技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及重组蛋白的化学修饰技木发明背景精氨酸酶(Arginase)是尿素循环中的ー种酶，催化精氨酸水解产生鸟氨酸和尿素，在机体氮代谢方面起重要作用人体内精氨酸酶有两种(I型称肝精氨酸酶，II型称肝外精氨酸酶)，I型精氨酸酶基因的表达受底物精氨酸和辅酶Mn2+的诱导(Brock，A.Aetal，Dietarymanganesedeiiciencydecreasesrathepaticarginaseactivity.J.Nutr.1994,124340-344)，存在于肝外的II型精氨酸酶有着广泛的组织分布，在不同组织和器官中发挥不同的作用，包括參与多胺代谢、NO合成等(Russel，D.H，etal,Polyammebiogenesisintheratmammaryglandduringpregnancyandlactation.Bilchem.1972,13071-76)，与I型精氨酸酶相比，其活力较低精氨酸酶通过分解精氨酸对肿瘤细胞进行营养剥夺，对正常组织影响较小，成为抗肿瘤治疗的又一选择目前传统的放化疗方法已很难满足患者对生命质量的要求，而氨基酸剥夺的方法给癌症治疗注入新的活力它虽然会引起生理和代谢方面的某些不平衡，但不像传统的放化疗等方式向体内引入有毒物质，使原本就不堪ー击的病体雪上加霜最早发现精氨酸酶有抑制肿瘤作用的是Bach和Lansitksi,他们用提纯的牛肝精氨酸酶处理大鼠Walker256肉瘤四天，发现肿瘤生长减慢了31%-71%(Bachbj,LasnitzkiI.borneaspectsoftheroleofarginineandarginaseinmousecarcinoma.Enzymologia.1947,12198-205)精氛酸酶体外抗肿瘤活性自1960年已有报道(BachSJ,HawkinsRA,SwaineD.Asnortmethodforthepurificationofarginasefromoxliver.BiochemJ1963;89263-5),Curtie等报道精氨酸酶自脂多糖与酵母多糖刺激后的巨噬细胞释放，可引起中国大鼠肺细胞V79、淋巴瘤细胞L5178Y、HSN大鼠肉瘤细胞的凋亡Storr和Burto报道用鼠和牛肝脏来源的精氨酸酶处理，当精氨酸水平降至低于8umol/L并持续24小时的情况下淋巴肉瘤细胞的生长受到抑制Scott和Wheatley等对精氨酸耗竭的体外抗肿瘤活性进行了较为系统的研究(Scott等，Singleaminoaacid(,arginine)deprivationrapidandselectivedeathofculturedtransformedandmalignantcells.Br.J.Cancer83,800-810),在测试的24种肿瘤细胞中，所有细胞株在精氨酸酶作用后5天内死亡，受试细胞株包括乳腺癌、直肠结肠癌、肺癌、前列腺癌和卵巢癌等细胞人肝癌(Humanhepatocellularcarcinoma,HCC)细胞与人黑色素瘤细胞属于精氨酸营养缺陷型细胞，其精氨基琥拍酸合成酶(argininosuccinatesynthetase,ASS)表达缺陷，可能与ASS基因的启动子被甲基化因而被抑制、在转录水平上下调有关(DillonBJeta_L.incidenceanddistributionofargininosuccinatesynthetasedeiiciencyinhumancancersamethodforidentifyingcancerssensitivetoargininedeprivation.Cancer2004；100826-33)精氨酸转亚氨酶(argininedeiminase，ADI)在治疗ASS缺陷型肿瘤方面有明确疗效，但许多非ASS缺陷型HCC细胞对ADI有抵抗(ShenLJetal.Resistancetotheanti-proliferativeactivityofrecombinantargininedeiminaseincellculturecorrelateswiththeendogenousenzyme,argininosuccinatesynthetase.CancerLett2003;191165-70)国外文献报道重组人精氨酸酶I(recombinanthumanarginaseI,rhArgI)对非ASS缺陷型HCC细胞具有明确的抑制作用，所有五株HCC细胞均对rhArgI敏感，但ADI对这些细胞无抑制作用，这些细胞均表达ASS,但不表达鸟氨酸转氨甲酰酶(ornithinetranscarbamylase,OTC),rhArgI降解精氨酸产生鸟氨酸，OTC将鸟氨酸转化为瓜氨酸，瓜氨酸再经ASS与精氨基琥拍酸裂解酶(argininosuccinatelyase,ASL)转化成精氨酸,将OTC转染HCC细胞可使该细胞对rhArg产生抵抗(PaulNing-ManChenget,PegylatedRecombinantHumanArginase(rhArg-peg5,OOOmw)InnibitstheInvitroandInvivoProliferationofHumanHepatocellularCareinomathroughArginineDepletion.CancerRes2007；67(1)309-317)(尿素循环与相关酶作用节点示意图见说明书附图I)在一些细胞中尿素循环是不完全的(机制不清)，代谢产物鸟氨酸不能再进入循环而产生精氨酸(PaulNing-ManChengetal,PegylatedRecombinantHumanArginase、rhArg-peg5,OOOmwノInhibitstheInvitroandInvivoProliferationofHumanHepatocellularCarcinomathroughArginineDepletion.CancerRes2007；67(I)309-317)，因而与精氨酸转亚胺酶相比，精氨酸酶是降解血循环中精氨酸的更为有力的酶；从临床治疗效果看，将Arg开发成抗肿瘤药物的价值较ADI更大重组人精氨酸酶I已成功在大肠杆菌中获得表达(MasakiIΚΕΜ0Τ0etal,ExpressionofhumanliverarginaseinEschericniacoli.Biochem,J.1990,(270)697-703)，但其短的体内循环半衰期(短于30分钟)使得在不能进行频繁大剂量给药的情况下将其用于肿瘤患者以降低血中精氨酸水平很困难另ー种牛肝来源的精氨酸酶作为治疗人类肿瘤的候选药物一直不被看好，原因是在生理条件下其与底物精氨酸的亲和カ较低，最适PH9.6，半衰期只有几分钟自二十世纪八十年代以来，这些都被认为是牛肝精氨酸酶的严重缺陷Savoca的研究表明牛精氨酸酶对移植Taper肝癌的小鼠无抗肿瘤活性(SavocaKVetal,Cancertherapywithchemicallymoditiedenzymes.II.Thetherapeuticettectivenessofarginase,andarginasemodifiedbytnecovalentattachmentofpolyethyleneglycol,onthetaperlivertumorandtheL5178Ymurineleukemia.CancerBiochemBiophysl984,7261-268),其他一些研究者也认为牛精氨酸酶无抗肿瘤活性虽然精氨酸酶的体外抑瘤作用明确，但将其用于体内试图通过精氨酸耗竭治疗癌症的多项研究并没有取得预期的效果(Storr等Br.J.Cancer,1974，V3050-59)，这是因为机体应对氨基酸缺乏时存在体内氨基酸稳态机制(aminoacidhomeostaticmechanism),氨基酸匮乏时通过激活蛋白质分解途径将精氨酸释放到血液中參与循环，补充了精氨酸酶代谢造成的精氨酸耗竭为克服机体的这种稳态机制，实现有治疗意义的精氨酸耗竭就需精氨酸降解酶的持续作用，因而要对其进行修饰改性，以达到长效作用Tepic在美国专利UP6，261，557中描述将精氨酸降解酶与蛋白质分解抑制剂胰岛素组合使用，以阻断通过降解机体肌肉来补充精氨酸这一途径，但胰岛素的应用受到患者血糖水平的限制，如果患者血糖水平不能保持在有限的正常范围内将导致危险1979年Savaca等使用2，4，6_三氯-S-三嗪(氰尿酰氯)作为偶联剂，将牛肝脏来源的精氨酸酶与5KD的单甲氧基聚こニ醇共价连接(Savoca,K.V.