专利名称：负载rhGM-CSF的组织工程皮肤真皮替代物再生材料及其制备方法皮肤作为人体最大的器官，主要由表皮层、真皮层和皮下组织构成，同时含有丰富 的血管和神经。日常工作生活中由于各种原因如创伤、烧伤、慢性疾病、手术等很容易造成 皮肤的缺损。皮肤组织虽然具有较强的再生能力，但是在大面积的全层皮肤缺损情况下，由 于真皮层的缺失，皮肤的再生能力明显减弱，极易产生大量的瘢痕形成或瘢痕挛缩。治疗全层皮肤缺损的关键是重建和再生真皮组织、促进创面尽早封闭、避免微生 物入侵等。目前，应对组织缺损的方式主要有三种，即自体组织移植、异体/异种组织移 植、人工材料替代。自体皮移植仍然是临床治疗全层皮肤缺损最有效的方法，但是该方法面 临着自体皮供应不足的缺点，且是一种“以伤治伤”的办法；异体或异种组织移植又受到免 疫排斥反应的限制；另一个常用的治疗方法就是采用人工材料皮肤。目前国际市场上人工 皮肤有 Apligraf、Integra、Transcyte、AlloDerm 禾口 Dermagraft 等。胶原-壳聚糖多孔支架真皮替代物再生材料可以有效诱导缺损组织处细胞的迁 移、增殖和分化，原位诱导缺损真皮组织的再生。该真皮替代物再生材料不但可以在体内起 到良好的支撑作用，而且其所采用的胶原和壳聚糖是具有良好生物相容性、低免疫原性和 可降解性的天然高分子材料。中国发明专利(申请号02112498. 1申请日2002-07-10)公开了组织工程用胶 原/壳聚糖多孔支架的制备方法，该方法采用天然生物材料胶原和壳聚糖为原料，通过冷 冻-冻干，再进一步通过真空干热法、醛类化合物或碳化二亚胺类化合物交联，制备具有微 结构可控、适宜降解速率和良好生物相容性的多孔支架。该发明的胶原/壳聚糖支架的生 物相容性好，降解速率可控，且材料来源广泛，成本低，制备工艺简单可行，重复性好，所构 建的支架可以广泛地应用于组织工程领域，具有良好的临床应用前景。进一步，中国发明专利(申请号200510060749. 6申请日2005-09-13)公开了复 合血管生成素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法，该方法用乙酸溶液分别将牛腱 胶原、壳聚糖配制成0. 5^5%的溶液，混合均勻注入模具，壳聚糖溶液含量为5 30%，冷冻后 置冻干机中冻干得到胶原/壳聚糖多孔支架；真空处理后，将其浸泡到含肝素钠的2-N-吗 啉乙烷磺酸溶液中浸泡，然后添加1-乙基-3-3- (二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟 基丁二酰亚胺溶液处理，清洗，再次冷冻、冻干得到肝素化胶原/壳聚糖多孔支架；浸泡到 血管生成素溶液中。该专利工艺简单、有效，影响因素少，较易推广，制备的肝素化胶原/壳 聚糖多孔支架所具有适宜的孔径和孔隙率，适合皮肤组织工程的真皮替代物。人工真皮替代物再生材料血管化速度是影响其再生能力、材料移植成活率的关 键。由于人工真皮替代物再生材料中缺乏相互连通的血管网络，难以实现与创面基底区血 管的快速接连。在移植初期，人工真皮替代物再生材料中的细胞所需要的营养物质主要依靠扩散作用来实现，而细胞的增殖和分化等功能常因营养成分的缺乏而受限，甚至导致细 胞调亡，从而影响其再生速度和存活率。目前的人工真皮替代物再生产品的血管化速率较 慢，植入物完全血管化一般需要几周(2、周)的时间，增加了病人的住院时间和感染风险。 