专利名称：用于修复周围神经缺损的组织工程化周围神经及制备方法 临床治疗中常常遇到的长距离的周围神经缺损，由于神经缺乏弹性，大多数情况无法直接对拉吻合，自体神经移植仍然是临床上使用最广泛的方法。然而该方法存在难以克服的缺点，供体神经切取后，必然引起供区感觉障碍，且有可能发生创伤性神经瘤，引起局部疼痛，附加的神经切取术使手术时间延长，增加供区疤痕，而且神经粗细的变异使切取的神经未必适合匹配，还有可能造成运动神经与感觉神经的错向再生，加之供体神经来源有限也大大限制了自体神经移植术的应用。20世纪80年代，Lundborg等通过Y型硅胶管实验证实周围神经再生存在神经趋化性，为使用神经导管修复神经缺损奠定了理论基础。随着组织工程技术的发展，使用生物材料和种子细胞在体外构建组织工程化周围神经以取代自体神经移植已成为发展方向。应用组织工程技术构建组织工程化周围神经，研究的核心是模拟周围神经天然结构，将种子细胞与生物支架材料有机结合成为类似Büngner带的结构，为再生神经提供良好的生长环境，从而促进神经的再生。周围神经缺损的组织工程方法修复，可以克服自体神经移植的缺点，达到神经快速生长、功能完全恢复的理想目标。目前组织工程化周围神经依然处于动物实验阶段，制约其发展的主要因素是作为种子细胞的雪旺细胞所需数量非常巨大，然而雪旺细胞增殖缓慢，体外培养困难，常发生成纤维细胞的沾染。另外，研究表明，神经营养因子对保护神经元的存活、促进神经再生有重要作用。然而，直接使用神经营养因子只能在组织修复的早期起作用，在后期很难维持其作用的有效性；一方面是由于容易被体液稀释、吸收，使局部浓度难以达到有效浓度；另一方面若给于的剂量过大则会引起全身作用的危险，并由于体内的环境而失活，达不到所期望的生物效应，或者在短时间内就消耗殆尽。与本发明比较接近的现有技术专利文献2002年公开的日本清水庆彦的中国专利申请，该发明主要涉及一种人工神经管的制备，由生物可吸收的材料构成，表面被覆胶原，内腔具有微细纤维化胶原体，空隙内填充昆布氨酸。再有王身国的中国专利(申请号为00123465.X)，主要缺点是(1)忽略了种子细胞及神经营养因子在神经再生中起的核心作用，过分依赖材料对神经再生的促进作用，临床疗效不确定；(2)未涉及细胞和神经营养因子与生物材料的复合方式。
针对现有技术状况，本发明目的在于构建一种组织工程化周围神经，使用神经胶质细胞或可向神经胶质细胞分化的干细胞作为种子细胞，生物可降解材料作为支架，同时应用复合多种神经营养因子的控制释放系统，建立一个有利于神经再生的微环境，使神经得以再生，为临床治疗提供可行方案。本发明用于修复周围神经缺损的组织工程化周围神经，其特征在于组织工程化周围神经由神经导管和神经胶质细胞或干细胞构建而成；所述的神经导管由生物可降解材料构成；所述的神经胶质细胞或干细胞是自体或同种异体来源的神经胶质细胞或可向神经系统细胞分化的干细胞；其内包含有细胞或神经营养因子的控制释放系统以及胶原、层粘连蛋白(LN)、纤维粘连蛋白(FN)等细胞外基质。所述的生物可降解材料包括天然高分子材料如胶原、壳聚糖；和高分子合成材料如聚乳酸、聚羟基乙酸，以及它们的共聚物；所述干细胞包括雪旺细胞、胚胎干细胞和成体干细胞，如骨髓间充质干细胞，造血干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞，肝脏干细胞、神经干细胞。所述的神经导管，具有100μm-300μm微孔，孔隙率为50％-90％。所包含的细胞浓度为105-107/ml；所包含的神经营养因子指的是神经营养因子NGF、神经营养素-3NT-3、脑源性神经营养因子BDNF、睫状神经营养因子CNTF、胶质细胞源性神经营养因子GDNF、转化生长因子TGFβ家族、白血病抑制因子LIF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF和胰岛素样生长因子IGF中的一种或几种。所述的控制释放系统采用生物可降解材料对神经营养因子复合，并利用高分子对药物的选择透过性，实现对神经营养因子的控制释放，控制释放微球直径为100nm-100μm，降解时间约为30天-150天，可根据神经再生的速度及再生的距离进行调整；组织工程化周围神经中包含充满胶原、层粘连蛋白(LN)及纤维粘连蛋白(FN)等细胞外基质成分构成的凝胶。
本发明的神经导管具有一定的通透性，可以让细胞以及轴突再生过程中由于代谢而产生的大量废物扩散排放，阻止成纤维细胞大量入侵而阻碍神经生长的通道，防止局部神经营养因子的流失，利于附近循环系统的细小微血管长入导管。
本发明中的神经营养因子由控制释放系统来释放。在神经导管中加入营养因子主要作用是诱导干细胞向神经胶质细胞分化；维持神经元的存活，促进神经轴突的再生。然而，直接使用营养因子时常会由于体内的环境而失活，达不到所期望的生物效应，而且不能持续释放。我们使用细胞营养因子的控制释放系统，可以持续释放，保持细胞营养因子的浓度，使其持续发挥作用。控制释放系统采用生物可降解材料对神经营养因子复合，使细胞营养因子随着材料的降解而逐渐释放出来。此外，利用高分子对药物的选择透过性，可使神经营养因子以一定的速度在高分子保护层内溶解、扩散，然后进入机体以发挥其生物作用，因此可使神经营养因子的生物作用维持相当长的时间，从而实现对神经营养因子的控制释放。本发明中所使用的神经营养因子的控制释放微球直径为100nm-100μm之间，降解时间为30天-150天，可根据神经再生的速度及再生的距离进行调整。
本发明中的神经导管内充添的细胞外基质是基底膜的主要成分，可以对轴突再生的方向性起重要的引导作用。
本发明组织工程化周围神经同现有技术相比的优点在于，加入了神经再生过程中必须的神经胶质细胞和神经营养因子，并对神经营养因子实现控制释放，利于神经营养因子长时间的发挥作用，通过神经胶质细胞与神经营养因子的共同作用，可以起到保护神经元、促进神经轴突再生的作用；同时组织工程化周围神经中还包含胶原、LN、FN等细胞外基质，对轴突再生的方向性起重要的引导作用。
本发明用于修复周围神经缺损的组织工程化周围神经的制备方法包括神经导管的制备方法、神经营养因子控制释放微球的制备方法、组织工程化周围神经的构建方法，所述的神经导管的制备方法是按控制溶剂挥发法或溶盐法制备，其特征在于1)所述的神经营养因子控制释放微球的制备方法步骤如下将一种或几种神经营养因子、生物可降解材料溶于溶剂中(如二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸、盐酸等)，滴加到甘油中，搅拌分散均匀，倾入0.5％明胶水溶液中，分散乳滴，洗脱有机溶媒，生物材料沉积形成微球。离心收集，蒸馏水洗涤，滤过，常压干燥即得。
2)所述的组织工程化周围神经的构建方法包括如下步骤细胞外基质的溶液在冰浴下加入1/10体积的胎牛血清、10倍浓度的最低必需培养液DMEM，调节pH值至7.2-7.4，将种子细胞和复合多种细胞营养因子的微球，混匀后注满神经导管中，待其形成凝胶后，加入DMEM培养基培养。


