专利名称：促红细胞生成素与聚乙二醇的偶联物的制作方法促红细胞生成素在补偿细胞破坏时产生红细胞。促红细胞生成素是使正常组织氧化作用获得足够的红细胞的受控生理机理。天然存在的人促红细胞生成素(hEPO)是在肾脏中产生的含有165个氨基酸的糖蛋白，并且是刺激红细胞产生的体液血浆因子(Carnot，P和Deflandre，C(1906)C.R.Acad.Sci.143432；Eralev，AJ(1953)血液(Blood)8349；Reissmann，KR(1950)血液(Blood)5372；Jacobson，LO，Goldwasser，E，Freid，W和Plzak，LF(1957)自然(Nature)1799331-4)。人EPO刺激定向类红细胞先祖在骨髓中分裂和分化。人EPO通过与类红细胞先祖上的受体结合而表现出其生物学活性(Krantz，BS(1991)血液(Blood)77419)。天然存在的人促红细胞生成素是在血浆中以低浓度存在以刺激随着老化而消失的红细胞的替代的酸性糖蛋白。应用重组DNA技术已经生物合成出促红细胞生成素(Egrie，JC，Strickland，TW，Lane，J等(1986)免疫生物学(Immunobiol)72213-224)，其是插入到中国仓鼠的卵巢组织细胞(CHO细胞)中并且表达的克隆的人EPO基因的产物。天然存在的人EPO首先翻译成含有166个氨基酸并且166位是精氨酸的多肽链。在翻译后修饰中用羧肽酶裂解掉166位精氨酸。图1详细说明了人EPO的一级结构(165aa)。图2详细说明了人EPO的一级结构(166aa)。Cys7-Cys161和Cys29-Cys33之间有两个二硫桥。没有糖基的人EPO的多肽链的分子量是18236Da。在完整的EPO分子中，糖基占分子量的大约40％(Sasaki，H，Bothner，Dell，A和Fukuda，M(1987)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26212059)。因为促红细胞生成素在红细胞形成中是必需的，所以激素在治疗特征在于红细胞产量低或者缺乏的血液病中是有用的。临床上，在例如慢性肾衰竭(CRF)患者贫血症的治疗中使用EPO(Eschbach，JW，Egri，JC，Downing，MR等(1987)NEJM 31673-78；Eschbach，JW，Abdulhadi，MH，Browne，JK等(1989)国际药物学年度报告(Ann.Intern.Med)111992；Egri，JC，Eschbach，JW，McGuire，T，Adamson，JW(1988)Kidney Intl.33262；Lim，VS，Degowin，RL，Zavala，D等(1989)国际药物学年度报告(Ann.Intern.Med.)111108-114)，和在艾滋病和接受化疗的癌症患者贫血症的治疗中使用EPO(Danna，RP，Rudnick，SA，Abels，RI，于MB，Garnick编著，临床应用中的促红细胞生成素-国际展望(Erythropoietin in ClinicalApplications-An International Perspective)纽约，NYMarcel Dekker；1990p301-324)。但是当前可获得的蛋白质治疗剂例如EPO的生物利用率受到它们的短的血浆半寿期和容易遭受蛋白酶降解的限制。这些缺陷阻止它们获得最大临床效力。发明概述因此，本发明是一类新的EPO的PEG衍生物。本发明的生理学活性PEG-EPO偶联物(conjugate)包括具有至少一个自由氨基的促红细胞生成素糖蛋白，并且它具有能引起骨髓细胞提高网织红细胞和红细胞的产量的体内生物学活性，所述促红细胞生成素糖蛋白选自人促红细胞生成素和具有通过加入1-6个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素的一级结构的其类似物；所述糖蛋白共价连接到1至3个低级烷氧基聚(乙二醇)基团上，每个聚(乙二醇)基团通过式-C(O)-X-S-Y-的连接基团与糖蛋白共价连接，该连接基团的C(O)与所述氨基中的一个形成酰胺键，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1至10，Y是 每个聚(乙二醇)部分的平均分子量是大约20千道尔顿至大约40千道尔顿，偶联物的分子量是大约51千道尔顿至大约175千道尔顿。本发明进一步提供了含有本文所述偶联物的组合物，其中组合物中n是1的偶联物的百分比至少是90％。与未修饰的EPO(即没有连接PEG的EPO)和常规PEG-EPO偶联物相比，本发明偶联物具有提高的循环半寿期和血浆滞留时间，降低的清除率和提高的体内临床活性。本发明的偶联物具有和EPO一样的用途。特别地，本发明的偶联物以EPO被用来治疗患者的相同方式通过刺激定向类红细胞先祖在骨髓中分裂和分化而用于治疗患者。本发明还包括治疗人贫血的方法。本发明还包括制备促红细胞生成素糖蛋白产物的方法，包括使促红细胞生成素蛋白质的赖氨酸的ε-氨基与双功能试剂共价反应，形成具有酰胺键的中间体。双功能试剂包含一个反应基团和一个保护的巯基。然后酰胺键键连的中间体与一种活化的聚乙二醇衍生物共价反应，生成本发明的促红细胞生成素糖蛋白产物。附图的简要描述图1人EPO的一级结构(165个氨基酸)。
图2人EPO的一级结构(165个氨基酸)。
图3通过正常血红细胞(normocythaemic)小鼠测试测定的聚乙二醇基化EPO的体内活性。
