一种用于多重多靶点核酸全过程密闭加样的装置系统的制作方法【技术领域】，具体涉及一种用于核酸分子全过程密闭的实验加样装置，可适合各类核酸分子检测反应，特别适用于检测环境要求苛刻的现场或野外检测的配套需要。[0002]近年来，随着社会发展和生物医学技术的进步，每年进行的多种样品核酸检测数量都在大幅增加，对现场快速检测处理速度的各项要求越来越高，现场操作要求灵敏度高。简便快捷的需求也日益迫切。以环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermalamplification, LAMP)检测为例。LAMP最早由日本科学家Lotomi发明，通过针对靶基因的6个区域而设计4种特异性引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在恒温条件下(60-65°C)高效(0.5-lh)扩增目标DNA。与目前广泛流行的PCR核酸扩增技术相比，该技术具有不依赖温度循环仪(PCR)等昂贵仪器，且灵敏度高，特异性好，反应速度快等优点[0003]近年来受到学术界和产业界的高度重视，相继开发出多种类型的等温核酸扩增。并已作为一种新兴技术用于临床疾病诊断、流行性细菌或病毒的现场快速检测、动物胚胎性别鉴定及基因芯片开发等领域。在病毒检测领域，目前已依托LAMP技术开发出用于快速诊断检测包括乙肝肝炎病毒、流感病毒、SARS冠状病毒、单纯疱疹病毒在内的多种流行病毒的方法(Hong et al., 2004;Enomoto et al., 2005;Kaneko et al.，2005;)。在细菌检测领域，该技术也广泛应用于结核分支杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、痢疾志贺菌的快速检测(Iwamoto et al.，2003)。基于Y染色体上特异序列的差异，Hirayama等(2004)利用LAMP技术开展了对牛早期胚胎性别的快速检测，将LAMP技术应用到了一个全新的领域。在水产养殖病害检测领域，目前已经被成功用于桃拉病毒(Tarura syndrome virus, TSV)>对虫下白斑病毒(White spot syndrome virus, WSSV)、传染性肌肉坏死病毒(Infectiousmyonercrosis virus, IMNV)等病毒病原的检测(Kiatpathomchai et al., 2008; Jaroenramet al., 2009;Puthawibool et al.，2009)。随着该技术的日益发展,两个阻碍其在基层的应用推广的瓶颈问题也逐渐凸显出来；首先是LAMP的灵敏性带来的气溶胶污染问题，由于LAMP方法对于靶序列的扩展灵敏且扩增量大，为应对这一问题，对于LAMP技术目前在实际应用过程中一般要求“要严格分区，规范操作”，即，根据LAMP操作流程将实验区分为“样品处理区，溶液配制区，模板添加区，检测区”，而且在操作过程中要严格按照模板最后加入，先阴性、后阳性，从低到高的浓度进行操作。对于这样严格苛刻的要求，在实际基层使用过程中很难做到，进而使得该技术在基层现场检测中难于推广。[0004]有此可以看出，在检测环境要求苛刻的现场或野外进行核酸分子快速检测时，如何合理的避免检测过程中的气溶胶污染，同时又能解决核酸分子样品检测中的高通量，多靶点的问题，成为能否使得核酸分子快检检测更好的服务于基层检测单位的一个绕不开，也躲不过的问题。实用新型内容[0005]本实用新型所要解决的技术问题是提供一种结构简单合理、密封性好的用于核酸分子全过程密闭加样的装置系统，有效解决了加样过程造成的气溶胶污染问题，并通过可拆卸分样器实现了多样本，多靶点加样，整个装置操作灵活、方便快捷。[0006]本实用新型解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种用于多重多靶点核酸全过程密闭加样的装置系统，其特征在于:所述装置系统包括与离心机相连接实现均匀混料的混合均匀器、分样器和取样器，混合均匀器、分样器和取样器从内至外依次组装形成一带放射线的圆盘状结构，混合均匀器为圆盘形，其上端设有至少一个加样口，其内设有多个混合分割槽，其外周分布有多个分配口，分配口上设有贯通的细孔，分配口通过接头与分样器前端的分样口相连通，分样器的后端与取样器相连接，在分样器内设有毛细管道，毛细管道的一端与分样口相连通，另一端与取样器的反应池相连通。[0007]作为改进，所述混合均匀器是由圆盘形的上盖和圆盘形的底座对合而成，加样口设置在上盖上，底座内设有若干层同心的分割圆环，分割圆环之间形成混合分割槽，在分割圆环上设有缺口供料液从内槽流向外槽的缺口，分配口呈放射状均匀设置在底座的最外层的分割圆环上。