等，1979,BiochimiedetBiophysicaActa578，47_53)，将精氨酸酶在小鼠的体内半衰期由不到ー小时延长至12小时，虽然聚こニ醇修饰可以在一定程度上降低蛋白的免疫原性，牛精氨酸酶对人而言毕竟是异源蛋白；而且修饰后的分子只保留了原始酶活的65%，酶活损失较大香港康达医药有限公司的PCT专利(PCT/CN2002/0006352002.9.9)，采用枯草芽孢杆菌表达带6个组氨酸标签的人精氨酸酶I，以分子量5KD的mPEG-SPA作为修饰剂，修饰位点是赖氨酸或N末端的氨基，修饰后产物分子的PEG与Arg摩尔比为10-12，是ー种结构混合物，体内半衰期延长至3天这种修饰方式使Arg分子上连接数量不等的PEG分子,产物构象不均一，产品质量控制困难，制备エ艺过程对批间产物的质量影响较大，エ艺控制困难另ー种降解精氨酸的酶是精氨酸转亚胺酶(ADI)，这是ー种源自支原体的酶其长效分子是美国PhoenixPharmacologies,Inc研制的PEG修饰物，目前已进入II期临床石开(FrancescoIzzo等PegylatedArginineDeiminaseTreatmentofPatientsWithUnresectableHepatocellularCarcinomaResultsFromPhaseI/IIStudies.JournalofClinicalOncelogy2004(22)10，1815-1822)研究结果表明其对某些HCC细胞和黑色素瘤细胞具有明确的抑制作用，这些肿瘤细胞依赖外源性精氨酸来維持其生长，其精氨酸营养缺陷型的机理较复杂，根本原因是ASS基因的启动子被甲基化因而受到抑制该药用分子的缺点在于它是ー种支原体酶，虽然进行了PEG修饰但其免疫原性仍是ー个问题在其II期临床研究中已有报道自身抗体在前5周即可检测到，并且在以后其滴度继续上升，这将导致后续治疗的无效；其次ADI将精氨酸转变为瓜氨酸和游离氨基，在血氨水平高时会形成肝硬化和肝功能失代偿，在ー些患者会出现肝性脑病发明内容本发明的目的是研制出一种优于上述几种方案的药用分子，使其具有体内高比活、延长的半衰期、低免疫原性、结构均一稳定，并且易于进行エ艺与质量的控制；本发明的另一目的是提供该修饰分子在制备人类肝癌和黑色素瘤治疗药物中的应用本发明的目的通过下列技术实现根据现有技术，可以通过基因重组技术制备人精氨酸酶I(MasakiΙΚΕΜ0Τ0,MasayoshiTABATA,ToshioMIYAKE,etal.ExpressionofhumanliverarginaseinEscherichiacoli.Biochem,J.1990,(270)697-703);而活化的聚こニ醇可以通过多种商业途径获得本发明采用单甲氧基聚こニ醇丙醛作为修饰剂，控制反应条件，实现聚こニ醇分子与重组人精氨酸酶I分子N末端氨基连接，经分离纯化后获得的目标产物结构均一，制备エ艺的批间可控性强，修饰前后比活下降幅度较小，达到增加药用蛋白稳定性、延长体内半衰期、降低免疫原型、增强体内药效的目的本发明采用基因重组技术从人肝脏中获得人精氨酸酶I的mRNA，再将人精氨酸酶I基因克隆到大肠杆菌表达载体，转染大肠杆菌，筛选获得高表达菌株，经发酵、纯化后获得纯度大于95%的重组人精氨酸酶I;选择单甲氧基聚こニ醇丙醛作为修饰剂，控制反应条件，对重组人精氨酸酶I的N末端氨基进行定点修饰，修饰物经凝胶排阻层析和离子交换层析后获得结构均一的目标分子，体外精氨酸降解法检测酶活在修饰后下降幅度为20-30%聚こニ醇修饰是20世纪70年代后期发展起来的蛋白修饰技术将活化的聚こニ醇上蛋白质分子偶联，通过影响蛋白质