发明的详细描述下面的术语具有下面给出的定义术语“促红细胞生成素蛋白质”，“促红细胞生成素”，“EPO”，或“促红细胞生成素糖蛋白”指具有图1(SEQ ID NO1)或2(SEQ ID NO2)所示序列的糖蛋白或者与其基本上同源的生物学活性与刺激红细胞产生和刺激定向类红细胞先祖在骨髓中分裂和分化相关的蛋白质或多肽。如这里所使用的，术语EPO蛋白质包括例如通过定点诱变或随机突变而精密修饰的这样的蛋白质。这些术语还包括具有1-6个附加的糖基化位点的类似物，蛋白质的羧基末端具有至少一个附加的氨基酸的类似物(其中附加的氨基酸包括至少一个糖基化位点)，具有包括至少一个糖基化位点重排的氨基酸序列的类似物，例如欧洲专利公开No.640619中公开的类似物。这些术语包括天然的和重组产生的人促红细胞生成素。
术语“基本上同源的”指通过一处或多处取代，缺失或添加从参考序列变化产生的特定主观序列，例如突变序列，其净作用不导致参考和主观序列之间的不利的功能不相似性。为了本发明的目的，具有大于95％同源性，等价生物学性质和等价表达特征的序列被认为是基本上同源的。为了测定同源性的目的，成熟序列的平截应该忽略不计。具有较低程度的同源性，可比较生物活性和等价表达特征的序列被认为是基本等价物。
术语EPO蛋白质的“片段”指具有EPO蛋白质的部分或片段的氨基酸序列并且具有EPO的生物学活性的任何蛋白质或多肽。片段包括EPO蛋白质酶解产生的或者通过本领域常规方法通过化学合成的蛋白质或多肽。当对人施用蛋白质或片段导致刺激红细胞产生和刺激定向类红细胞先祖在骨髓中分裂和分化，则该EPO蛋白质或者其片段是有生物活性的。通过用于这样的目的的对一种或多种哺乳动物物种的常规的公知的试验，可以进行EPO蛋白质的生物活性测定。本文描述了能够用来证实这样的生物活性的合适的试验。
术语“治疗有效量”是引起骨髓细胞提高网织红细胞和红细胞的产量的体内生物活性所必需的促红细胞生成素糖蛋白产物的量。促红细胞生成素糖蛋白产物的精确量是对象要治疗的症状的准确类型，要治疗的患者的状况，以及组合物中其它成分这样的因素的优选主题。以通过各种方法对患有特征在于红细胞产量低或缺乏的血液病人患者施用强有效量可以配制含有促红细胞生成素糖蛋白产物的药物组合物。促红细胞生成素糖蛋白产物的平均治疗有效量可以是不同的，并且特别应该以有资格的医生的建议和药方为基础。
本发明涉及式1代表的具有引起骨髓细胞提高网织红细胞和红细胞的产量的体内生物活性的促红细胞生成素糖蛋白产物P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n1其中X和Y如上定义，m是450-900，n是1-3，R是低级烷基，P是缺少能与X形成酰胺键的一个或多个氨基的促红细胞生成素糖蛋白。如下所述，EPO的制备和纯化是本领域公知的。EPO指天然或重组蛋白质，优选人源的，从任何常规来源例如组织，蛋白质合成，用天然或重组细胞培养的细胞培养物可获得。包括具有EPO活性的所有的蛋白质，例如突变蛋白，另外或者修饰的蛋白质。通过在CHO-，BHK-或HeLa细胞系中表达，通过重组DNA技术或者通过内源基因激活，可以制备重组EPO，即通过内源基因激活表达促红细胞生成素糖蛋白。用于制备促红细胞生成素糖蛋白产物的优选的EPO物质是人EPO物质。更优选地，所述EPO物质是具有图1(SEQ ID NO1)或图2(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列的人EPO，最优选具有图1(SEQ ID NO1)所示氨基酸序列的人EPO。
人促红细胞生成素蛋白质也可以修饰至少一个附加的糖基化位点，例如1-6个糖基化位点，例如但不限于下面所述氨基酸序列。下面的注释意思是图1给出的序列通过将所示的上脚注位置处的天然氨基酸取代为指明上脚注标号左边的氨基酸而被修饰了。
Asn30Thr32图1；Asn51Thr53图1；Asn57Thr59图1；Asn69图1；Asn69Thr71图1；Ser68Asn69Thr71图1；Val87Asn88Thr90图1；Ser87Asn88Thr90图1；Ser87Asn88Gly89Thr90图1；Ser87Asn88Thr90Thr92图1；Ser87Asn88Thr90Ala162图1；Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90图1；Asn30Thr32Val87Asn88Thr90图1；Asn89Ile90Thr91图1；Ser87Asn89Ile90Thr91图1；Asn136Thr138图1；Asn138Thr140图1；Thr125图1；和Pro124Thr125图1。
人促红细胞生成素蛋白质也可以是在该糖蛋白的羧基末端具有至少一个附加的氨基酸的类似物，其中所述附加的氨基酸包括至少一个糖基化位点，即所述糖蛋白具有包括人促红细胞生成素序列和在人促红细胞生成素序列的羧基末端的第二个序列的序列，其中所述第二个序列包含至少一个糖基化位点。
附加的氨基酸可以包括从人绒毛膜促性腺激素的羧基末端衍生的肽片段。优选地，所述糖蛋白是选自下面的类似物(a)具有从羧基末端延伸的氨基酸序列Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser ArgLeu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln(SEQ ID NO3)的人促红细胞生成素；(b)进一步包括Ser87Asn88Thr90EPO的(a)中的类似物；和(c)进一步包括Asn30Thr32Val87Asn88Thr90EPO的(a)中的类似物。