图1本发明组织工程化周围神经结构示意图。
其中1神经断端，2神经导管，3神经营养因子NTF。导管内充填有细胞和神经营养因子NTF的控制释放系统以及胶原、层粘连蛋白及纤维粘连蛋白等细胞外基质。
图2本发明组织工程神经修复SD大鼠坐骨神经15mm缺损12周后，再生的神经已经通过缺损区的实验动物照片。

现将本发明结合具体实施例做进一步说明。
1雪旺细胞培养SD仔鼠10只，处死后酒精消毒，取双侧坐骨神经，置于冰浴操作台，去除神经外膜及粘连组织，加入胰酶/胶原酶混合消化后，收集上部细胞悬液，离心弃上清，加入培养液重新悬浮，接种于培养瓶中培养。24小时后培养液中加入10-5M阿糖胞-，作用48小时后更换为含100μg/ml的G-418培养液，连续培养5天。随后加入2μM氟丝扣林继续培养，每3天换液一次，至细胞汇合。
2神经导管的制备按照控制溶剂挥发法或溶盐法制备含100μm-300μm孔隙的神经导管，根据缺损长度决定神经导管长度，一般神经导管长度比神经缺损长度长5mm，以使神经两断端的套接。
3神经营养因子控制释放微球的制备微球的制备分二步进行，即有机相的分散和有机溶媒的洗脱。将一种或几种神经营养因子、生物可降解材料溶于溶剂中如二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸、盐酸等，滴加到甘油中，搅拌分散均匀，倾入0.5％明胶水溶液中，分散乳滴，洗脱有机溶媒，生物材料沉积形成微球。离心收集，蒸馏水洗涤滤过，常压干燥即得。用甘油作为分散介质，可以在500r/min的搅拌速度下获得粒径小于30μm的乳滴。洗脱液使用0.5％明胶水溶液，既有利于溶剂的扩散洗脱，又可防止乳滴合并或微球粘连。当微球降解时，神经营养因子逐渐释放出来，时间可持续30天-150天。
4组织工程化周围神经的构建细胞外基质的溶液在冰浴下加入1/10体积的胎牛血清、10倍浓度的DMEM培养基，调节pH值至7.2-7.4，将种子细胞和复合多种细胞营养因子的微球，混匀后注满神经导管中，待其形成凝胶后，加入DMEM培养基培养。
5用组织工程化周围神经修复SD大鼠坐骨神经缺损使用组织工程化周围神经桥接坐骨神经缺损，通过免疫组化、电生理、透射电镜、辣根过氧化物酶逆行示踪等方法检测神经再生及坐骨神经功能恢复情况。发现神经纤维排列整齐、数目多，神经纤维粗大，髓鞘厚，束间结缔组织少再生髓鞘内板层致密，髓鞘明显增厚，轴浆内富含神经微丝和微管，电生理可以检测到坐骨神经混合动作电位，坐骨神经功能指数显示坐骨神经功能已经大部分恢复(见图2)。


本发明属于医用生物材料技术领域，涉及一种组织工程化周围神经产品及制备方法，组织工程化周围神经产品由神经导管和神经胶质细胞或干细胞构建而成。制备方法包括神经导管的制备、神经营养因子控制释放微球的制备、组织工程化周围神经的构建，本发明优点在于具有神经胶质细胞和神经营养因子，可以保护神经原，促进神经轴突再生并对轴突再生的方向性起重要的引导作用。