分子空间结构，使蛋白质各种性质发生改变化学稳定性増加、抵抗蛋白酶水解的能力提高、体内药效更强、免疫原性和毒性降低、血浆清除率降低、体内半衰期延长等在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰常用的反应氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，N-端氨基和C-端羧基这些氨基酸残基上的反应基团多呈亲核性，其亲核活性按下列顺序依次递减巯基>α氨基>ε氨基>羧基>羟基根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型巯基通常存在于蛋白质的ニ硫键和活性位点上，而羧基如果不与蛋白质上的氨基发生分子间或分子内中和反应，很难活化因此，蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生反应的位点是暴露于分子表面的氨基酸残基上的氨基，包括α氨基或ε氣基蛋白质分子表面的游离氨基具有较高的亲核反应活性，一般不处于活性中心部位，因而成为化学修饰中最常用的被修饰基团主要被修饰的氨基是赖氨酸的ε氨基、α氨基和末端氨基游离氨基在蛋白质分子中含量较高，聚こニ醇与氨基酸的游离氨基反应时，多为随机修饰，常有几个氨基被修饰，导致多态混合物的产生，即使只结合一个聚こニ醇，也可能结合在不同的氨基位点上，产生位点异构体氨基修饰最常用的修饰剂包括SS-PEG、SC-PEG、SPA-PEG,NHS-PEG和ALD-PEG等由于蛋白质只有ー个末端氨基，因此对它的修饰可以避免多态混合物和位点异构体的产生通过还原性烷基化作用生成一种单聚こニ醇产物的衍生化作用利用了赖氨酸上的ε氨基与蛋白分子N末端氨基不同的反应性能，在控制反应pH，有特定还原剂存在的条件下，可实现蛋白分子的定点修饰本发明选择的修饰剂其一端被单甲氧基封闭，另一端为活化醛基，分子量范围5KD-40KD，最优选分子量为20KD此种活化PEG目前已有市售产品，也可按參考文献进行制备，经质量检测各指标达标即可用于修饰本发明选择的反应pH条件为4-7，该pH值可以提供赖氨酸残基上ε氨基与N末端ct氨基间ρΚ值的差异,PEG与Arg的结合作用主要发生在Arg的N末端,其他具有反应活性的集団如赖氨酸侧链氨基不发生明显的改性作用PH值也影响反应体系中蛋白与修饰剂的投料比，如果PH值过低，N末端α氨基的反应活性较差，需要更多的PEG以实现更高的反应率本发明选择的反应pH为4-7，优选4.5-6.0通常反应体系中PEG与蛋白分子的摩尔比越低，可以连接到蛋白分子上的PEG分子数越少，本发明选择反应时Arg与PEG的摩尔比为I1-110，优选I3至I6对还原性烷基化作用而言，优选还原剂能够仅还原在还原性烷基化作用的初期步骤，可用的还原剂包括氢化钠、氰硼氢化钠、ニ甲胺甲硼烷、三甲胺甲硼烷、吡啶甲硼烷，优选还原剂为氰硼氢化钠本发明所用的被修饰分子为重组人精氨酸酶I，由322个氨基酸组成，理论分子量34734.94道尔顿，等电点7.09，肽链中有3个半胱氨酸，制备得到纯度大于95%的重组人精氨酸酶I即可用于修饰反应Arg的蛋白浓度控制在2-5mg/ml,调节pH值至4-6mg/ml,加入氰硼氢化钠至终浓度为20mM，PEG的加入量是Arg摩尔数的3_6倍，整个体系在室温下搅拌反应10-15小时，加入甘氨酸终止反应PEG修饰后的混合物其分子量差异较明显，适宜用凝胶层析介质进行分离，选用SephacrylS200层析作为修饰混合物分离的第一歩,用对Arg酶活有利的pH9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液作为平衡与洗脱缓冲液，经此步操作可除去反应混合物中未反应的Arg,使PEG-Arg得以初步纯化，纯度可达90%左右此步骤的另ー个作用是对反应混合物中未參与反应的PEG和还原剂进行有效去除所用PEG是分子量为20KD的中性分子，还原剂为无机小分子物质，它们都不与填料产生吸附作用；而目标修饰物的分子量为55KD，其在S