人促红细胞生成素蛋白质也可以是具有包括至少一个糖基化位点的重排的氨基酸序列的类似物。所述重排可以包括在人促红细胞生成素中缺失任何N-连接的糖基位点和在人促红细胞生成素氨基酸序列的88位处加入一个N-连接的糖基位点。优选地，所述糖蛋白选自Gln24Ser87Asn88Thr90EPO；Gln38Ser87Asn88Thr90EPO；和Gln83Ser87Asn88Thr90EPO。
1995年3月1日公开的Elliot的欧洲专利公开No.640619中公开了具有附加的糖基化位点的促红细胞生成素类似物，该文献的内容在此引入作为参考。
在式1中，R可以是任何低级烷基，其意思是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基，乙基，异丙基等。优选的烷基是甲基。
在式1中，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1至大约10。优选地，k是1至大约4，更优选地k是1或2。最优选地，X是-(CH2)-。
在式1中，Y是 优选地，Y是 最优选地，Y是 在式1中，选择m的数，使得得到的式1的偶联物具有可与未修饰的EPO相当的生理活性，其活性可以与未修饰的EPO的相应的活性相同，或者大于未修饰的EPO的相应的活性，或者是未修饰的EPO的相应的活性的一部分。m代表PEG单元中环氧乙烷残基的数目。一个PEG亚基-(OCH2CH2)-具有大约44道尔顿的分子量。因此，偶联物的分子量(不包括EPO的分子量)取决于m数目。“大约”某一数目的分子量指分子量在通过常规分析技术测定的数目的合理范围内。m是大约450至大约900范围内的整数(相应于20-40kDa分子量)，优选地，m是大约550至大约800(大约24-35kDa)，最优选地，m是大约650至大约700(大约29至大约31kDa)。
在式1中，n数是通过酰胺键与PEG单元共价键合的促红细胞生成素蛋白质中赖氨酸的ε-氨基的数目。本发明的偶联物每个EPO分子可以具有一个，两个或三个PEG单元。n是1-3范围内的整数，优选n是1或2，更优选n是1。
优选的促红细胞生成素糖蛋白产物由下式代表 其中P，R，X，m和n如上定义。
最优选的促红细胞生成素糖蛋白产物由下式代表 其中P，R，X，m和n如上定义。
其它优选的促红细胞生成素糖蛋白产物由下式代表 其中P和n如上定义。
最优选的促红细胞生成素糖蛋白产物由下式代表 其中P和n如上定义。
优选的化合物是其中X是-(CH2)k-的那些化合物，尤其是其中k是1-4的那些化合物，最优选其中X是-(CH2)-的那些化合物。
本发明还涉及其中m是550-800的整数，优选地m是650-700的整数的上述偶联物。
本发明优选的化合物是其中n是1和/或R是甲基的那些化合物。
另外，本发明涉及其中每个聚(乙二醇)部分的平均分子量是大约24千道尔顿至大约35千道尔顿，更优选至大约30千道尔顿的上述化合物。
此外，本发明涉及其中糖蛋白与一个或两个低级烷氧基封端的聚(乙二醇)部分共价连接，更优选与一个低级烷氧基封端的聚(乙二醇)部分共价连接的化合物。
在优选的实施方案中，聚(乙二醇)部分由甲氧基封端。
在最优选的实施方案中，本发明涉及其中X是-(CH2)-，m是650-700的整数，n是1，R是甲基，并且其中每个聚(乙二醇)部分的平均分子量是大约30千道尔顿的上述化合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗人贫血的方法，其包括对人施用治疗有效量的式1代表的促红细胞生成素糖蛋白产物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种具有引起骨髓细胞提高网织红细胞和红细胞的产量的体内生物学活性的促红细胞生成素糖蛋白产物的制备方法，包括步骤(a)使式P-[NH2]n代表的促红细胞生成素蛋白质的赖氨酸的ε-氨基与式Z-CO-X-S-Q代表的双功能试剂共价反应，形成式P-[NH-CO-X-S-Q]n代表的具有酰胺键的中间体，其中P是缺少形成酰胺键的氨基的促红细胞生成素蛋白质；n是1-3范围的整数；Z是反应基团，例如羧基-NHS酯；X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1至大约10；Q是保护基团，象烷酰基，例如乙酰基。(b)使来自步骤(a)的具有酰胺键的该中间体与式W-[OCH2CH2]m-OR代表的活化的聚乙二醇衍生物共价反应，形成下式代表的促红细胞生成素糖蛋白产物 其中W是Y的巯基反应形式；m是大约450至大约900范围的整数；R是低级烷基；Y是 在该实施方案中，所述双功能试剂优选是N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫基丙酸酯或N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫基乙酸酯，Z优选是N-羟基琥珀酰亚胺，活化的聚乙二醇衍生物W-[OCH2CH2]m-OR优选选自碘-乙酰基-甲氧基-PEG，甲氧基-PEG-乙烯基砜，和甲氧基-PEG-马来酰亚胺。
本发明的另一个实施方案涉及含有偶联物的组合物，所述偶联物包括具有至少一个自由氨基并且具有引起骨髓细胞提高网织红细胞和红细胞的产量的体内生物学活性的促红细胞生成素糖蛋白，所述促红细胞生成素糖蛋白选自人促红细胞生成素和具有通过加入1-6个糖基化位点或者通过至少一个糖基化位点重排而修饰的人促红细胞生成素的一级结构的其类似物；所述糖蛋白共价连接1至3个低级烷氧基聚(乙二醇)基团，每个聚(乙二醇)基团通过式-C(O)-X-S-Y-的连接基团与糖蛋白共价连接，该连接基团的C(O)与所述氨基中的一个形成酰胺键，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1至10，Y是 每个聚(乙二醇)部分的平均分子量是大约20千道尔顿至大约40千道尔顿，偶联物的分子量是大约51千道尔顿至大约175千道尔顿，其中n是1的偶联物的百分比至少是90％。优选地，组合物含有如上定义的偶联物，其中n是1的偶联物的百分比至少是90％，更优选，其中n是1的偶联物的百分比至少是92％，甚至更优选地，其中n是1的偶联物的百分比至少是96％，最优选地，其中n是1的偶联物的百分比是90％-96％。
此外，本发明涉及含有如上定义的偶联物或组合物和药学可接受赋形剂的药物组合物，涉及如上定义的偶联物或组合物在制备用于治疗或预防与慢性肾衰竭患者(DRF)贫血，艾滋病相关的疾病，和治疗接受化疗的癌症患者的药物中的用途。另外，本发明涉及预防和/或治疗与慢性肾衰竭患者(DRF)，艾滋病和接受化疗的癌症患者贫血相关的疾病的方法，包括对患者施用如上定义的组合物的步骤。
本发明还涉及制备如上定义偶联物或组合物的方法，该方法包括使硫羟基与促红细胞生成素糖蛋白共价连接，并且将得到的活化的促红细胞生成素糖蛋白与聚(乙二醇)(PEG)衍生物偶联。另外，本发明涉及用如上所述的方法制备的如上定义的偶联物和组合物，和涉及用于治疗与慢性肾衰竭患者(DRF)，艾滋病和接受化疗的癌症患者贫血相关的疾病的如上定义的偶联物和组合物。表达EPO蛋白质的方法促红细胞生成素(EPO)是刺激红细胞生成的人源糖蛋白。其制备和治疗应用例如详细描述于美国专利No.5547933和5621080，EP-B0148605，Huang，S.L.，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1984)2708-2712，EP-B0205564，EP-B0209539和EP-B0411678以及Lai，P.H.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)261(1986)3116-3121，Sasaki，H.等生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262(1987)12059-12076。通过重组方法可以制备用于治疗应用的促红细胞生成素(EP-B0148605，EP-B0209539和Egrie，J.C.，Strickland，T.W.，Lane，J.等(1986)免疫生物学(Immunobiol)72213-224)。通过内源基因激活表达蛋白质，包括EPO，是本领域公知的，并且例如公开于美国专利Nos.5733761，5641670和5733746，和国际专利公开Nos.WO93/09222，WO94/12650，WO95/31560，WO90/11354，WO91/06667和WO91/09955，每一篇文献的内容在此引入作为参考。
例如在1996年11月14日公开的Burg的WO96/35718和在1992年6月12日公开的Koch的欧洲专利公开No.513738中描述了在无血清培养基中表达和制备促红细胞生成素的方法。纯化人EPO蛋白质的方法除了上述参考之外已知可以进行包含EPO基因的重组CHO细胞的无血清发酵。这样的方法描述于例如EP-A0513738，EP-A0267678，并且以Kawamoto，T等，分析生物化学(Analytical Biochem.)130(1983)445-453，EP-A0248656，Kowar，J.和Franek，F.，酶学方法(Methods in Enzymology)421(1986)277-292，Bavister，B.，Expology271(1981)45-51，EP-A0481791，EP-A0307247，EP-A0343635，WO88/00967描述的一般形式。
在EP-A0267678中，对于在无血清培养基中制备的EPO在透析后的纯化，描述了在S-Sepharose上进行离子交换层析，在C8柱子上进行制备反相HPLC和凝胶过滤层析。与此相关，可以用在S-Sepharose上快速流过的离子交换层析代替凝胶过滤层析步骤。还提议在离子交换层析之前进行在Blue Trisacryl柱子上的染料层析。
Nobuo，I.等，生物化学杂志(J.Biochem)107(1990)352-359描述了重组EPO的纯化方法。在该方法中，在纯化步骤之前用下面的溶液处理EPOTween?20，苯基甲基磺酰氯，乙基马来亚酰胺，胃蛋白酶抑制剂A，硫酸铜和草氨酸。
多篇参考如1996年11月14日公开的Burg的WO96/35718公开了一种在无血清发酵方法中制备促红细胞生成素的制备方法(EPOsf)。下文举例解释了作为聚乙二醇基化作用的起始材料的EPO的制备方法。测定EPO和EPO偶联物的特异活性的生物学测试通过本领域公知的各种测试可以测定EPO或根据本发明的EPO偶联物的特异活性。本发明的纯化的EPO蛋白质的生物学活性如此，使得通过注射对人患者施用EPO蛋白质导致与没有注射的或对照组的受试者相比骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞的产量。通过根据Pharm.EuropaSpec.Issue Erythropoietin BRP Bio1997(2)的方法可以检测根据本发明获得的和纯化的EPO蛋白质或者其片段的生物学活性。