因此，如何促进人工真皮替代物再生材料的血管化速度，进而缩短创面缺血时间，提高移植 存活率，是皮肤再生与修复研究中亟待解决的关键问题。多项研究证实rhGM-CSF在深II度烧伤创面、慢性疾病所致溃疡等多种原因导致 的皮肤缺损治疗中显示了明显的积极作用，rhGM-CSF能够通过从骨髓动员和招募造血干细 胞和内皮干细胞，以调节造血细胞的增殖、分化和存活，还特异性地刺激骨髓祖细胞向粒细 胞和巨噬细胞分化，以调动免疫系统。但细胞因子存在活性不稳定，容易降解的缺陷。发明内容为了解决细胞因子存在活性不稳定，容易降解的缺陷，本发明的一个目的是提供 一种负载rhGM-CSF的组织工程皮肤真皮替代物再生材料，该再生材料具有快速血管化，可 广泛应用于创伤和烧伤等全层皮肤缺损修复。本发明的另外一个目的是提供一种上述的负 载rhGM-CSF的组织工程皮肤真皮替代物再生材料的制备方法。
为了实现上述第一个目的，本发明采用了以下的技术方案负载rhGM-CSF的组织工程皮肤真皮替代物再生材料，该再生材料由肝素化的胶原-壳 聚糖支架负载所述rhGM-CSF溶液构成。
作为优选，上述的rhGM-CSF溶液的浓度为lOOng/m广300 μ g/ml。
作为优选，上述的肝素化的胶原-壳聚糖支架由胶原-壳聚糖支架在含肝素、EDC (1-乙基-3-3-( 二甲基胺丙基)-碳化二亚胺)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)的MES(2-N-吗 啉乙烷磺酸)溶液中真空脱泡后交联反应，然后冷冻干燥制得，肝素与胶原-壳聚糖支架中 的胶原的质量比为1:20 1:4，EDC和NHS的浓度比为1:1 4:1。
作为再优选，上述的胶原-壳聚糖支架中壳聚糖和胶原的质量比为1:纩5:5。
为了实现上述第二个目的，本发明采用了以下的技术方案一种制备上述的负载rhGM-CSF的组织工程皮肤真皮替代物再生材料的方法，该方法 包括以下的步骤1)用质量浓度为0.39Γ5%的乙酸溶液分别配制质量浓度为0. 059Γ5%的胶原溶液和壳 聚糖溶液，将壳聚糖溶液加入胶原溶液中，充分搅拌均勻、真空脱泡后，得到胶原-壳聚糖 混合溶液；将胶原-壳聚糖共混液注入模具中，于4°C下充分作用M小时后，采用冷冻-干 燥法，在_5°C -80°C温度下冷冻干燥，获得胶原-壳聚糖三维多孔支架；2)将上述步骤1)所得的胶原-壳聚糖三维多孔支架在80°C 180°C下真空干热交联处 理24小时；3)将肝素按与胶原-壳聚糖支架中的胶原的质量比为l:2(Tl:4的比例置于含EDC和 NHS的MES溶液中，充分搅拌混勻；再将上述步骤2)所得的干热处理后的胶原-壳聚糖支 架置于该种混合液中，真空脱泡，交联114小时；反复冲洗后，再次在_5°C -80°C温度下冷 冻干燥，制得所述的肝素化的胶原-壳聚糖支架；4)利用注射用水或去离子水配制浓度为lOOng/m广300μ g/ml的rhGM-CSF溶液，将胶 原-壳聚糖支架浸泡在该溶液中，4°C下静置孵育M小时，即得到所述的负载rhGM-CSF的组织工程皮肤真皮替代物再生材料。
当然，本发明的胶原-壳聚糖支架可以采用中国发明专利0211M98. 1公开的方法 制备，肝素化的胶原-壳聚糖支架也可以采用200510060749. 6公开的方法制备。
作为优选，上述的EDC与NHS比为1:1 4:1。
作为优选，上述的MES溶液的浓度0. 05M, pH5. 4。