[0008]作为改进，所述分割圆环为三层，所述加样口为多个，加样口的内径尺寸与移液枪枪头相匹配，每个加样口上分别设有密封帽，其中一个为中心加样口，该中心加样口设置在上盖的中心位置，其内孔位于内层分割圆环内的上方，其余加样口分别均匀排列在中心加样孔的周围，其内孔位于第二层分割圆环内的上方。
[0009]作为改进，所述分割圆环上的缺口为3?4个弧形缺口，弧形缺口呈同方向弯曲地均匀间隔设置在分割圆环上。
[0010]再改进，所述分配口内侧的最外层的分割圆环内壁上设有抛物线形状的收纳槽，细孔设置收纳槽的底部，细孔通过分配口与分样器的分样口相连通。
[0011 ] 再改进，所述分样器为一管套结构，分样器的前端凹设设有与接头相连接分样口，接头的一端套设在分配口上，另一端插置在分样器的分样口中固定。
[0012]再改进，所述分样器的前部设有与移液器枪头密封匹配的分样孔，分样孔内设有可锁住移液器枪头的自锁卡位。
[0013]进一步改进，所述分样器的后端设有与取样器相连接的连接部，取样器为前端密封设有毛细管道接口的容器，毛细管道接口的里端与反应池相连通，取样器的前端插接在分样器的连接部内，通过毛细管道接口与分样器内的毛细管道相连通。
[0014]进一步改进，所述上盖上设有内螺纹，底座上设有对应的外螺纹，上盖与底座通过螺纹连接固定，并在上盖与底座之间衬有密封圈。
[0015]与现有技术相比，本实用新型的优点在于:利用流体力学原理、材料科学和机械原理结合生物技术，有效解决加样过程造成的气溶胶污染和高通量多靶点等问题，操作方便快捷不需要借助其他昂贵仪器，有利于LAMP技术的研发和推广应用。另外所有配套设备全部采用现有常规用实验设备和耗材，应用方便，适合各类试剂检测反应，特别适合现场以及野外检测的配套需要。本实用新型结构简单合理、密封性好、成本低，且操作灵活、简单方便，从加样到热合剪断分离完成不超过5min，非专业人员通过简单示范就可以操作，整个设计采用标准化，可以实现工业化生产。


[0016]图1是本实用新型的实验加样装置的结构示意图；
[0017]图2是图1中混合均匀器的结构示意图，其中a是上盖的结构示意图，b是底座的结构示意图；
[0018]图3是图1中分样取样器的结构示意图
[0019]以下结合附图实施例对本实用新型作进一步详细描述。
[0020]如图1?3所示，本实施例的用于核酸分子全过程密闭加样的装置系统，包括与离心机相连接实现均匀混料的混合均匀器1、分样器2和取样器3，混合均匀器1、分样器2和取样器3从内至外依次组装形成一带放射线的圆盘状结构，混合均匀器I为圆盘形，是由圆盘形的上盖11和圆盘形的底座12对合而成，其中上盖11上设有内螺纹，底座12上设有对应的外螺纹，上盖11与底座12通过螺纹连接固定，并在上盖11与底座12之间衬有密封圈；上盖11设有三个加样口 111，可以分别加入核酸、酶、缓冲液，其中一个为中心加样口，该中心加样口设置在上盖11的中心位置，另外二个在中心加样孔的两侧，底座12内设有三层同心的分割圆环123、124和125，底座12上通过分割圆环123、124和125形成三个混合分割槽122，其中上盖11的中心加样口的内孔位于内层分割圆环123内的上方，其余加样口 111的内孔位于中间分割圆环124内的上方；底座12的外侧周面上分布有12个分配口 121，分配口 121呈放射状均匀间隔地设置在底座12的最外层的分割圆环125上，分配口 121上设有贯通的细孔127，分配口 121内侧的最外层的分割圆环125内壁上设有抛物线形状的收纳槽128，细孔127设置在收纳槽128的底部，细孔127通过分配口 121与分样器2的分样口相连通，在内侧和中间的分割圆环123和124上开有3?4个弧形的缺口 126，弧形缺口 126呈同方向弯曲地均匀间隔设置在分割圆环123和124上，使得料液混合后从内槽流向外槽，在初次加样过程中，核酸和酶由于加样的量小，加样后将慢慢混合在缓冲液中，随着离心机的离心力作用下，核酸和酶及缓冲液混合均匀后，通过分割圆环123和124中的缺口 