实施例4描述了测定EPO蛋白质的另一种生物测试方法，正常血红细胞(normocythaemic)小鼠测试聚乙二醇基化EPO的制备方法式1代表的促红细胞生成素糖蛋白的制备方法包括使巯基与EPO共价连接(“活化”)并且使得到的活化的EPO与一种聚(乙二醇)(PEG)衍生物偶联。制备根据本发明的聚乙二醇化EPO的第一步包括通过EPO的NH2-基团共价连接巯基。用分别携带保护的巯基和另外的反应基团例如活化酯(例如琥珀酰亚胺基酯)，酸酐，磺酸酯，羧酸的卤化物和磺酸的双功能试剂进行EPO的活化。用本领域公知的基团例如乙酰基保护巯基。通过形成酰胺键这些双功能试剂能与赖氨酸的ζ-氨基反应。下面给出了该反应的第一步 EPO，n和X如上定义，Z是本领域公知的反应基团，例如下式的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)取代基 在优选的实施方案中，通过与具有琥珀酰亚胺基部分的双功能试剂反应进行赖氨酸的ζ-氨基的活化。所述双功能试剂可以带有不同的间隔基团，例如-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-部分，其中k是1至大约10，优选1至大约4，更优选1或2，最优选1。这些试剂的例子是N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫基丙酸酯(SATP)和N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫基乙酸酯(SATA) 乙酰基硫基烷基-羧酸-NHS-酯，如 2-(乙酰基硫基)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯其中k如上定义。
双功能试剂的制备是本领域公知的。DE-3924705描述了2-(乙酰基硫基)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯的母体，而March，J.，高等有机化学(Advanced Organic Chemistry)，McGraw-Hill，1977，375-376描述了对乙酰基硫基化合物的衍生化作用。SATA可以商业上购得(分子探针(MolecularProbes)，Eugene，OR，USA和Pierce，Rockford，IL)。
通过判断反应参数即蛋白质(EPO)浓度和蛋白质/双功能试剂之比可以选择加给EPO分子的巯基数目。优选地，通过对每一个EPO分子共价连接1-5个巯基，更优选地对每一个EPO分子共价连接1.5-3个巯基来活化EPO。这些范围指巯基对EPO蛋白质总体的统计学分布。
例如在pH6.5-8.0的缓冲溶液，例如10mM磷酸钾，50mM NaCl，pH7.3中进行该反应。可以在DMSO中加入双功能试剂。反应完全后，优选30分钟后，通过加入赖氨酸而中止反应。通过本领域公知方法例如透析或柱过滤可以分离过量的双功能试剂。通过例如Grasetti，D.R.和Murray，J.F.，应用生物化学.生物技术杂志(J.Appl.Biochem.Biotechnol)119，41-49(1967)中描述的光度法可以测定加给EPO的巯基的平均数。
上述反应之后共价连接活化的聚乙二醇(PEG)衍生物。合适的PEG衍生物是具有大约20至大约40kDa，更优选大约24至大约35kDa，最优选大约30kDa平均分子量的活化PEG分子。
活化的PEG衍生物是本领域已知的，并且描述于例如Morpurgo，M.等，生物偶联化学杂志(J.Bioconj，Chem.)(1996)Z，p.363，关于PEG-乙基砜。直链或支链PEG物质适合制备式1的化合物。反应PEG试剂的例子是碘-乙酰基-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯基砜 这些碘活化物质的应用是本领域已知的，并且描述于Hermanson，G.T.，生物偶联技术(Bioconjugate Techniques)，Academic Press，San Diego(1996)p.147-148。
最优选地，使用(烷氧基-PEG-马来酰亚胺)，例如甲氧基-PEG-马来酰亚胺，活化PEG物质(MW30000；Shearwater Polymers，Inc.)。烷氧基-PEG-马来酰亚胺的结构如下 其中R和m如上定义。
最优选的衍生物是 其中R和m如上定义。
在缓冲水溶液例如10mM磷酸钾，50mM NaCl，2mM EDTA，pH6.2中，在巯基保护基原位裂解之后进行与烷氧基-PEG-马来酰亚胺的偶联反应。例如25℃下用DMSO中的羟胺，pH6.2反应大约90分钟可以进行保护基团的裂解。对于PEG修饰，活化的EPO/烷氧基-PEG-马来酰亚胺摩尔比应该是大约1∶3至大约1∶6，优选地1∶4。通过加入半胱氨酸并且使残留的巯基(-SH)与N-甲基马来酰亚胺或者能形成二硫键的其它合适的化合物可以中止反应。因为所有的残留的活化巯基与保护基团例如N-甲基马来酰亚胺或者其它合适的保护基团反应，所以本发明的偶联物中的EPO糖蛋白可以含有这样的保护基团。一般情况下，这里描述的方法将产生具有不同数目的保护基保护的不同数目的巯基的分子的混合物，取决于没有与PEG-马来酰亚胺偶联的糖蛋白上的活化的巯基的数目。
