专利名称：一种杂合抗菌肽毕赤酵母工程菌制备方法及应用的制作方法抗菌妝(antibacterialpeptides),又称抗微生物妝(peptide antibiotics),是生物体在抵抗病原微生物的防御反应过程中产生的一种具有抗微生物小分子多肽，广泛存在于植物、细菌、无脊椎动物及脊椎动物体内，是生物先天免疫的重要效应分子。自瑞典科学家Boman等人于1981年首次从古比天蚕(Hyalophora cecropin)中发现抗菌肽-天蚕素(CeCiOpin)A和B以来，目前已从昆虫、甲壳类、鸟类、两栖动物、哺乳动物体内成功分离出几百种抗菌肽。抗菌肽除了具有广谱的抗菌活性外，还具有抗原虫、抗真菌、抗病毒和抑制或杀伤肿瘤细胞等作用。抗菌肽有着与青霉素等传统抗生素完全不同的作用机制，病原菌不易产生对抗菌肽的耐药性，此外，抗菌肽一般情况下只作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，而对正常的真核细胞无影响。在畜牧业养殖生产及饲料中长期添加抗生素的做法受到严格检查和广泛质疑的背景之下，抗菌肽独特的杀菌机制和理化性质使其作为无毒无害无残留的抗微生物添加剂在饲料中有着广泛的应用前景。作为一种广谱、高效、无残留的新型抗微生物药物，抗菌肽应用于饲料中具有明显的优势:(1)动物抗菌肽具有热稳定性，可耐受饲料制粒时的高温而不导致动物抗菌肽失活；(2)动物抗菌肽具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力，添加在饲料中可经消化道完整吸收而发挥作用；(3)动物抗菌肽杀菌机理独特，病原菌不易对动物抗菌肽产生耐药性，并且无残留；(4)通过基因工程方法生产抗菌肽，可大规模生产，周期短，成本低且不易受外在因素的影响。蜂毒肽是意大利蜂(Apismellifera)毒液的主要活性成分，由20个氨基酸组成，一级结构为:GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2，蜂毒肽能够形成两亲性的α -螺旋结构，5个碱性氨基酸中的4个集中在肽链的C端(KRKR)，是典型的阳离子抗菌肽。牛乳铁蛋白肽Lfcin B是所有牛乳铁蛋白中活性最高的，抑菌效果是牛乳铁蛋白400倍，能在胃肠道中发挥更重要的作用。根据抗菌肽牛乳铁蛋白肽(Lfcin B)与富含甘氨酸的蜂毒肽(Melittin)的核心功能序列，将Lfcin B (1-25)和Magainin (12-26) 二者连接起来,设计一种新型杂合抗菌肽LFB-Mel，该抗菌肽分子N端形成亲水脂的两个反向β折叠结构，中间形成双亲性的α螺旋结构，C端的连续四个碱性氨基酸使得抗菌肽分子带有正电荷，能够与带负电荷的细胞膜结合，杂合抗菌肽摒弃了蜂毒肽的溶血活性，其抗菌活性和稳定性均优于单一抗菌肽分子。将该杂合抗菌肽基因转化毕赤酵母工程菌，进行高密度发酵和诱导表达，制成抗菌肽产品，该产品经猪养殖试验表明，能够完全代替抗生素在养殖业中的使用，具有抗病、促进生长、提高免疫力、降低料肉比和提高繁殖能力等功能，具有良好的产业化前景。
本发明的目的在于提供一种新的杂合抗菌肽LFB_Mel和编码该蛋白的基因LfcinB_Mel。本发明的另一个目的在于提供该抗菌肽制品的生产方法。本发明的进一步目的在于提供该抗菌肽在饲料添加剂中的应用。抗菌肽作为饲料添加剂在畜牧业生产中有其独特的优势，抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温，规模化发酵生产抗菌肽时经高温浓缩工序，可充分杀灭酵母菌体而不导致抗菌肽失活，产品在推广应用后不会出现工程菌的扩散而导致环境生态问题。以基因工程方法制备工程菌，并用工程菌产业化发酵生产抗菌肽，其生产周期短、生产成本低，且不受季节和气候变化等外在环境的影响，可大规模生产。抗菌肽产品具广谱抗菌作用，对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能，是很好的抗生素替代品，能有效地解决人和动物药残和病原菌耐药性的问题，属无毒副作用、无残留、无耐药性的一类环保型绿色饲料添加剂。
图1是分段引物PCR互补合成杂合抗菌肽基因Lfcin B_Mel流程图。图2是电泳检测PCR互补合成的杂合抗菌肽基因图。图3是质粒载体pPICZaA物理图谱。图4是杂合抗菌肽基因毕赤酵母重组菌株构建的流程图。

图5是SDS-PAGE检测杂合抗菌肽的诱导表达，I为Protein Marker，2为空载体转化毕赤酵母菌后诱导表达的对照，3为杂合抗菌肽毕赤酵母工程菌诱导表达检测。图6是诱导表达的发酵液对金黄色葡萄球菌和尿肠球菌的抗菌实验结果，图中:金黄色葡萄球菌:1表示氨苄青霉素的抗菌活性；2、3、4、5、6、7为毕赤酵母工程菌表达抗菌肽发酵液的抗菌活性；尿肠球菌(耐药菌):1表示氨苄青霉素的抗菌活性；2为H20的抗菌活性，3、4、5为毕赤酵母工程菌表达抗菌肽发酵液的抗菌活性。

GAAATCAAAGCTGG单基因的分段互补PCR合成第I阶段PCR反应(St印I):PCR反应体系


本发明涉及一种杂合抗菌肽LFB_Mel和编码该蛋白的基因Lfcin B_Mel，其DNA序列如序列表中1所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中2所示。本发明根据酵母偏爱密码子重新设计杂合抗菌肽基因Lfcin B_Mel，合成其DNA序列转化于毕赤酵母中表达，形成杂合抗菌肽基因的毕赤酵母工程菌。同时优化该菌发酵条件，达到高密度发酵和高效表达的效果。该工程菌发酵液对Gram+菌、Gram-菌及真菌等均有明显的抑制作用。将发酵液制成的产品应用于猪的饲料中，均有较好的饲养效果。该抗菌肽制品能够代替抗生素，能够预防消化道疾病、促进生长、增加体重，可以作为畜禽饲料添加剂。