一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF活性药物组合物的制作方法 [0002] 粒细胞集落刺激因子G-CSF可用于各种细胞减少症，可以使干细胞和前体细胞从 骨髓转移，并用于治疗由化学疗法引起的粒细胞减少症患者。蛋白质治疗药物重组人粒细 胞刺激因子（rhG-CSF)的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，即其体内半衰期较短，用药 后很快从体内清除，需要每天应用，从而增加了患者的痛苦。 [0003] PEG-rhG-CSF是由rhG-CSF蛋白经PEG (聚乙二醇)修饰所得，其血浆半衰期延长， 并且免疫原性降低、生物利用度提高、稳定性增强、安全性更高。 [0004] 中国专利申请CN1139932A (文献1)公开了一种N-末端单聚乙二醇化的rhG-CSF 的制品，在该专利说明书中，未提示纯化后样品单PEG化的rhG-CSF的含量。我们参考该 专利公开方法，采用mPEG 20kDa对rhG-CSF进行反应，单PEG化的rhG-CSF的转化率只有 70%左右，同时对其产品进行体外活性检测，其生物学活性为3. 5 X 107IU/mg。中国专利申 请CN1663962A (文献2)公开了 rhG-CSF N末端和非N末端聚乙二醇修饰物及其一步纯化 工艺。我们参考该专利公开的方法，采用mPEG 20kDa对rhG-CSF进行反应，经纯化后的产 品含 98%mPEG-rhG-CSF 及 2% 的 rhG-CSF，其生物学活性为 4. OX 107IU/mg。 [0005] 根据文献1公开的方法制得的mPEG-rhG-CSF其纯度仅有70%左右，含有杂 质较多，同时其生物学活性为3. 5X107IU/mg，活性较低。根据文献2制得的N末端 mPEG-rhG-CSF其纯度可达到98%以上，但是其生物学活性与文献1制得的产品活性相近，仅 为4. OX 107IU/mg活性较低。

[0006] 为了提高N-末端mPEG-rhG-CSF的产品纯度及其生物学活性，获得药效更高的产 品而提供一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF活性药物组合物。
[0007] 本发明主要是通过对制备得到的mPEG-rhG-CSF产品进行研究，发现产品中主要 存在以下组分 ： (1) 未反应完的原料，如：mPEG，rhG-CSF ; (2) 其它取代位置的单（mono)取代mPEG-rhG-CSF ; (3) 多取代的 mPEG-rhG-CSF，如 di-mPEG-rhG-CSF、tri-mPEG-rhG-CSF ; (4) 其它组分，如外源性DNA、宿主菌蛋白等。
[0008] 发明人通过大量研究发现，当产品中N末端mono-mPEG-rhG-CSF的纯度在[95%， 98%)区间，上述（2)~ (3)类组分总和含量在[2%，5%)区间，且（1)类组分中rhG-CSF含量 在[0,彡3%]区间，（4)类组分含量在（0,0. 5%)区间时，产品质量稳定，保障了其临床用药 安全。
[0009] 因此，本发明提供一种N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物，包括以下组 分： 组分 I :N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF，95. 0% 彡纯度 < 98. 0% ; 组分 II :选自 rhG-CSF、非 N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、 tri-mPEG-rhG-CSF中的一种或几种，0彡含量彡5· 0%，且0彡rhG-CSF含量彡3· 0% ; 组分III :mPEG，0彡含量彡5. 0% ; 以及其他组分，〇彡含量< 〇. 5%。
[0010] 上述药物活性组合物中： 优选地，组分I :96. 0%彡纯度< 97. 0% ;组分II :选自rhG-CSF、非N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri- mPEG-rhG-CSF 中的一种或几种，0 彡含量 彡3. 0% ;组分III :0彡mPEG含量彡3. 0% ;以及其他组分，0彡含量< 0· 5% ; 更优选地，组分I :97. 0%彡纯度< 98. 0% ;组分II :选自rhG-CSF、非N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri- mPEG-rhG-CSF 中的一种或几种，0 彡含量 彡2. 0% ;组分III :0彡mPEG含量彡2. 0% ;以及其他组分，0彡含量< 0· 5%。
[0011] 上述任一药物活性组合物中，所述组分II与组分III的总含量彡2%。
[0012] 上述任一药物活性组合物中，所述mPEG优选为分子量为20kDa的mPEG。