本发明将细胞因子治疗与组织工程再生医学的方法和技术结合，选择具有良好 生物相容性、低免疫原性和可降解性的天然高分子材料，与rhGM-CSF相复合，形成具有 rhGM-CSF生物活性的复合型组织工程皮肤真皮替代物再生材料，实现rhGM-CSF的可控的 持续释放，促进人工真皮替代物再生材料的血管化，最终获得具有高移植成活率和良好再 生修复效果的复合型组织工程皮肤真皮替代物再生材料。
本发明制备的负载rhGM-CSF的组织工程皮肤真皮替代物再生材料，其突出特点 是以可生物降解的胶原蛋白为主要原料，添加壳聚糖起促进交联、增强与耐降解作用；通过 控制冷冻干燥条件，得到具有特定微结构(孔径、孔隙率等)的多孔支架。通过改变rhGM-CSF 负载量，得到具有不同血管化速度的人工真皮替代物再生材料。结果表明该人工真皮替代 物再生材料能够有效促进内皮细胞的迁移、增殖和分化，促进成纤维细胞的浸入，具有良好 的组织相容性。SD大鼠皮下埋植实验发现能够快速血管化(10天)。这种人工真皮替代物再 生材料可作为组织生长的临时支架，促进创面的血管化，肉芽组织、内皮细胞和成纤维细胞 在多孔支架内的生长。这些长入的组织或细胞会分泌出相应的细胞外基质进而分化成新的 皮肤组织，促进受损皮肤的再生。与此同时，外源性的胶原-壳聚糖多孔支架会随着新生组 织的不断生长而逐渐降解，并被机体吸收，最终得到的是与人体自身几乎一致的皮肤组织。
本发明为创伤、烧伤和慢性皮肤溃疡等全层皮肤缺损的治疗提供了一种性能良好 的人工真皮替代物，可以显著加速人工真皮替代物再生材料的血管化进程、降低感染风险， 促进创面的愈合，减少瘢痕的增生，进而减轻病人的痛苦。可以广泛应用于创伤、烧伤和外 科整形等方面。本发明制备方法简单，材料来源广泛，生产效率高，适用于产业化生产。与 国外同类产品相比，本发明产品成本方面具有很大优势。


图1是本发明负载rhGM-CSF的胶原-壳聚糖复合型支架的扫描电镜(SEM)照片。
图2是本发明负载rhGM-CSF的胶原-壳聚糖复合型支架在SD大鼠体内埋植的手 术照片。
图3是本发明负载rhGM-CSF的胶原-壳聚糖复合型支架在SD大鼠体内埋植7天、 14天后的大体照片，虚线代表埋植材料边界。
图4是本发明负载rhGM-CSF的胶原-壳聚糖复合型支架在SD大鼠体内埋植14 天后的大体照片，虚线代表埋植材料边界。
图5是本发明负载rhGM-CSF的胶原-壳聚糖复合型支架在SD大鼠体内埋植7天 天后的HE图，箭头表示血管，m表示埋植材料，X 200。
图6是本发明负载rhGM-CSF的胶原-壳聚糖复合型支架在SD大鼠体内埋植14 天后的HE图，箭头表示血管，m表示埋植材料，X 200。

将胶原和壳聚糖分别配成质量分数为0. 5%乙酸溶液，然后将胶原溶液和壳聚 糖溶液按照9 1的体积比混合后，充分搅拌均勻，注入直径为2cm的模具中，使其高度达 1. 5mm，置于4°C下M小时后，于-20°C冷冻M小时，然后置于冻干机中冻干16小时；冻干的 支架于105°C下真空干热交联M小时；根据肝素与胶原质量比为1:10的比例，将肝素添加 至摩尔浓度比为2 :1的EDC (20_ol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的0. 05M MES (pH5. 4) 溶液中，再将上述冻干后的支架置于该混合液中交联M小时，经反复清洗后再次冷冻-冻 干得到交联后的肝素化的胶原-壳聚糖支架(微结构见图1)。