当用来封闭聚乙二醇化蛋白质上的残留巯基时N-甲基马来酰亚胺形成相同类型的共价键，而二硫化合物将导致分子内硫化/二硫化交换反应，形成封闭剂二硫桥偶联。该封闭反应类型的优选的封闭剂是氧化的谷胱甘肽(GSSG)，半胱氨酸和胱胺。使用半胱氨酸时，没有另外的静电荷引入到聚乙二醇化蛋白质之中，而使用封闭剂GSSG或胱胺则导致另外的负电荷或正电荷。
通过本领域公知的方法，例如柱色谱法，可以对式1的化合物进行进一步纯化，包括分离一-，二和三-聚乙二醇化EPO物质。药物组合物根据本发明制备的促红细胞生成素糖蛋白产物可以通过本领域公知的方法用药学可接受载体或赋形剂制成适合注射的药物组合物。例如，合适的组合物公开于WO97/09996，WO97/40850，WO98/58660和WO99/07401。用于配制本发明的产物的优选的药学可接受载体是人血清白蛋白，人血浆蛋白质等。本发明的化合物可以在含有等张剂例如132mM氯化钠的10mM磷酸钠/钾缓冲液pH7中配制。任选地，药物组合物可以含有防腐剂。药物组合物可以含有不同量的促红细胞生成素，例如10-1000微克/毫升，例如50微克或400微克。治疗特征在于红细胞产量低或缺乏的血液病使用本发明的促红细胞生成素糖蛋白产物，导致在人体中生成红细胞。因此，施用促红细胞生成素糖蛋白产物以补充在红细胞的产生中非常重要的该EPO蛋白质。可以配制含有促红细胞生成素糖蛋白产物的药物组合物，以非常有效地通过各种方法对患有特征在于红细胞产量低或缺乏的血液病(或者是单一症状或疾病或者是部分症状或疾病)的人患者施药。通过注射例如皮下或静脉内注射可以施用药物组合物。促红细胞生成素糖蛋白产物的平均量可以不同，并且特别应该以有资格的医生的建议和药方为基础。该偶联物的精确量是要治疗的症状的准确类型，要治疗的患者的状况，以及组合物中其它成分这样的因素的优选主题。例如，可以施用0.01-10微克/千克体重，优选地0.1-1微克/千克体重，例如每星期给药一次。
本申请始终参考很多公开出版物。为了更完全描述本领域背景，这些公开出版物所公开的内容在这里引作参考。
通过下面的实施例更详细描述本发明，这些实施例只是证明目的而不是限制本发明的化合物的制备和本发明的组合物。
实施例实施例1人EPO的发酵和纯化a)种菌制备和发酵从液氮贮存器的气相中取出源自产生EPO的CHO细胞系(可以使用ATCC CRL8695，公开于EP411678(遗传研究所)(Genetics Institute))的工作细胞库的一个小瓶。将细胞转移到玻璃旋转瓶中，并且在湿润的CO2培养箱中在碳酸氢盐缓冲的培养基中培养。1992年6月12日公开的Koch的欧洲专利申请513738或者1996年11月14日公开的Burg的WO96/35718中公开了用于种菌制备和发酵的典型的无血清培养基，例如含有培养基DMEM/F12(例如JRH Biosciences/Hazleton Biologics，Denver，US，序号57-736)和另外的碳酸氢钠，L+谷氨酰胺，D+葡萄糖，重组胰岛素，亚硒酸钠，二氨基丁烷，氢化可的松，硫酸亚铁(II)，天冬酰胺，天冬氨酸，丝氨酸和用于哺乳动物细胞的稳定剂例如聚乙烯醇，甲基纤维素，葡聚糖，聚乙二醇，Pluronic F68，血浆扩张剂polygelin(HEMACCEL?)或聚乙烯吡咯烷酮(WO96/35718)的培养基。
对培养物显微镜检查是否存在污染的微生物，并且测定细胞密度。在每一个分裂步骤进行这种检测。
初始生长期后，用新鲜培养基将细胞培养物稀释至起始细胞密度并且进行另一个生长周期。重复该过程，直到每个玻璃旋转瓶获得大约2升体积的培养物。大约12次倍增之后，获得1-5升该培养物，其然后用作10升接种发酵罐的种菌。
3-5天之后，10升发酵罐中的培养物可以用作100升接种发酵罐的种菌。
再培养3-5天之后，100升发酵罐中的培养物可以用作1000升接种发酵罐的种菌。b)收获和细胞分离采用批量反复进料方法，即当达到期望的细胞密度时，收集大约80％的培养物。用新鲜培养基补充残留的培养物并且培养直到再次收集。一次生产周期包括最多10次顺序收集9次部分收集和1次发酵最后总收集。每3-4天进行收集。
将测定过的体积转移到冷却容器中。离心或过滤分离细胞并弃除。该离心步骤的含有上清液的EPO线内过滤并且收集到第二个冷却容器中。在纯化过程每一次收集分开进行。
在1996年11月14日公开的Burg的WO96/35718中公开了EPO-蛋白质的典型纯化方法。下面举例说明该纯化方法。a)蓝琼脂糖凝胶层析蓝琼脂糖(Pharmacia)由表面共价键合Cibacron蓝染料的琼脂糖小球组成。因为与大多数非蛋白质污染物(一些蛋白质杂质和PVA)相比，EPO更强地结合蓝琼脂糖，因此在该步骤中可以富集EPO。通过逐步提高盐浓度和pH值进行蓝琼脂糖柱的洗脱。
将用氢氧化钠再生并且用平衡缓冲液(氯化钠/钙和乙酸钠)平衡过的80-100升蓝琼脂糖装入柱子。装入酸化的和过滤过的发酵罐上清液。上样完之后，首先用与平衡缓冲液类似的含有更高浓度的氯化钠的缓冲液冲洗柱子，并且连续用Tris-碱缓冲液冲洗。用Tris-碱缓冲液洗脱产物，并且根据总洗脱曲线一个一个级分收集。b)丁基Toyopearl层析丁基Toyopearl 650C(TosoHaas)是共价偶联了脂肪族丁基残基的聚苯乙烯基体。因为与大多数杂质和PVA相比EPO更强地结合该凝胶，所以用含有异丙醇的缓冲液洗脱。