[0013] 上述任一药物活性组合物中，所述其他组分包含外源性DNA、宿主菌蛋白；优选 地，所述外源性DNA含量< IOng/剂量，所述宿主菌蛋白含量< 0. 02%。
[0014] rhG-CSF序列中的5个赖氨酸为mPEG的结合位点，因此，上述药物活性组合物中， 所述mono-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中，任一位点与PEG结合的mPEG-rhG-CSF ; 非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF指的是，除N-末端外，其它任一结合位点形成的 mono-mPEG-rhG-CSF ;所述di-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中任意两个位点结合 mPEG的mPEG-rhG-CSF ;所述tri-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中任意三个位点结合 mPEG 的 mPEG-rhG-CSF。
[0015] 本发明中所述组分I含量指的是其蛋白含量。
[0016] 本发明的N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物组合物制成的mPEG-rhG-CSF产品，体 外活性彡 9. 0X107IU/mg。
[0017] 本发明所述聚乙二醇修饰的rhG-CSF活性组合物，其纯度可达到95%以上，且其 生物学活性达到9. OXlO7IUAig以上，是现有技术制备产品的生物学活性的两倍以上，因 此本发明的药物组合物具有更优的药效。同时，本发明的药物组合物的其他各项指标均符 合药用要求，质量稳定，且半衰期、安全性等方面均优于现有技术产品，能够保证N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF制剂的临床疗效及用药安全。
[0018] 具体实施实例 实施例1制备mPEG-rhG-CSF粗品 制备 rhG-CSF 反应溶液，浓度为 5. 0mg/mL，含有 IOOmMNaH2PO4, 20mM NaCNBH3, ρΗ5· 0,将 其于4°C下充分搅拌后，加入摩尔数为rhG-CSF摩尔数5倍量的20kDamPEG，反应液于4°C下 搅拌反应l〇h。然后将反应液用IOOmM HCl调至pH4.0,浓缩，得mPEG-rhG-CSF粗品。HPLC 检测，检测结果见表3,体外活性测定结果见表4。
[0019] 实施例 2: N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF的制备 (1) 离子交换色谱法层析：将实施例l所得mPEG-rhG-CSF粗品用MaCr0CapSP(直径 300mm，高12cm)的离子交换色谱法层析： ① 上样：将mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A (IOmM醋酸钠-醋酸，0. 004%吐温-80， ρΗ4· 0±0· 5)稀释至 100~200μ g/mL，以 340mL/min±10% 流速上样，上样量 IOmg 蛋白 /ml 填料； ② 冲洗：以缓冲液A 400mL/min± 10%流速冲洗3个柱体积； ③ 梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B( IM氯化钠，IOmM醋酸钠-醋酸，0. 004%吐温-80， pH4. 0±0. 5)以90mL/min± 10%的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积（梯度从0%至60%)，收集 mPEG-rhG-CSF蛋白洗脱峰； (2) 分子筛层析： ① 将离子交换层析收集的mPEG-rhG-CSF蛋白用Superdex 75柱(直径200mm，高60cm) 以120mL/min± 10%的流速上样，上样体积为柱体积的5% ; ② 以缓冲液A以120mL/min±10%的流速洗脱，收集目的蛋白N-末端 mono-PEG-rhG-CSF。
[0020] 将所得流分进行浓缩至5mg/mL，HPLC检测，检测结果见表3,体外活性测定结果见 表4。