将肝素化的胶原-壳聚糖支架经环氧乙烷消毒后，滴加浓度为100yg/ml的 rhGM-CSF溶液300 μ 1，4°C下孵育过夜，备用。
实施例2将胶原和壳聚糖分别配成质量分数为0. 5%乙酸溶液，然后将胶原溶液和壳聚糖溶液 按照9 1的体积比混合后，充分搅拌均勻，注入直径为2cm的模具中，使其高度达1. 5mm，置 于4°C下M小时后，于_20°C冷冻M小时，然后置于冻干机中冻干16小时；冻干的支架于 105°C下真空干热交联M小时；根据肝素与胶原质量比为1:10的比例，将肝素添加至摩尔 浓度比为2 :1的EDC (20_ol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的0. 05M MES (pH5. 4)溶液 中，再将上述冻干后的支架置于该混合液中交联M小时，经反复清洗后再次冷冻-冻干得 到交联后的肝素化的胶原-壳聚糖支架(微结构见图1)。
将肝素化的胶原-壳聚糖支架经环氧乙烷消毒后，滴加浓度为200 μ g/ml的 rhGM-CSF溶液200 μ 1，4°C下孵育过夜，备用。
实施例3将胶原和壳聚糖分别配成质量分数为0. 5%乙酸溶液，然后将胶原溶液和壳聚糖溶液 按照9 1的体积比混合后，充分搅拌均勻，注入直径为2cm的模具中，使其高度达1. 5mm，置 于4°C下M小时后，于_20°C冷冻M小时，然后置于冻干机中冻干16小时；冻干的支架于 105°C下真空干热交联M小时；根据肝素与胶原质量比为1:10的比例，将肝素添加至摩尔 浓度比为2 :1的EDC (20_ol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的0. 05M MES (pH5. 4)溶液 中，再将上述冻干后的支架置于该混合液中交联M小时，经反复清洗后再次冷冻-冻干得 到交联后的肝素化的胶原-壳聚糖支架(微结构见图1)。
将肝素化的胶原-壳聚糖支架经环氧乙烷消毒后，滴加浓度为300 μ g/ml的 rhGM-CSF溶液ΙΟΟμ 1，4°C下孵育过夜，备用。
试验例手术前一天，将SD大鼠背部的鼠毛剪去，然后用脱毛剂脱毛；手术时，在SD大鼠的脊 柱两侧各做两个“囊”(见图2)，间隙1cm，然后将实施例1制备得到的负载rhGM-CSF的胶 原-壳聚糖复合型支架平展地植入，缝合。于术后7天、14天取材，大体观察及HE染色观察 复合支架在体内的生物学特征(见图3 图6)。大体观可见大量血管分布于植入的人工真皮 替代物再生材料的表面与周围；HE染色观察可见，植入的人工真皮替代物再生材料与周围 组织连接紧密，有丰富的血管在材料周围及其内部形成，周围组织并有向植入材料浸润生 长的趋势。

本发明涉及一种人工真皮替代物再生材料及其制备方法。负载rhGM-CSF的组织工程皮肤真皮替代物再生材料，该再生材料由肝素化的胶原-壳聚糖支架负载所述rhGM-CSF溶液构成。本发明还公开了上述的再生材料的一种制备方法。本发明为创伤、烧伤和慢性皮肤溃疡等全层皮肤缺损的治疗提供了一种性能良好的人工真皮替代物，可以显著加速人工真皮替代物再生材料的血管化进程、降低感染风险，促进创面的愈合，减少瘢痕的增生，进而减轻病人的痛苦。可以广泛应用于创伤、烧伤和外科整形等方面。本发明制备方法简单，材料来源广泛，生产效率高，适用于产业化生产。