200柱层析的洗脱行为与PEG、还原剂差别较大，可一步达到PEG和还原剂的有效去除PEG的多修饰物与单修饰物在表面电荷效应上存在一定差异，利用这一点可以将S200样品中不能被完全分离的PEG多修饰物成分有效去除，达到对样品的精制根据Arg在弱碱性条件下较稳定的特点，选择适用于弱碱条件的DEAE作为结合目的蛋白的固相介质，用pH8.O的PB平衡后，以O.05MNaCl洗脱多修饰组分，O.2MNaCl洗脱目的分子，经此步骤样品纯度可达95%以上经以上各步获得符合药学质量标准的修饰蛋白原液后，即可用于半成品的配制对于治疗用途而言，本发明的目标产物可以配制于无菌的生物相容的药用载体中使用，我们研制了注射液与冻干粉针两种剂型液体剂型组成为(lml/支)PEG-Arg5mg，20mM磷酸盐缓冲液，0·01%吐温80，O.IM氯化钠，ρΗ8·O冻干剂型组成为(lml/支)PEG-Arg5mg，20mM磷酸盐缓冲液，O.IM氯化钠，5%甘露醇，pH8.O配液之后经冷冻干燥法制成冻干粉针,使用前加注射用水溶解后使用本发明的目标产物可用于人肝癌和黑色素瘤的治疗，给药频率为每7天一次治疗中发挥效用的PEG-Arg的用量通过临床试验确定，首先应在适用的动物模型中測定疗效并确定安全有效剂量，给药方式为肌肉内注射图I尿素循环与相关酶作用节点示意图部分人肝癌细胞表达尿素循环中的精氨基琥珀酸合成酶(ASS)和精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)，但不表达鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)血中PEG-Arg降解精氨酸产生的鸟氨酸再次进入细胞，但由于缺乏鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)而不能通过尿素循环进行再利用；精氨酸转亚胺酶(ADI)降解精氨酸产生瓜氨酸，瓜氨酸进入细胞，经精氨基琥珀酸合成酶(ASS)和精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)再转变成精氨酸被细胞利用，因而产生临床研究中部分患者对ADI的治疗产生抵抗相比之下，精氨酸酶(Arg)较精氨酸转亚胺酶(ADI)对人肝癌细胞的治疗谱更广图2精氨酸酶对大鼠血中精氨酸的降解作用大鼠腹腔注射(500，I,000,2000,4000IU/只)重组人精氨酸酶(Arg)后，检测血中精氨酸水平的变化，结果表明Arg只有最高剂量组(4000IU/只)可使血中精氨酸水平在注射后5小时降至20uM，随后血中精氨酸水平逐渐回升，至注射2天后恢复到正常水平图3聚こニ醇精氨酸酶对大鼠血中精氨酸的降解作用大鼠腹腔注射(500，I,000,2000，4000IU/只)聚こニ醇化重组人精氨酸酶(PEG-Arg)后，检测血中精氨酸水平的变化，结果表明PEG-Arg较低剂量组(1000IU/只)即可使血中精氨酸水平降至检测不到的水平并可持续6天与图2结果相比，说明重组人精氨酸酶经过聚こニ醇修饰达到了增强体内药效、延长体内半衰期的目的实施例根据本发明，PEG-Arg的制备与其活性验证显示在下文中，实施例更为详尽地描述了本发明，但并不限制本发明，实施例中的Arg均为大肠杆菌表达的重组人精氨酸酶I实施例I.重组人精氨酸酶I的制备PCR扩增人I型精氨酸酶基因(hAI)，插入大肠杆菌表达载体pET30a中，构建重组表达质粒pET30a-hAI，转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)，构建大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)(pET30a-hAI)，IPTG诱导后表达.SDS-PAGE分析表明，诱导后的BL21(DE3)(pET30a-hAI)在约35kD处有明显的蛋白表达经过发酵、纯化后最终纯度为95%以上详细步骤參照文献(MasakiΙΚΕΜ0Τ0,MasayoshiTABATA,ToshioMIYAKE,etal.ExpressionofhumanliverarginaseinEscherichiacoli.Biochem,J.1990,(270)697-703)实施例2.