[0021] 实施例 3: N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF的制备 (1) 离子交换色谱法层析：将实施例1所得mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP (直径 300mm，高12cm)的离子交换色谱法层析： ① 上样：将mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A (IOmM醋酸钠-醋酸，0. 004%吐温-80， ρΗ4· 0±0· 5)稀释至 100~200 μ g/mL,以 340mL/min± 10% 流速上样，上样量 8mg 蛋白 /ml 填 料； ② 冲洗：以缓冲液A 400mL/min± 10%流速冲洗3个柱体积； ③ 梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B( IM氯化钠，IOmM醋酸钠-醋酸，0. 004%吐温-80， pH4. 0±0. 5)以90mL/min± 10%的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积（梯度从0%至60%)，收集 mPEG-rhG-CSF蛋白洗脱峰； (2) 分子筛层析： ① 将离子交换层析收集的mPEG-rhG-CSF蛋白用Superdex 75柱(直径200mm，高60cm) 以120mL/min± 10%的流速上样，上样体积为柱体积的5% ; ② 以缓冲液A以120mL/min±10%的流速洗脱，收集目的蛋白N-末端 mono-PEG-rhG-CSF。
[0022] 将所得流分进行浓缩至5mg/mL，HPLC检测，检测结果见表3,体外活性测定结果见 表4。
[0023] 实施例4:N-末端mono-mPEG-;rhG-CSF的制备 (1)离子交换色谱法层析：将实施例1所得mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP (直径 300mm，高12cm)的离子交换色谱法层析： ①上样：将mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A (IOmM醋酸钠-醋酸，0. 004%吐温-80， ρΗ4· 0±0· 5)稀释至 100~200 μ g/mL,以 340mL/min± 10% 流速上样，上样量 6mg 蛋白 /ml 填 料； ② 冲洗：以缓冲液A 400mL/min± 10%流速冲洗3个柱体积； ③ 梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B( IM氯化钠，IOmM醋酸钠-醋酸，0. 004%吐温-80， pH4. 0±0. 5)以90mL/min± 10%的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积（梯度从0%至60%)，收集 mPEG-rhG-CSF蛋白洗脱峰； (2)分子筛层析： ① 将离子交换层析收集的mPEG-rhG-CSF蛋白用Superdex 75柱(直径200mm，高60cm) 以120mL/min± 10%的流速上样，上样体积为柱体积的5% ; ② 以缓冲液A以120mL/min±10%的流速洗脱，收集目的蛋白N-末端 mono-PEG-rhG-CSF。
[0024] 将所得流分进行浓缩至5mg/mL，HPLC检测，检测结果见表3,体外活性测定结果见 表4。
[0025] 实施例 5:mPEG-rhG-CSF的制备 取纯化所得rhG-CSF，稀释至2. Omg/ml，对0. IMNaH2PO4, pH5. 0于4°C透析过夜，调节pH 至 5. 0。
[0026] ①取分子量为20kD的mPEG，按mPEG :rhG-CSF摩尔比5:1比例加入mPEG，充分搅 拌溶解。
[0027] ②再取IM NaCNBH3加入反应液，终浓度为20mM。充分搅拌混匀后置4°C反应过夜。
[0028] ③取修饰后样品，用蒸馏水稀释两倍体积后，再用乙酸调节至pH4. 0,离心去沉淀。
[0029] ④取阳离子层析介质SP Sepharose F. F.，装柱后取平衡缓冲液I (10mmol/L乙 酸-乙酸钠，PH4. 0)平衡至基线后上样样品，再用平衡缓冲液II (lOmmol/L乙酸-乙酸钠， pH5. 0)平衡至基线。
[0030] ⑤取洗脱缓冲液I (lOmmol/L乙酸-乙酸钠，pH5. 6)洗脱下N-末端修饰的 mPEG-rhG-CSF目的蛋白峰。
[0031] 将所得流分进行浓缩至5mg/mL，HPLC检测，检测结果见表3,体外活性测定结果见 表4。
[0032] 实施例6:实施例组分检测方法 1.组分I及组分II中各成分的含量检测方法：高效液相色谱法 色谱条件及测定方法 仪器：WATERS 600型高效液相色谱仪 色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 测定方法：以A相(三氟乙酸-水溶液：量取LOml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀)、 B相(三氟乙酸-乙腈溶液：量取I. Oml三氟乙酸和99ml水加入色谱纯乙腈至1000ml，充分 混匀)为流动相，在室温条件下，按下表进行梯度洗脱。上样量应不低于lOKg，在波长280nm 处检测。
[0033] 表1组分I及组分II流动相洗脱梯度