将用氢氧化钠再生，用Tris-碱缓冲液洗涤并且用含有异丙醇的Tris-碱缓冲液平衡过的30-40升丁基Toyopearl 650C装入柱子。
将蓝琼脂糖洗脱液调节至柱平衡缓冲液中的异丙醇的浓度并且装载到柱子上。然后用具有提高的异丙醇浓度的平衡缓冲液冲洗柱子。用洗脱缓冲液(具有高异丙醇含量的Tris-碱缓冲液)洗脱产物并且根据总洗脱曲线一个一个级分收集。c)羟基磷灰石超凝胶(Ultrogel)层析羟基磷灰石超凝胶(Biosepra)由在琼脂糖基体中掺入以提高机械性能的羟基磷灰石组成。EPO对羟基磷灰石具有低的亲合力，因此与蛋白质杂质相比可以以更低的磷酸盐浓度洗脱出来。
将用磷酸钾/氯化钙缓冲液和氢氧化钠之后用Tris-碱缓冲液再生的30-40升羟基磷灰石超凝胶装入柱子。然后用含有低含量异丙醇和氯化钠的Tris-碱缓冲液平衡。
将含有丁基Toyopearl层析洗脱液的EPO装载到柱子上。然后用平衡缓冲液和没有异丙醇与氯化钠的Tris-碱缓冲液冲洗柱子。用含有低浓度磷酸钾的Tris-碱缓冲液洗脱产物并且根据总洗脱曲线一个一个级分收集。d)在多孔层实心球C4上的反相HPLCRP-HPLC材料多孔层实心球C4(Vydac)由表面带有C4-烷基链的二氧化硅凝胶颗粒组成。从蛋白质杂质分离EPO是以疏水性相互作用的强度的不同为基础。用在稀释的三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗脱。
使用不锈钢柱子(装入了2.8-3.2升VydacC4二氧化硅凝胶)进行制备HPLC。通过加入三氟乙酸来酸化羟基磷灰石超凝胶洗脱液，并且装载到VydacC4柱子上。使用在稀释的三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗涤和洗脱。收集级分并且立即用磷酸盐缓冲液中和。集中IPC限制内的EPO级分。e)DEAE琼脂糖层析DEAE琼脂糖(Pharmacia)材料由二乙基氨基乙基(DEAE)组成-基团在琼脂糖小球表面共价键合。离子相互作用介导EPO与DEAE基团的结合。乙基和三氟乙酸通过柱子没有保留。将这些物质洗出之后，通过用低pH的乙酸盐缓冲液冲洗柱子来去除痕量杂质。然后用中性磷酸盐缓冲液冲洗柱子，并且用提高的离子强度的缓冲液洗脱EPO。
用DEAE琼脂糖高流速装填柱子。调节柱体积以保证以3-10毫克EPO/毫升凝胶范围装载EPO。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/钾)冲洗柱子。加载HPLC洗脱液的合并的级分并且用平衡缓冲液冲洗柱子。然后用冲洗缓冲液(乙酸钠缓冲液)冲洗柱子，接着用平衡缓冲液冲洗柱子。接着，用洗脱缓冲液(氯化钠，磷酸钠/钾)从柱子上洗脱EPO，并且根据总洗脱曲线一个一个级分收集。
将DEAE琼脂糖柱子的洗脱液调节具有具体的导电率。将得到的药物物质灭菌过滤到聚四氟乙烯瓶中并且在-70℃下贮存。
实施例2巯基与EPO共价连接该实施例公开了巯基与EPO共价连接的反应条件的确定。为了确定反应条件，向EPO溶液，这里向1毫升10mM磷酸钾，50mM氯化钠，pH7.3中的5毫克/毫升EPO，加入不同量的含有保护的巯基的试剂，这里是SATA或SATP(溶解于DMSO，ad 10毫克/毫升)。将反应搅拌大约30分钟(25℃)，并且通过加入1M赖氨酸溶液(10mM)中止反应。通过用10mM磷酸钾，50mM氯化钠和2mM EDTA，pH6.2透析去除过量的SATA和SATP。用羟胺去除保护的乙酰基之后，根据Grasetti，D.R.和Murray，J.F.在生物化学.生物技术应用杂志(J.Appl.Biochem.Biotechnol.)中描述的方法用二硫基二吡啶光度法测定与EPO共价连接的巯基的数目。
下面给出每个EPO分子共价连接的巯基的数目。
实施例3用甲氧基-PEG-马来酰亚胺修饰活化的EPOA)EPO的活化根据实施例2用SATA(摩尔比EPO/SATA＝1/5)活化根据实施例1制备的100毫克EPO(正常血红细胞(normocythaemic)小鼠测试测定为190000 IU/毫克)。如实施例1所述通过透析从副产物象N-羟基-琥珀酰亚胺或没有反应的SATA分离携带共价连接的保护的巯基的产物EPO(“活化EPO”)。获得10mM磷酸钾，50mM氯化钠和2mM EDTA，pH6.2中4.5毫克/毫升活化EPO溶液。B)活化EPO的聚乙二醇化作用。
将380毫克具有上述“最优选的”结构的甲氧基-PEG-马来酰亚胺(MW30000；Shearwater Polymer，Inc.，Huntsville(Alabama，USA))溶解于含有95毫克活化EPO(4.5毫克/毫升，于10mM磷酸钾，50mM氯化钠和2mM EDTA，pH6.2中的上述溶液中)。活化EPO与甲氧基-PEG-马来酰亚胺之间最终摩尔比是1∶4。通过向上述溶液加入1M羟胺水溶液(ad 30mM，pH6.2)，将活化EPO的共价连接的保护的巯基去保护。该溶液的反应混合物中得到的活化EPO包含自由巯基(-SH)。巯基去保护之后立即进行现在包含自由巯基(-SH)的活化EPO和甲氧基-PEG-马来酰亚胺之间的偶联反应90分钟(搅拌，25℃)。通过向反应混合物中加入0.2M 2mM半胱氨酸水溶液中止偶联反应。