126到了最外层，再通过细孔127从分配口 121流入分样器2中；分样器2为一管套结构，分样器2的前端凹设有与接头4相连接分样口，接头4的一端套设在分配口 121上，另一端插置在分样器2的分样口中固定，分样器2的前部设有与移液器枪头密封匹配的分样孔，分样孔内设有可锁住移液器枪头的自锁卡位，以实现多重实验中不同核酸的分别加入到反应池的要求；在分样器2中间部分有毛细管道21，毛细管道21采用金属或非金属材料，毛细管道21的一端与分样口相连通，另一端与取样器3的反应池31相连通；分样器2的后端设有与取样器3相连接的连接部，取样器3是可拆卸地卡置在连接部内，取样器3为前端密封设有毛细管道接口 32的容器，毛细管道接口 32的里端与反应池31相连通，取样器3的前端插接在分样器2的连接部内，并通过毛细管道接口 32与分样器2内的毛细管道21相连通。
[0021]加样时，将核酸、酶、缓冲液等通过密闭系统加入到中间的混合均匀器I上加样口111内，在通过混合均匀器I中的混合分割槽122混合均匀后，在离心机的离心作用下有序分别通过分配口 121，连接分样器2的分样口和毛细管道21流入各个的反应池31中，整个加样过程中完全在密闭状态下进行，酶和DNA密闭状态下混合，因此没有反应发生不会产生气溶胶污染，完成完全在密闭状态下加样混样分配的全过程，不会产生交叉污染。同时，通过自主可拆卸分样器实现了多样本，多靶点的密闭加样。
[0022]下面利用LAMP扩增加样试验对本实用新型的实验加样装置的密闭有效性进行进
一步验证:
[0023]实验采用Φ0.3mm内径的毛细管道，采用PTFE材质毛细管道，PTFE毛细管具有它的摩擦系数极小，又由于氟-碳链分子间作用力极低，聚四氟乙烯在_190°C?280°C的较广温度范围内均保持优良的力学性能，全氟碳高分子的特点之一是在低温不变脆。并具有耐化学腐蚀和耐候性，聚四氟乙烯几乎不受任何化学试剂腐蚀。聚四氟乙烯不吸潮，不燃，对氧、紫外线均极稳定，所以具有优异的耐候性。但不仅限制仅用PTFE材质，也可选用例如硅胶类，PE类等材料。
[0024]另外，密封垫和密封圈全部采用硅胶材料，锁紧螺帽用PE材料，加样装置采用医用级PVC制作，单向阀采用隔膜式单向阀，加样混合池为球冠凹面，最后伽玛射线灭菌。
[0025]应用实施例1
[0026]纯净环境下加样实验
[0027]在纯净环境的实验室中将DNA、dNTP、探针、酶和缓冲液共计2.5ml通过用本实用新型的实验加样装置混合加样至试管中共计100管，在做LAMP实验，未发现有污染而影响实验结果现象。
[0028]应用实施例2
[0029]气溶胶污染严重环境下加样实验
[0030]在大学实验室进行，由于实验室各式DNA提取工作很多，本身气溶胶污染严重，采用本实用新型的实验加样装置，将探针预先放入试管中，阖上带有毛细管道的盖子，用锁紧螺帽连接到加样器上，微囊藻毒素DNA用其中一个加样孔加注样品，移走移液器后枪头留在加样孔上并用密封盖封闭，另一个加样孔加注大连宝生物生产的酶10 μ 1，同样密闭盖上；预先混合好的含有dNTP的反应缓冲液通过中心加样孔加注后用密封盖封闭。通过用本实用新型的实验加样装置混合加样至试管中共做十组LAMP实验未发现有污染而影响实验结果现象。
[0031]应用实施例3
[0032]加样实验后气溶胶污染状况在检验检疫科学技术研究院实验室进行，采用本实用新型的实验加样装置，将探针预先放入试管中，阖上带有毛细管道的盖子，用锁紧螺帽连接到加样器上，将十组(霍乱弧菌、单核李斯特菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、出血性大肠杆菌(0157:H7)、创伤弧菌、耶尔森氏菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、沙门氏菌)DNA用其中一个加样孔加注样品，移走移液器后枪头留在加样孔上并用密封盖封闭，另一个加样孔加注大连宝生物生产的酶，同样密闭盖上；含有dNTP缓冲液通过中心加样孔加注后用密封盖封闭。通过用本实用新型的实验加样装置混合加样至试管中并进行LAMP实验后，和标准对照未发现有污染而影响实验结果现象，效果非常理想。