下，时间为他 48h ；步骤中，所述稳定剂溶液为含有氢氧化钠或多聚磷酸钠的乙醇水溶液，氢氧 化钠或多聚磷酸钠的浓度为0. 05 0. lmol/L ；所述乙醇水溶液中，乙醇与水的体积比为 80 20 99 1 ；步骤中，所述冷冻干燥的冷凝温度为-50 _80°C，真空度为20 以下，时间 为他 4 ；步骤中，所述灭菌为环氧乙烷灭菌或辐照灭菌。由上述方法制备得到的一种含生长因子的纳米纤维复合多孔骨修复材料，含有质 量百分比98. 9 99. 99%的多孔骨修复无机材料，骨生长因子在其中的含量是IX 10_6 1X 10_3 (g/g)，壳聚糖在其中的含量是1X 10_4 1 X 10_2 (g/g)。上述一种含有骨生长因子的纳米纤维复合多孔骨修复材料可以用于骨组织缺损 修复。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本发明制备方法绿色环保、简单易行，不会破坏骨生长因子的生物活性。(2)多孔无机材料提供了骨修复材料必要的力学性能，而原位形成的壳聚糖纳米 纤维可均勻负载生长因子，实现骨生长因子的持续缓慢释放，并模拟了骨细胞外基质的纳 米纤维结构，从而更好地发挥骨诱导作用，促进骨组织再生和功能重建，满足临床上骨缺损 修复的要求。图1是含BMP-2的壳聚糖纳米纤维复合生物型多孔骨修复材料的SEM照片。图2是含BMP-2的壳聚糖纳米纤维复合生物型多孔骨修复材料的BMP-2释放曲线。图3是茜素红染色检测BMP-2/壳聚糖纳米纤维复合生物型多孔骨修复材料诱导 后C2C12细胞矿化小节含量；其中，A图是生物型骨修复材料空白对照组，B图是BMP-2/CS 纳米纤维复合生物型多孔骨修复材料诱导组。图4是小鼠肌袋植入试验检测BMP-2/壳聚糖纳米纤维复合生物型多孔骨修复材 料诱导异位骨形成的钙含量测定结果。图5是含bFGF的壳聚糖纳米纤维复合TCP多孔骨修复材料的bFGF释放曲线。图6是含BMP-2和bFGF的壳聚糖纳米纤维复合生物型多孔骨修复材料的BMP-2 和bFGF释放曲线。图7是茜素红染色检测含BMP-2和bFGF的壳聚糖纳米纤维复合生物型多孔骨修 复材料诱导后C2C12细胞矿化小节含量；其中，A图是生物型骨修复材料空白对照组，B图 是生物型多孔骨修复材料+CS+BMP-2/bFGF诱导组。图8是小鼠肌袋植入试验检测BMP-2/bFGF/壳聚糖纳米纤维复合生物型多孔骨修 复材料诱导异位骨形成的钙含量测定结果。
结果如图6所示，体外药物释放曲线显示，此壳聚糖纳米纤维复合生物型多孔骨 修复材料中复合的bFGF至少能在10天的时间内实现持续释放，前4天的释放量达到总药 量的56 %，然后持续至12天时，释药量达到95 %，在第16天时药物释放完全。而BMP-2至 少能在20天内实现持续释放，前6天的释放量达到总药量的52%，然后持续至15天时，释 药量达到92%，在第20天时药物释放完全。对照组为bFGF+BMP-2溶液直接复合材料组， bFGF和BMP-2分别在他和IOh时药物即完全释放。说明此壳聚糖纳米纤维复合生物型多 孔骨修复材料实现了所负载的生长因子bFGF和BMP-2的持续缓慢释放。体外细胞试验分别检测生物型多孔骨修复材料(作为空白对照组)、生物型多孔 骨修复材料+CS+BMP-2/bFGF(实施例3制备得到的)诱导小鼠成纤维细胞C2C12细胞矿化 小节含量评价其诱导骨分化能力。将状态良好的C2C12细胞用0. 25 %胰酶-0. 2 % EDTA进行消化分散，计数后， 1 X IO4个/cm2接种于24孔板中，每孔加入500 μ 1含10% FBS的DMEM, 37°C>5% CO2、饱和 湿度的(X)2培养箱培养。各孔细胞分为2组，分别为生物型多孔骨修复材料空白组、生物型 多孔骨修复材料+CS+BMP-2/bFGF组，均与IOmMβ -甘油磷酸钠共同诱导培养。诱导4周后， 细胞用PBS洗2次，70%乙醇于-20°C固定60min，晾干。10mg/ml茜素红染色，作用15min， 检测骨钙蛋白(OC)(成骨分化最终标志)表达情况，OC阳性细胞呈桔红色染色。双蒸水洗 3 4次后PBS孵育20min，风干，镜下观察。结果如图7所示，生物型多孔骨修复材料空白组几乎没有细胞呈阳性，而含BMP-2 和bFGF的壳聚糖纳米纤维复合生物型多孔骨修复材料诱导后C2C12细胞OC绝大多数都被 染成桔红色，由此说明BMP-2和bFGF形成壳聚糖纳米纤维后由于缓释作用，导致BMP-2的 持续释放，而bFGF又促进了 BMP-2的成骨诱导作用，从而在较长时间内诱导C2C12细胞向 成骨晚期分化的能力明显增强。小鼠后肢肌袋异位骨形成试验检测此含BMP-2和bFGF的壳聚糖纳米纤维复合生 物型多孔骨修复材料诱导异位骨形成的能力。选取18 22g清洁级昆明小鼠(中山大学动物试验中心提供)，麻醉后，分为2 组，分别将生物型多孔骨修复材料(作为空白对照组)、生物型多孔骨修复材料+CS+BMP-2/ bFGF (实施例3制备得到的)植入到小鼠的后腿肌肉内，进行埋植实验，诱导2周后，处死小 鼠，取出埋植物，0. 6M HCl浸泡，抽取上清进行钙含量测定。结果如图8所示，含BMP-2和bFGF的壳聚糖纳米纤维复合生物型多孔骨修复材料 组能明显促进植入部位异位骨的形成，钙含量测定较空白对照组明显增高，骨诱导活性显 著增强。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。


本发明公开了一种含生长因子的纳米纤维复合多孔骨修复材料及其制备方法，其制备方法包括以下步骤取壳聚糖溶于乙酸中，加入骨生长因子，混合均匀；将多孔骨修复无机材料负压下浸入上述溶液中，浸泡1～2小时，取出；将多孔骨修复材料低温冷冻，再冷冻干燥；然后浸入稳定剂溶液稳定化，再用水洗涤，冷冻干燥，然后灭菌，即制成一种含生长因子的纳米纤维复合多孔骨修复材料。本发明的含生长因子的纳米纤维复合多孔骨修复材料模拟了骨细胞外基质的纳米纤维结构，可以保持骨生长因子的生物活性并持续缓慢释放，有利于骨组织的再生和功能重建，克服了现有的骨生长因子缓释体系不能较好地模拟骨组织再生所需求的生理微环境的缺陷。