30分钟之后，通过加入DMSO中的0.5M N-甲基马来酰亚胺达到5mM的浓度保护没有与甲氧基-PEG-马来酰亚胺反应的活化EPO的过量的自由巯基。30分钟之后，用10mM磷酸钾，pH7.5将现在含有聚乙二醇化EPO物质所得到的反应混合物透析≥15小时。C)聚乙二醇化EPO物质的纯化关于从反应混合物分离聚乙二醇化EPO物质，进行下面的纯化方法用10mM磷酸钾，pH7.5平衡50毫升Q-琼脂糖ff柱。将步骤B)获得的反应混合物加载到柱子上(流速每小时3柱体积(CV))。为了分离没有反应的甲氧基-PEG-马来酰亚胺试剂，用5CV的10mM磷酸钾，pH7.5冲洗柱子。以每小时3CV的流速，用由5CV的缓冲液A(10mM磷酸钾，pH7.5)和5CV的缓冲液B(10mM磷酸钾，500mM氯化钠，pH7.5)组成的渐增盐梯度洗脱，分离聚乙二醇化EPO物质。根据氯化钠梯度，首先洗脱出聚乙二醇化EPO物质(三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物质)，接着洗脱出没有聚乙二醇化EPO物质。集中含有聚乙二醇化EPO物质(三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物质)的洗脱液级分，并且过滤(用0.2微米过滤器灭菌过滤)。
在考马斯染色的SDS-PAA凝胶(Laemmli，自然(Nature)227，680-685(1970))上评价三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物质的内含物和纯度，同时根据Beer-Lambert定律在280nm处测定蛋白质浓度。通过SDS-PAA凝胶电泳测定的EPO物质的表观分子量是大约68千道尔顿(一-聚乙二醇化EPO物质)，大约98千道尔顿(二-聚乙二醇化EPO物质)，和大约128千道尔顿(三-聚乙二醇化EPO物质)。
通过层析法，例如通过大小排阻层析(Superdex，pg200；Pharmacia)，可以实现三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物质的进一步分离。
通过实施例4描述的方法进行含有三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物质的洗脱液的体内生物学活性的测定。
实施例4通过正常血红细胞(normocythaemic)小鼠测试测定聚乙二醇化EPO的体内活性正常血红细胞(normocythaemic)小鼠生物测试是本领域公知的(Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio1997(2))，并且Ph.Eur.BRP的促红细胞生成素的专题论文公开了一种方法。用BSA-PBS稀释样品。对7-15周龄的正常健康小鼠皮下施用0.2毫升含有如实施例2所述三-，二-和一-聚乙二醇化EPO的EPO级分。自给药后72小时起过4天，通过穿刺术从尾静脉抽血并且稀释，使得1毫升0.15微摩尔吖啶橙染色溶液中存在1微升血样。染色时间是3-10分钟。在流式细胞仪中通过分析红荧光直方图显微荧光法进行网织红细胞计数。以独立图表给出网织红细胞计数(每30000分析的红细胞)。对于给出的数据，每个组包括每天5只小鼠，小鼠只抽血一次。
对小鼠施用根据实施例3的与EPO偶联的甲氧基-PEG-马来酰亚胺，未修饰的EPO和缓冲液。图3给出了结果。通过对每只小鼠使用同剂量的明显增加量的网织红细胞和网织红细胞最大量的位移表征，结果表明聚乙二醇化EPO物质的卓越活性和延长的半寿期。
序列表<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司<120>促红细胞生成素与聚乙二醇的偶联物<130>PC01520<160>3<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>165<212>PRT<213>人<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp165<210>2<211>166<212>PRT<213>人<400>2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>3<211>28<212>PRT<213>人<400>3Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg1 5 10 15Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln20 2

本发明公开了促红细胞生成素糖蛋白偶联物,所述偶联物包括具有至少一个自由氨基的促红细胞生成素糖蛋白,并且所述促红细胞生成素糖蛋白具有引起骨髓细胞提高网织红细胞和红细胞的产量的体内生物学活性,所述促红细胞生成素糖蛋白选自人促红细胞生成素和具有通过加入1－6个糖基化位点或者通过至少一个糖基化位点重排而修饰的人促红细胞生成素的一级结构的其类似物;所述糖蛋白共价连接1至3个低级烷氧基聚(乙二醇)基团,每个聚(乙二醇)基团通过式－C(O)－X－S－Y－的连接基团与糖蛋白共价连接,该连接基团的C(O)与所述氨基中的一个形成酰胺键,其中X和Y如在说明书和权利要求书中的定义,每个聚(乙二醇)部分的平均分子量是大约20千道尔顿至大约40千道尔顿,偶联物的分子量是大约51千道尔顿至大约175千道尔顿。