修饰位点在ArgN末端α氨基处的PEG(20KD)-Arg的制备调节Arg的蛋白浓度至4.0mg/ml,调节蛋白溶液的pH值在5.2,加入氰硼氢化钠使其终浓度为20mM，充分溶解后加入相当于Arg摩尔数4倍量mPEG_ALD(20KD)，室温下搅拌反应12小吋，加入甘氨酸终止反应反应中修饰效率用SDS-PAGE法检测，反应12小时候，SDS-PAGE结果表明70%的Arg被修饰，被修饰的组分中单修饰组分占80-90%，时间进一步延长，修饰率不再提高反应终止后离心弃沉淀，上清部分直接上Sephacryl-S2citl柱，以50mM甘氨酸-氢氧化钠(pH9.8)缓冲液加0.15M氯化钠作为洗脱液，经此步可将未被修饰的Arg分子去除根据电泳纯度情况合并经Sephacryl-S2tltl柱后的分部收集样，以50mM甘氨酸-氢氧化钠(PH9.8)缓冲液经S印hadexG25脱盐后，再上已用pH8.O的PB平衡过的DEAESepharoseFF柱，以0.05MNaCl洗脱多修饰组分，0.2MNaCl洗脱目的分子，经此步骤样品纯度可达95%以上实施例3.PEG-Arg注射液的制备经由实施例I获得的PEG-Arg原液用Lowry法测定蛋白浓度后，将5000mgPEG_Arg加入含有以下物质的液体中磷酸氢ニ钠6.78g，磷酸ニ氢钠0.17g，0.Iml吐温80，氯化钠5.844g无菌过滤后分装入2ml的西林瓶中，姆支灌装量lml实施例4.注射用PEG-Arg冻干粉针的制备经由实施例I获得的PEG-Arg原液用Lowry法测定蛋白浓度后,将5000mgPEG_Arg加入含有以下物质的液体中磷酸氢ニ钠6.78g，磷酸ニ氢钠0.17g，氯化钠5.844g，甘露醇50g无菌过滤后分装入2ml的西林瓶中，经冷冻干燥后即得实施例5.PEG-Arg对体外培养的肿瘤细胞的抑制试验选用小鼠肝癌细胞MH134、小鼠纤维瘤细胞MethA、人肝癌细胞7402、7721、H印G2，人黑色素瘤细胞SK-MEL-28进行体外细胞生长抑制试验细胞浓度为I.OXIO4/孔，培养基为含10%胎牛血清的RPM1640培养基，分试验组和对照组，试验组培养板分別加入终浓度为O.2,0.4,0.6,0.8、I.0,1.2IU/ml的受试样品(ADI、Arg、PEG_Arg)，于37°C、5%ニ氧化碳条件下孵育3-7天，之后每孔加入O.02mlMTS试剂,再孵育4小时，于490nm检测光吸收值，杀死50%细胞所需的样品比活单位被定义为IC5Q权利要求1.一种聚こニ醇修饰的重组人精氨酸酶I，其主要特征在于每个重组人精氨酸酶I分子与单ー聚こニ醇分子偶联，并且连接位点是精氨酸酶I分子的N末端α氨基2.如权利要求I所述的聚こニ醇修饰的重组人精氨酸酶I，其又ー个特征是所述聚こニ醇其一端用单甲氧基封闭，另一端带有ー个具有反应活性的醛基且分子量为10KD-40KD3.如权利要求I所述的聚こニ醇修饰的重组人精氨酸酶I，其又ー个特征是所述重组人精氨酸酶I是通过基因重组技术制备的人精氨酸酶I或者具有相同活性的突变体4.一种制备如权利要求I所述聚こニ醇修饰的重组人精氨酸酶I的方法，其主要步骤是(1)烧基化反应在室温、ΡΗ4-6、有还原剂存在的条件下，将重组人精氨酸酶I与活化的聚こニ醇醛混合，重组人精氨酸酶I与聚こニ醇的投料比(摩尔比)为I1-110，聚こニ醇的分子量为10KD-40KD，反应10-15小时，加甘氨酸终止反应(2)反应混合物的分离与纯化经凝胶排阻层析去除未修饰的重组人精氨酸酶I分子与未反应的聚こニ醇分子，再经离子交换层析去除多修饰组分后即可获得聚こニ醇修饰的重组人精氨酸酶I目标产物5.ー种药物组合物，其特征在于该组合物以权利要求I所述的分子为主要活性物质6.权利要求I所述的聚こニ醇修饰的重组人精氨酸酶I和权利要求5所述的药物组合物在制备用于治疗人类肝癌或黑色素瘤的药物中的应用全文摘要本发明属于生物
